嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病的防治效果及對水稻內(nèi)源激素的影響

沙月霞，黃澤陽，馬瑞

寧夏農(nóng)林科學院植物保護研究所，銀川 750011

0 引言

【研究意義】稻瘟病（rice blast）是水稻生產(chǎn)上的重要病害，其病原菌有性態(tài)為子囊菌門間座殼屬灰色大角間座殼 Magnaporthe oryzae（無性態(tài)為梨孢屬灰梨孢Pyricularia oryzae）[1]。稻瘟病廣泛分布于世界各水稻種植地區(qū)，其造成的年均產(chǎn)量損失約 20%—30%，流行年份約50%以上，重病田甚至顆粒無收[2]。當前，水稻生產(chǎn)上最主要的措施是種植抗病品種和化學農(nóng)藥防治；但由于品種選育周期較長、稻瘟病菌生理小種易變異，品種抗性易喪失；長期大量的化學農(nóng)藥殘留影響生態(tài)環(huán)境和人類健康，而且導致病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，研發(fā)安全、有效、綠色的新型生防菌劑對稻瘟病的綜合治理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】假單胞菌（Pseudomonas spp.）具有來源廣泛、與環(huán)境相容性好、產(chǎn)生多種具有廣譜抑菌活性的抗菌物質(zhì)[3-4]、誘導植株抗病性[5]等特點，一直是植物病害生物防治的研究熱點之一。已有的研究報道表明，對稻瘟病菌具有較強拮抗作用的假單胞菌種類包括熒光假單胞菌（P.fluorescens）[6-7]、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）[8-9]、惡臭假單胞菌（P.putida）[10]、類產(chǎn)堿假單胞菌（P.pseudoalcaligenes）[11]和綠針假單胞菌（P.chloroaphis）EA105[12]。關于假單胞菌防治稻瘟病的研究國內(nèi)外報道較多，主要集中于拮抗作用和防御酶的誘導，對嗜堿假單胞菌（P.alcaliphila）預防稻瘟病的田間應用研究尚處于探索階段。NG等[8]分離的銅綠假單胞菌UPMP1對稻瘟病菌的抑制率為40.65%，能增強水稻幼苗的過氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸裂解酶活性。植物內(nèi)生菌由于防病殺蟲的生物學活性顯著[13-14]兼具促生增產(chǎn)效果[15-16]、提高植株抵抗逆境能力[17-18]、協(xié)助寄主吸收營養(yǎng)元素[19-20]、降解重金屬和農(nóng)藥污染[21]等特點，廣泛用于生物源制劑的研制[22-23]。JHA等[11]研究表明，類產(chǎn)堿假單胞菌GJ17分離于水稻根系組織，對稻瘟病的防治效果高于根際促生菌?！颈狙芯壳腥朦c】嗜堿假單胞菌菌株Ej2為筆者課題組從寧夏回族自治區(qū)水稻葉片內(nèi)生菌中獲得，其對稻瘟病菌、鐮孢菌（Fusarium spp.）等植物病原菌的抑菌活性以及田間應用效果亟需深入研究。【擬解決的關鍵問題】評價嗜堿假單胞菌菌株Ej2防治稻瘟病的效果及對鐮孢菌等病原菌的抑菌效果，探明其發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)及植株生長的促進效果、對水稻植株脅迫激素及生長激素的影響，為開展稻瘟病、西瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病等真菌病害的田間防治打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗田概況

田間試驗于 2020年在寧夏回族自治區(qū)靈武市梧桐樹鄉(xiāng)（106.18°E，37.59°N）和吳忠市金雞鎮(zhèn)（106.14°E，37.94°N）水稻主栽地區(qū)進行，屬于旱直播種植區(qū)，稻瘟病常年發(fā)生，行距為30 cm，試驗期間正常噴施殺蟲劑和水肥管理，不噴施其他殺菌劑。土壤類型是灌淤土，弱堿性（pH 7.8—8.7），有機質(zhì)17.63 g·kg-1，全氮 1.03 g·kg-1，有效磷 34.19 mg·kg-1，速效鉀153.42 mg·kg-1，平均海拔1 133 m，氣壓88 kPa。供試水稻品種為G19、秋優(yōu)88和粳谷8號，均為寧夏水稻種植地區(qū)主栽品種。

1.2 生防菌、病原菌及其培養(yǎng)

供試生防菌嗜堿假單胞菌Ej2分離自水稻葉片。供試稻瘟病菌 P131由中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供；茄鐮孢（F.solani）N18-1-2和串珠鐮孢（F.moniliforme）N19-2-2由本實驗室分離；西瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.niveum）M8、草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeospoioides）ZDP21、鏈格孢蘋果?；停ˋlternaria alternata f.sp.mali）BJ-A5和草莓黑斑病菌（A.alternata）BJ-ST24由北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所分離。

供試生防菌在金氏King’s B（KB）固體培養(yǎng)基平板上30℃暗培養(yǎng)2 d，供試病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上暗培養(yǎng)7—9 d。

1.3 嗜堿假單胞菌Ej2對病原菌的拮抗作用

將直徑1 cm的稻瘟病菌P131菌餅放置在PDA平板中央，28℃暗培養(yǎng)2 d后，測量菌落半徑。然后在菌落邊緣兩側(cè)相距 2 cm的位置接種嗜堿假單胞菌Ej2，劃線長度為2 cm，未劃線菌株Ej2的平板作為空白對照，所有平板在28℃黑暗培養(yǎng)，5 d后測量不同處理組的病原菌菌落半徑和抑菌帶。通過菌絲生長速率法測定抑菌效果，計算相對菌絲抑制率。

將直徑1 cm的稻瘟病菌P131菌餅放置在PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，相同大小的KB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿均勻涂布嗜堿假單胞菌 Ej2，前一個培養(yǎng)皿反扣在后一個培養(yǎng)皿上面，兩個皿接觸位置用封口膜密封嚴實；未涂布菌株Ej2的處理作為空白對照，每組處理5皿重復。所有培養(yǎng)皿28℃暗培養(yǎng)9 d后，測量兩組處理的稻瘟病菌菌落直徑，計算嗜堿假單胞菌Ej2產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對稻瘟病菌的抑制率。

將直徑1 cm的鐮孢菌等5種植物病原菌的菌餅放置在PDA平板中央，在菌餅兩側(cè)距離2 cm的位置接種嗜堿假單胞菌Ej2，劃線長度為2 cm，未劃線菌株Ej2的平板作為空白對照，所有平板于25℃暗培養(yǎng)，5 d后測量病原菌菌落直徑和抑菌帶，計算抑制率。

1.4 嗜堿假單胞菌 Ej2對稻瘟病的防治作用及對水稻促生效果評價

挑選健康水稻種子 G19，10%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗3次。然后分別在嗜堿假單胞菌Ej2發(fā)酵液和無菌水中浸泡0.5 h，之后在28℃、相對濕度70%的人工氣候箱培養(yǎng)（光照12 h/黑暗12 h），48 h后調(diào)查種子露白數(shù)量，計算對種子萌發(fā)的促進效果。每個培養(yǎng)皿里100粒水稻種子，每個處理3皿重復。

溫室種植水稻，試驗設計3組處理：嗜堿假單胞菌 Ej2發(fā)酵液；無菌水；75%三環(huán)唑可濕性粉劑（陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技（中國）有限公司）。每個處理設計4個重復，每個重復約90株水稻苗。種植20 d的時候噴施菌劑或無菌水，嗜堿假單胞菌Ej2發(fā)酵液菌體濃度約1×108CFU/mL（OD600=1.0—1.2），每個處理噴施50 mL。噴施24 h 后，所有試驗水稻植株噴施稻瘟病菌孢子懸浮液20 mL，孢子濃度約1×106CFU/mL，7 d后調(diào)查葉瘟的發(fā)病狀況。

田間試驗地點在靈武市梧桐樹鄉(xiāng)和吳忠市金雞鎮(zhèn)，試驗設計4組處理：CK為清水對照；嗜堿假單胞菌Ej2發(fā)酵液（1×108CFU/mL）；20%稻瘟酰胺懸浮劑，制劑用量為600—750 g·hm-2；芽孢桿菌菌劑（解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）S170和貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）E69的混合液，本實驗室分離獲得的稻瘟病生防菌），藥液量7.50 L·hm-2（有效活菌數(shù)≥1×109CFU/mL）。每組處理設計4個重復大區(qū)，隨機排列，每個大區(qū)試驗面積約600 m2。分別在水稻旱直播種植100 d（分蘗期）、120 d（孕穗期）和140 d（破口期）葉面噴施。旱直播種植110 d（分蘗盛期）調(diào)查葉瘟的危害，直播后160 d（成熟期）調(diào)查穗頸瘟的危害，調(diào)查分級標準采用中華人民共和國國家標準（GB/T15970—1995）。水稻收獲期采集稻穗，每組處理采集4個小區(qū)，每個小區(qū)1 m2，測量株高、穗長、穗重和千粒重，評價促生效果。

1.5 嗜堿假單胞菌Ej2對水稻內(nèi)源激素的影響

1.5.1 樣本采集 嗜堿假單胞菌Ej2施藥時間、次數(shù)與田間試驗相同，于收獲期采集水稻植株，取中部莖稈，剪成1 cm，無菌水沖洗3次，裝入2 mL離心管中，每個離心管0.5 g樣本，每個處理7個重復，液氮冷凍后采用干冰郵寄至中科新生命科技有限公司。

1.5.2 待測樣本前處理 待測樣本采用液氮研磨，然后（80±5）mg樣本中加入50 μL內(nèi)標溶液和1 mL乙腈水溶液（1% FA），振蕩2 min混合均勻；4℃黑暗條件下抽提12 h，14 000×g離心10 min，取800 μL上清液用氮氣吹干，加入200 μL乙腈水溶液（1∶1，v/v），混合均勻后，再次14 000×g離心10 min，去上清液進行色譜-質(zhì)譜分析。

1.6 色譜-質(zhì)譜分析

1.6.1 高效液相色譜條件 代謝上清液分離采用超高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent 1290 Infinity LC）。流動相組成包括A相（乙腈水溶液，1% FA）和B相（乙腈）。液相系統(tǒng)條件：柱溫40℃，流速為 0.4 mL·min-1，進樣量為 5 μL。液相梯度條件：0—20 min，B相從0—90%；20—25 min，B相保持90%；25—27 min，B相從90%—0；27—30 min，B相保持在0。

1.6.2 質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析條件：Thermo Scientific TSQ Quantiva，屏蔽氣流，30 Arb；輔助氣體流，10 Arb；尾氣流，8 Arb；碰撞氣體，1.5 m Torr；離子連接管溫度，350℃；汽化器溫度，300℃；噴霧電壓，3.0 kV。MRM模式下測試陰陽離子對。

1.7 數(shù)據(jù)處理

供試生防菌對病原菌的拮抗作用、對水稻生長及稻瘟病預防效果的調(diào)查數(shù)據(jù)在Excel 2016中處理，顯著性分析采用DPS15.0統(tǒng)計軟件，方差分析選用單因素分析中的最小顯著差數(shù)法（LSD）計算（P＜0.05）。

計算公式：相對菌絲抑制率（%）=[（空白對照菌絲生長量-處理組菌絲生長量）/ 空白對照菌絲生長量]×100；病情指數(shù)＝[∑各級病葉（穗）數(shù)×相對級數(shù)值]/[調(diào)查總?cè)~（穗）數(shù)×9]×100；防治效果（%）＝[（CK病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/CK病情指數(shù)]×100。

供試生防菌對水稻內(nèi)源激素影響的數(shù)據(jù)采用Thermo Scientific Xcalibur 2.1軟件進行分析，依據(jù)植物激素標準曲線中的激素含量計算植物內(nèi)源激素含量。

2 結果

2.1 嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病菌的拮抗作用

嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病菌具有顯著的拮抗作用，能夠明顯的抑制菌絲生長，相對菌絲抑制率達到78.57%，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對稻瘟病菌的菌絲生長抑制效果也較為明顯（圖1）。

圖1 嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病菌菌絲生長的抑制效果Fig.1 The hypha growth rate of M.oryzae P131 inhibited by P.alcaliphila Ej2

2.2 嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病的防治效果

嗜堿假單胞菌Ej2在溫室盆栽條件下對稻瘟病的防治效果較為明顯（表 1），對葉瘟的防治效果達到78.26%，與75%三環(huán)唑可濕性粉劑的防治效果無顯著差異（P＞0.05）。

表1 嗜堿假單胞菌Ej2在溫室條件下對稻瘟病的防治效果Table 1 The control efficacy of P.alcaliphila Ej2 against rice blast under greenhouse condition

靈武市的田間防治效果試驗表明，嗜堿假單胞菌Ej2菌劑對葉瘟的田間防治效果為75.07%，與芽孢桿菌菌劑的田間防治效果 78.04%無顯著差異（P＞0.05），與稻瘟酰胺的田間防治效果64.05%有顯著差異（P＜0.05）；嗜堿假單胞菌Ej2菌劑對穗頸瘟的田間防治效果為75.09%，與稻瘟酰胺（74.60%）、芽孢桿菌菌劑（72.76%）的田間防治效果均無顯著差異（P＞0.05）（表2）。

表2 嗜堿假單胞菌Ej2防治稻瘟病的田間效果（靈武市）Table 2 The control efficacy of P.alcaliphila Ej2 against rice blast in the field (in Lingwu City)

吳忠市的田間防治效果試驗表明，嗜堿假單胞菌Ej2菌劑對葉瘟的田間防治效果為83.67%，與芽孢桿菌菌劑（82.88%）、稻瘟酰胺（81.28%）的田間防治效果均無顯著差異（P＞0.05）；嗜堿假單胞菌Ej2菌劑對穗頸瘟的田間防治效果為62.79%，與芽孢桿菌菌劑的田間防治效果 65.46%無顯著差異（P＞0.05），與稻瘟酰胺田間防治效果 58.87%有較明顯差異（表3）。

表3 嗜堿假單胞菌Ej2防治稻瘟病的田間效果（吳忠市）Table 3 The control efficacy of P.alcaliphila Ej2 against rice blast in the field (in Wuzhong City)

2.3 嗜堿假單胞菌 Ej2對鐮孢菌等病原菌的拮抗作用

嗜堿假單胞菌Ej2對鐮孢菌等多種植物病原菌具有拮抗作用（表 4），對草莓炭疽病菌、鏈格孢蘋果?；秃臀鞴峡菸【囊志Ч橛?0%—60%，對串珠鐮孢和茄鐮孢的抑菌效果在41%—50%，對草莓黑斑病菌的抑菌效果＜20%。這表明菌株 Ej2具有對稻瘟病、土傳病害、草莓炭疽病、蘋果斑點落葉病等真菌病害的應用潛力。

表4 嗜堿假單胞菌Ej2對多種植物病原菌的拮抗作用Table 4 The antagonist activity of P.alcaliphila Ej2 against various plant pathogens in vitro

2.4 嗜堿假單胞菌Ej2對水稻的促生效果評價

嗜堿假單胞菌Ej2能夠顯著提高種子萌發(fā)率，浸種后的水稻種子萌發(fā)率提高了41.67%。嗜堿假單胞菌Ej2對水稻生長具有明顯的促生效果（表5）。噴施3次嗜堿假單胞菌Ej2發(fā)酵液會增加水稻株高、穗重和千粒重；對株高和穗重的促進效果與芽孢桿菌菌劑無顯著差異（P＞0.05），與稻瘟酰胺具有顯著差異（P＜0.05）；對穗長的促進效果與芽孢桿菌菌劑、稻瘟酰胺處理之間無顯著差異（P＞0.05）；對千粒重的促進效果與稻瘟酰胺無顯著差異（P＞0.05），但與芽孢桿菌菌劑有較明顯的差異。

表5 嗜堿假單胞菌Ej2對水稻生長的促生效果Table 5 Effect of P.alcaliphila Ej2 on promoting the growth of rice plant

2.5 嗜堿假單胞菌Ej2對植物內(nèi)源激素的影響

嗜堿假單胞菌Ej2發(fā)酵液噴施3次后，水稻植株中的內(nèi)源激素水平發(fā)生變化（表 6）。乙烯和脫落酸含量顯著增加；玉米素核苷、反式玉米素核苷和異戊烯基腺嘌呤核苷激素含量顯著下降；植物生長素、茉莉酸、順反茉莉酸類激素、茉莉酸-異亮氨酸、順式玉米素、反式玉米素、異戊烯基腺嘌呤、水楊酸等激素含量無顯著變化。

表6 嗜堿假單胞菌Ej2對水稻內(nèi)源激素的影響Table 6 Effect of P.alcaliphila Ej2 on the endogenous hormones in rice plant

3 討論

3.1 嗜堿假單胞菌 Ej2對稻瘟病具有較明顯的防治作用并對水稻具有促生效果

假單胞菌防治病害的機制主要包括拮抗作用、營養(yǎng)與生態(tài)位點的競爭、有效的根際定殖以及誘導植物系統(tǒng)抗病性[5,10]。假單胞菌具有較明顯的防病、促生效果，與環(huán)境兼容性好，通常被研制成商品化的生防菌劑[24-25]。但是假單胞菌在生防技術領域應用的菌株種類較少，篩選新的生防資源一直是植物病害生物防治研究的熱點之一。

目前，熒光假單胞菌在稻瘟病防治中應用較廣，國內(nèi)外學者關于嗜堿假單胞菌的研究主要集中于脫氮特性及機理研究，國內(nèi)還未有學者研究過該菌株對稻瘟病菌的拮抗作用，本文研究結果證實了嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病的防治效果及對水稻的促生效果均較為明顯，為稻瘟病新型殺菌劑的研發(fā)提供了生防種質(zhì)資源，也拓展了嗜堿假單胞菌的應用領域。已有的研究表明，植物內(nèi)生菌受環(huán)境因素影響較小，生防效果一般較穩(wěn)定[13,16]。嗜堿假單胞菌Ej2來源于水稻葉片，研究結果驗證了其作為植物內(nèi)生菌的田間應用效果，具有預防多種真菌病害的應用潛力。

嗜堿假單胞菌Ej2對稻瘟病菌菌落生長具有明顯的拮抗作用，產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對菌落生長的抑菌效果達到了 57.78%，研究結果表明揮發(fā)性物質(zhì)是菌株Ej2的抗菌活性物質(zhì)之一。篩選和利用具有多種拮抗機制的假單胞菌作為生防菌劑一直是植物病害生物防治的途徑之一[26]。從胡椒根部組織中篩選的惡臭假單胞菌 BP25產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)對稻瘟病菌菌落生長的抑制率分別達到 71.30%和 37.90%，在水稻幼苗根部具有較強的定殖能力，并增強植株抗病相關防御酶活性[10]。熒光假單胞菌pfr1對稻瘟病菌菌絲抑制率達到76.30%，促生和增產(chǎn)效果顯著[25]。本文研究證實了嗜堿假單胞菌Ej2具有廣譜抗菌活性，能夠有效防治稻瘟病，為應用于稻瘟病的防治提供了科學依據(jù)。田間大區(qū)試驗進一步證實，Ej2可以提高種子萌發(fā)并促進植株生長，顯示了該菌株具有良好的田間應用價值。菌株Ej2防治草莓炭疽病和西瓜枯萎病等真菌病害的應用效果需要進一步深入驗證，但平板拮抗的研究結果表明，該菌株可能具有防治草莓炭疽病和西瓜枯萎病等病害的生防潛力。

3.2 嗜堿假單胞菌Ej2可以調(diào)控水稻內(nèi)源激素表達

植物內(nèi)源激素對于植株的生長發(fā)育至關重要[27-28]，其不僅參與生長發(fā)育過程[29-30]，而且調(diào)控植株應對生物和非生物等環(huán)境脅迫[31-33]。在逆境脅迫下，脫落酸、生長素、水楊酸、茉莉酸、細胞分裂素等植物內(nèi)源激素往往發(fā)生變化，部分激素自身合成的能力會受到抑制[34-35]。脫落酸、水楊酸、茉莉酸是常見的脅迫激素，其中脫落酸在逆境脅迫下含量會增加，氣孔開閉被調(diào)節(jié)以減少植株內(nèi)的水蒸騰量[36-37]。本研究檢測了嗜堿假單胞菌Ej2發(fā)酵液噴施3次后水稻植株中的激素含量變化，結果表明噴施Ej2顯著增加了脫落酸和乙烯的含量，降低了玉米素核苷、反式玉米素核苷和異戊烯基腺嘌呤核苷激素含量。植物脅迫激素含量與植株抗逆性密切相關，隨著脫落酸和乙烯的含量增加，植株抗逆性也提高。研究結果間接說明Ej2發(fā)酵液噴施3次能夠提高水稻植株抗逆性。玉米素核苷、反式玉米素核苷和異戊烯基腺嘌呤核苷等細胞分裂素負調(diào)控植物根與莖的生長，本研究中3種激素含量下降，說明Ej2噴施3次后能促進水稻根系和莖的生長?；贛RM方法的靶向代謝組學技術具有高靈敏度、高分辨率、高準確性等優(yōu)點，被廣泛用于植物激素的定量檢測。本研究結果表明，可以采用MRM方法的靶向代謝組學技術研究嗜堿假單胞菌對植物生長激素的影響。

4 結論

嗜堿假單胞菌 Ej2對稻瘟病具有較好的防治作用，對多種植物病原真菌兼具抑菌活性，可以明顯促進水稻種子萌發(fā)和植株生長，在水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有推廣應用潛力。菌株Ej2發(fā)酵液連續(xù)噴施3次后，能夠顯著增加植株內(nèi)的脅迫激素脫落酸和乙烯水平，降低玉米素核苷、反式玉米素核苷和異戊烯基腺嘌呤核苷水平。因此，嗜堿假單胞菌Ej2是一種潛在的、有效的生防菌株，兼具防治稻瘟病、炭疽病、蘋果斑點落葉病、草莓黑斑病和鐮孢菌引起的土傳病害的潛力。