柱前衍生HPLC測定草銨膦含量研究

姚先燕，楊 斌

（廣安利爾化學有限公司，四川廣安 638500）

草銨膦屬磷酸類除草劑，施藥后短時間內植物體內銨代謝陷于紊亂，細胞毒劑銨離子在植物體內積累，與此同時，光合作用被嚴重抑制，達到除草目 的[1]。草銨膦是目前廣泛使用的有機磷類廣譜觸殺型除草劑，其具有內吸附作用不強、活性高、吸收好、低毒、環(huán)境兼容性好等特點，被稱為強極性農(nóng)藥[2-3]。草銨膦又名草銨膦銨鹽，化學名稱為2-氨基-4｛羥基（甲基）膦酰基｝丁酸銨，其結構中含有磷酸鹽、氨基、羥基、是極性強的兩性化合物，分子結構不存在共軛雙鍵，缺少發(fā)色和熒光基團特性，其分子量小，極性大易溶于水，不溶于有機溶劑。直接進行檢測時存在儀器干擾大的問題，目前報道的關于草銨膦分析方法較多，有高效液相色譜方法[4-5]、柱前衍生液相色譜法[6-9]、柱后衍生液相色譜法[10]、液相色譜質譜連用法[11-13]及離子色譜法[14-16]等。本文采用氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）作為衍生試劑，其介質與草銨膦的水溶性相匹配，反應過程簡單，F(xiàn)MOC-Cl在堿性環(huán)境下，F(xiàn)MOC-基團取代目標化合物氮原子上的氫原子，生成了在檢測儀器上具有強響應的衍生化合物FMOC-R（衍生化反應如圖1所示），利用高效液相色譜對衍生后的草銨膦進行檢測。從而能夠檢測微量以及痕量的草銨膦殘留量，滿足草銨膦樣品含量檢測要求。從而建立起一種快速、高效、準確、靈敏的測定草銨膦的分析方法。

圖1 草銨膦和FMOC-Cl反應方程式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260 infinity ‖、超聲波清洗器；試劑：乙腈、甲醇（均為色譜純）、草銨膦標樣、實驗室一級水、85%磷酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、硼酸（分析純）衍生試劑：2mg/mL FMOC-Cl（氯甲酸-9-芴基甲酯）乙腈溶液；硼酸溶液：0.4mol/L（24.72g硼酸+1 000mL水，溶解后用40%NaOH溶液調pH至8.5）；稀釋劑：衍生試劑+水=1+1（V+V）

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil Plus 5μm C18，150×4.6mm； 波長：206nm；柱溫：35℃；

流動相：乙腈+甲醇+1.8g/L磷酸水溶液=25+25+ 50（V+V+V）；流速：1.3mL/min；進樣量：5μm；保留時間：草銨膦約5.0min；

1.3 操作步驟

標樣溶液配制：準確稱取0.05g（精確至0.0001g）草銨膦標樣于50mL容量瓶中，用硼酸溶液溶解并定容，用移液管準確吸取5mL此溶液于50mL容量瓶，用稀釋劑稀釋并超聲反應1min后，定容至刻度線。

試樣溶液配制：準確稱取約含草銨膦0.05g（精確至0.0001g）試樣于50mL容量瓶中，用硼酸溶液溶解并定容，用移液管準確吸取5mL此溶液于50mL容量瓶，以后同標樣溶液制備。

1.4 測定

在1.2色譜操作條件下，待色譜儀穩(wěn)定后，先進數(shù)針標準溶液，直至相鄰兩針相對響應值變化不大于1.5%時，按標準溶液、樣品溶液、樣品溶液、標準溶液順序進樣。色譜圖見圖2

圖2 草銨膦標樣高效液相色譜圖1.草銨膦主峰；2.剩余衍生試劑水解峰（FMOC-OH）；3.衍生試劑與氨根反應峰（FMOC-NH4）

1.5 計算

將測得的2針樣品溶液以及前后2針標準溶液中草銨膦峰面積進行平均，試樣中草銨膦含量X（%）按下式計算：

式中：A1為標樣溶液中草銨膦峰面積的平均值；A2為試樣溶液中草銨膦峰面積的平均值；M2為試樣的質量，g；M1為標樣的質量，g；P為標樣中草銨膦的質量分數(shù)，%

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

檢測波長的選擇：通過二級管陣列檢測器對草銨膦標樣溶液進行光譜數(shù)據(jù)采集，得到了草銨膦從200~310nm的吸收光譜圖，如圖3所示，草銨膦206nm處有較好的吸收，故選擇206nm為檢測波長。

圖3 草銨膦紫外吸收光譜視圖

2.2 流動相的選擇

根據(jù)化合物和Fmoc衍生試劑的特點，首先考察了乙腈、甲醇和純水的比例，對草銨膦在C18柱上的保留時間及分離效果的影響。結果顯示：在此條件下，草銨膦出峰時間太早且雜質峰無法分離；后續(xù)在流動相中添加一定量的磷酸，改變純水的pH，隨著流動相中純水的pH逐漸降低，化合物與衍生試劑反應所產(chǎn)生的峰也逐漸分離，經(jīng)過試驗得出當純水溶液的pH為2.0，乙腈、甲醇、磷酸水溶液的比例為25+25+50（V+V+V），流速為1.3mL/min時，有效成分與雜質能夠得到很好的分離，并且也能有效地減少分析時間。

2.3 分析方法的線性相關性試驗

準確稱取草銨膦標樣0.05g（精確至0.0001g），置于50mL容量瓶中，用硼酸溶液溶解并定容至刻度線，吸取1mL、3mL、5mL、7mL、9mL此溶液于50mL容量瓶，按1.3操作步驟進行衍生。在上述色譜條件下進行分析，以草銨膦濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，草銨膦線性方程式為y=47.895x+66.7，相關系數(shù)r為0.9999。如圖4所示。

圖4 草銨膦線性關系圖

2.4 檢測線和定量限

以3倍噪音為檢測線，以10倍噪音為定量限。測得檢測限為0.067μg/mL，定量限為0.205μg/mL

2.5 分析方法的精密度試驗

分別對不同含量的三個樣品按1.3操作步驟進行5次平行測定，測定結果為樣品1標準偏差為0.03，變異系數(shù)為0.17%，樣品2標準偏差為0.02，變異系數(shù)為0.09%，樣品3標準偏差為0.02，變異系數(shù)為 0.02%.如表1所示。

表1 精密度測定結果

2.6 分析方法的準確度試驗

在已知含量的三個樣品中分別加入一定量的標準樣品，在上述色譜條件下進行分析，測定得出樣品1的平均回收率為99.93%，樣品2的平均回收率為99.61%，樣品3平均回收率為99.39%。如表2所示。

表2 分析方法的準確度試驗結果

2.7 衍生溶液的穩(wěn)定性試驗

將處理好的衍生溶液在室溫下放置不同時間，在1.2色譜條件下測定峰面積變化，如表3所示。

時間 0h 4h 8h 12h 24h峰面積 5 338.008 5 338.834 5 336.113 5 337.676 5 337.132

表3 放置時間對草銨膦衍生溶液的影響

從表3看出，草銨膦衍生溶液的峰面積變化波動＜1%，表明衍生物至少在24h內穩(wěn)定

2.8 衍生時間的選擇

衍生試劑與草銨膦反應的充分程度不僅影響色譜分析的重現(xiàn)性，而且影響衍生產(chǎn)物的檢測限，為保證衍生反應完全，考察了不同衍生反應時間對峰面積的影響，如表4所示。

表4 衍生時間對草銨膦衍生產(chǎn)物的影響

從表4看出，草銨膦衍生產(chǎn)物的峰面積變化波動＜1%，據(jù)此認為在1min的反應時間內草銨膦已完成與衍生試劑的反應。因此，本方法最終選擇的反應時間為1min。

3 結束語

本方法適用于各種草銨膦微量以及痕量的樣品檢測，具有較好的準確度和精密度，線性關系良好；能使有效成分與雜質能夠得到很好的分離，并且也能有效地減少分析時間；衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，允許24h上機分析；衍生反應時間快，在1min內衍生試劑便能完全反應。