低能量激光療法聯(lián)合Dycal用于大鼠磨牙直接蓋髓術(shù)的體內(nèi)研究

趙舉紅 仵楠 崔靈欣 張超杰 祖木熱提古麗·阿不來(lái)提 徐江

牙髓具有營(yíng)養(yǎng)、防御和修復(fù)功能，當(dāng)牙齒齲壞、外傷或醫(yī)源性損傷露髓時(shí)，易引發(fā)炎癥、疼痛，造成牙髓壞死，從而影響牙齒功能及壽命。因此活髓保存的研究倍受青睞。激光已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和口腔醫(yī)學(xué)的輔助治療中，它不僅增加細(xì)胞的三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生[1]，還具有抗炎、緩解疼痛、止血、加速傷口愈合和促進(jìn)損傷修復(fù)的功能[2-3]。低能量激光療法(low lever laser therapy,LLLT)也稱為光生物效應(yīng)，具有生物調(diào)節(jié)作用。

瞬時(shí)受體電位通道A1(transient receptor potential A1，TRPA1)為非選擇性陽(yáng)離子通道，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，參與細(xì)胞及個(gè)體的生理病理過(guò)程。氧化應(yīng)激[4]，炎癥和神經(jīng)損傷反應(yīng)等[5]。TRPA1對(duì)促血管生成和局部微環(huán)境的變化都很敏感[6]，在炎癥或組織損傷部位被大量發(fā)現(xiàn)。

本研究將評(píng)價(jià)LLLT聯(lián)合Dycal直接蓋髓術(shù)后牙髓炎癥反應(yīng)、修復(fù)性牙本質(zhì)形成及檢測(cè)牙髓內(nèi)TRPA1、IL-1β的表達(dá)情況，探討二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組

64 只8 周齡清潔級(jí)雄性健康大鼠，體重(200±10) g, 恒牙列完整，無(wú)齲齒、畸形及牙體牙周疾病，經(jīng)本院動(dòng)物倫理審批(批號(hào)： A2019-160-01)后將大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(NC)、低能量激光組(LLLT)、Dycal組(Dy組)和低能量激光+Dycal組(LLLT+Dy)4 組(n=16)，以左側(cè)上下頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙，術(shù)后第3、 7、 14、 28天每組各處死4 只取樣(8 顆實(shí)驗(yàn)牙)。

1.2 主要試劑與材料

Denlase半導(dǎo)體激光機(jī)(大恒新紀(jì)元科技股份有限公司)；Dycal(登士柏公司，美國(guó))；4%多聚甲醛、水合氯醛、EDTA、 復(fù)合消化液(武漢博士德生物工程有限公司)；TRPA1(ab62053，1∶150 )、IL-1β(ab9787,1∶200)(Abcam公司，英國(guó))；二抗、山羊血清、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立

仰臥位固定大鼠，水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，待起效后消毒沖洗口腔，用渦輪機(jī)鉆于左側(cè)上下第一磨牙中央制備窩洞，待透紅后用直徑0.5 mm探針輕穿髓，LLLT組用400 μm光纖的建立半導(dǎo)體激光(0.2 W, CW, 10 s)處理穿髓孔，Dy組用生理鹽水沖洗，無(wú)菌棉球拭干，輕置Dycal于穿髓孔，而LLLT+Dy先用LLLT組相同條件照射穿髓孔，再輕置Dycal無(wú),最后各組均用玻璃離子充填。實(shí)驗(yàn)牙調(diào)，此過(guò)程均有同一名口腔副主任醫(yī)師在無(wú)菌下完成。于術(shù)后第3、 7、 14、 28 天各組取標(biāo)本。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

經(jīng)SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)，各實(shí)驗(yàn)組牙髓炎癥反應(yīng)和牙本質(zhì)橋形成資料選擇Kruskal-WallisH非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，進(jìn)一步采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)兩兩間分析，P<0.016 7為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化資料服從正態(tài)分布且方差齊，運(yùn)用單因素單變量的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 牙髓組織及修復(fù)性牙本質(zhì)的形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 正常對(duì)照牙HE染色 正常對(duì)照牙HE染色可見牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)及正常牙髓組織，成牙本質(zhì)細(xì)胞排列整齊呈柵欄狀，牙髓組織內(nèi)無(wú)明顯擴(kuò)張的毛細(xì)血管和炎癥細(xì)胞(圖 1)。

圖 1 正常對(duì)照組牙髓組織學(xué)表現(xiàn)(HE， ×200)

2.1.2 牙髓炎癥及修復(fù)性牙本質(zhì)的情況 術(shù)后3 d：穿髓孔下方牙髓及成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，血管輕度擴(kuò)張，以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主急性炎癥反應(yīng)。術(shù)后7 d：穿髓孔處有部分牙本質(zhì)團(tuán)塊，無(wú)完整的修復(fù)性牙本質(zhì)形成，血管增生明顯，以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎癥反應(yīng)。術(shù)后14 d：穿髓孔下形成比較連續(xù)的修復(fù)性牙本質(zhì),其下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞排列較整齊,神經(jīng)纖維增多，炎癥反應(yīng)減弱，擴(kuò)張血管減少。術(shù)后28 d：幾乎無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙本質(zhì)形成增厚連續(xù)完整(圖 2)。

*: 開髓孔； D: 牙本質(zhì)； P: 牙髓； RD: 修復(fù)性牙本質(zhì)； Ⅰ: 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)； Ⅱ: 骨樣牙本質(zhì); Ⅲ: 擴(kuò)張的毛細(xì)血管

2.1.3 牙髓炎癥和修復(fù)性牙本質(zhì)的評(píng)價(jià)表 對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行評(píng)分、統(tǒng)計(jì)如表 1。經(jīng)多獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，各實(shí)驗(yàn)組的牙髓炎癥及修復(fù)性牙本質(zhì)形成在術(shù)后14、 28 d牙兩者均統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。LLLT組的炎反應(yīng)最重，LLLT+Dy組的炎癥反應(yīng)最輕，LLLT 組與LLLT+Dy組的炎癥反應(yīng)在術(shù)后14、28 d都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.016 7)(表 2)。術(shù)后14 d，LLLT+Dy 組修復(fù)性牙本質(zhì)形成的質(zhì)量及速度好于LLLT組及Dy組，LLLT+Dy組與LLLT組、Dy組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.016 7)(表 2)，術(shù)后28 d， LLLT+Dy組與LLLT組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.016 7)(表 2)。

表 1 各實(shí)驗(yàn)組牙髓炎癥及修復(fù)性牙本質(zhì)形成情況分級(jí)統(tǒng)計(jì)表(n=8)

表 2 第14、 28 天組間兩兩比較牙髓炎癥及修復(fù)性牙本質(zhì)形成統(tǒng)計(jì)表(n=8)

2.2 IL-1β、TRPA1在蓋髓術(shù)后牙髓中的表達(dá)

2.2.1 IL-1β及TRPA1在正常牙髓中的表達(dá) IL-1β

主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)呈弱陽(yáng)性；TRPA1主要表達(dá)在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞和少量神經(jīng)纖維表達(dá)呈弱陽(yáng)性，余細(xì)胞表達(dá)呈陰性(圖 3)。

2.2.2 IL-1β在各實(shí)驗(yàn)組牙髓中的表達(dá) 術(shù)后3 d:部分成牙本質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維表達(dá)呈陽(yáng)性。術(shù)后7 d:部分成纖維細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)呈陽(yáng)性，成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞增殖明顯。術(shù)后14 d:成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙本質(zhì)樣細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)纖維表達(dá)呈弱陽(yáng)性。術(shù)后28 d:各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)減弱接近正常對(duì)照組，少量成牙本質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)呈陽(yáng)性。少量成纖維細(xì)胞表達(dá)呈弱陽(yáng)性(圖 4)。

2.2.3 TRPA1在各實(shí)驗(yàn)組牙髓組織中的表達(dá) 術(shù)后3 d:成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)纖維表達(dá)呈陽(yáng)性，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、 肥大細(xì)胞表達(dá)呈弱陽(yáng)性。術(shù)后7 d:成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)纖維表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，成牙本質(zhì)樣細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表達(dá)呈陽(yáng)性。術(shù)后14 d:成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙本質(zhì)樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。術(shù)后28 d:各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)減弱接近正常對(duì)照組，少量成纖維細(xì)胞表達(dá)呈陽(yáng)性，少量成牙本質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及神經(jīng)纖維織表達(dá)呈弱陽(yáng)性(圖 4)。

圖 4 IL-1β、 TRPA1在不同實(shí)驗(yàn)組牙髓中的表達(dá)情況(IHC, ×400)

2.2.4 各組在蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)TRPA1表達(dá)陽(yáng)性染色的MOD值 第3、7、14、28 d中除了28 dLLLT+Dy和Dy組其他各實(shí)驗(yàn)組中均與正常對(duì)照組比TRPA1陽(yáng)性染色的MOD值存在顯著性差異(P<0.05)。7 d：Dy組>LLLT組>LLLT+Dy組的TRPA1陽(yáng)性MOD值； 14 d：LLLT組、Dy組>LLLT+Dy組的TRPA1陽(yáng)性MOD值，存在顯著性差異(P<0.05)； 28 d：LLLT組>Dy組、LLLT+Dy組TRPA1陽(yáng)性MOD值，存在顯著性差異(P<0.05)(表 3)。

表 3 4 組蓋髓術(shù)后IL-1β陽(yáng)性染色、TRPA1陽(yáng)性染色的平均吸光度A值

3 討 論

牙髓是由成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管和神經(jīng)等組成的疏松結(jié)締組織，被包繞在礦化的牙齒中，對(duì)牙齒的感覺和功能起著重要的作用[8]。若牙髓暴露或受損需行直接蓋髓術(shù)時(shí)，蓋髓材料是為了隔絕牙髓與外界有害刺激，提供牙髓修復(fù)的微環(huán)境。氫氧化鈣于1930 年被首次應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)。Dycal相對(duì)氫氧化鈣pH值較低，固化時(shí)間短， 密封性好， 是一種優(yōu)良的蓋髓劑。Er∶YAG激光提高了常規(guī)直接蓋髓(Dycal)的療效[9]。LLLT可降低IL-1β、ICAM-1等炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥滲出、充血和水腫。

牙髓炎癥及修復(fù)性牙本質(zhì)形成是蓋髓后評(píng)價(jià)療效的重要因素，在本研究LLLT組及LLLT+Dy組中LLLT照射穿髓孔，能量先被組織吸收，瞬間轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，可能會(huì)引起細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白質(zhì)釋放來(lái)減輕炎癥，促進(jìn)組織愈合?？梢娫谏w髓術(shù)后第3、7天牙髓炎癥LLLT組、Dy組比LLLT+Dy組反應(yīng)重，LLLT組和Dy組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在牙髓損傷修復(fù)的前期， LLLT和Dycal具有類似的抗炎蓋髓作用， 且二者聯(lián)合效果更好?？赡苁且?yàn)長(zhǎng)LLT可增強(qiáng)線粒體電子轉(zhuǎn)移和ATP產(chǎn)生，并刺激人中性粒細(xì)胞(PMN)的氧化爆發(fā)，提高殺滅細(xì)菌的能力[10]。第14、 28 天可見牙髓炎癥LLLT+Dy組比LLLT組反應(yīng)輕，具有顯著性差異。筆者推測(cè)在蓋髓修復(fù)后期，LLLT組牙髓炎癥反應(yīng)重及修復(fù)性牙本質(zhì)形成變慢均與LLLT組玻璃離子具有中重度細(xì)胞毒性，封閉性差，且與牙髓直接接觸有關(guān)。術(shù)后14 d LLLT+Dy組均比單獨(dú)蓋髓組形成修復(fù)性牙本質(zhì)效果好，這可能LLLT促進(jìn)牙髓細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖、分化和血管生成密切相關(guān)[11]。并且LLLT可增強(qiáng)h-BMMSCs源性成牙細(xì)胞樣細(xì)胞DMP1和ALP基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和基質(zhì)礦化[12]。GaAIAs 激光照射大鼠磨牙，誘導(dǎo)牙髓礦化促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成[13]。術(shù)后28 d時(shí)聯(lián)合組與Dy組在修復(fù)性牙本質(zhì)形成沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明LLLT具有時(shí)限性，與研究低功率He∶Ne激光在種植術(shù)后早期促進(jìn)種植體周圍成骨細(xì)胞增殖提高成骨活性結(jié)果一致[14]。

牙髓修復(fù)程序中有TNF-α、TGF-β、Runx2、DMP1、IL-β等一系列因子參與，而IL-1β是一種促炎因子，參與牙髓炎癥并發(fā)揮著關(guān)鍵因素。有研究發(fā)現(xiàn)有效降低hDPSCs分泌IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子起到良好的抗炎和促進(jìn)hDPSCs分化作用[15]。TRPA1是c-纖維釋放神經(jīng)肽的炎癥介質(zhì)和守門人，在組織損傷或受到機(jī)械、溫度、氧化應(yīng)激等因素刺激時(shí)，相應(yīng)部位釋放出的炎癥介質(zhì)不僅能夠激活 TRPA1 還可進(jìn)入局部受損組織產(chǎn)生神經(jīng)源性的炎癥反應(yīng)[16]?，F(xiàn)研究TRPA1可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化，礦化形成修復(fù)性牙本質(zhì)[17]。本研究在蓋髓術(shù)后IL-1β、TRPA1表達(dá)一致,術(shù)后第3、7 天各實(shí)驗(yàn)組中成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞中均有不同程度的IL-1β、TRPA1陽(yáng)性表達(dá)。LLLT 可抑制TNF-α、IL-1β和MMP-13的分泌，達(dá)到減輕炎癥疼痛的作用[18]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TRPA1在牙本質(zhì)敏感大鼠牙髓中表達(dá)上調(diào)，隨刺激強(qiáng)度而增加[19]。術(shù)后7 d時(shí)，兩因子陽(yáng)性表達(dá)的MOD值LLLT+Dy組、LLLT組、Dy組呈遞增趨勢(shì)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示了LLLT在牙髓修復(fù)程序中可能通過(guò)減少IL-1β、TRPA1表達(dá)來(lái)減輕炎癥。

本研究通過(guò)Dycal是否聯(lián)合LLLT進(jìn)行直接蓋髓后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組炎癥反應(yīng)輕，修復(fù)性牙本質(zhì)形成快,可能與LLLT減少IL-1β、TRPA1表達(dá)相關(guān)，加速牙髓再生，促進(jìn)骨礦化。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。