兩種磷素水平下小麥苗期對(duì)干旱脅迫的離子組和代謝組響應(yīng)

李剛，白陽(yáng)，賈子穎，馬正陽(yáng)，張祥池，李春艷，李誠(chéng)

石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000

0 引言

【研究意義】小麥（Triticum aestivum L.）是主要的糧食作物，世界上約70%的小麥種植于干旱或半干旱區(qū)[1]。干旱造成的作物產(chǎn)量降低可能超過(guò)其他不利因素所導(dǎo)致的產(chǎn)量減少的總和。因此，在旱作農(nóng)業(yè)中，植物營(yíng)養(yǎng)最主要的目的是解決在水分脅迫條件下怎樣合理使用肥料，提高作物對(duì)水分的利用率[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】磷是小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一。磷營(yíng)養(yǎng)和水分脅迫有顯著的交互作用且影響結(jié)果不一致。龐春花等[4]認(rèn)為在相同施磷水平下，作物的最大根長(zhǎng)與根系總長(zhǎng)在中度干旱可達(dá)到最大值，在低磷水平下，根系表面積在中度干旱大于正常灌水，表明低磷條件下，中度干旱有利于根系表面積的增大，以此吸收更多的水分及養(yǎng)分。張歲岐等[5]則認(rèn)為，在土壤干旱條件下，適量施用磷肥可以顯著改善植株水分狀況，提高植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性，保持植株生長(zhǎng)以及生理過(guò)程的正常進(jìn)行。因此，不同磷肥水平施用對(duì)植物水分脅迫響應(yīng)的影響亟需進(jìn)行相關(guān)研究。根系是小麥吸收水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的主要器官，又是物質(zhì)合成和轉(zhuǎn)化的器官，因此根系的生長(zhǎng)發(fā)育狀況和活力直接影響小麥地上部分的生長(zhǎng)[6]。研究表明，在缺磷環(huán)境中，根系對(duì)磷素的吸收能力往往是通過(guò)對(duì)根系的適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)體現(xiàn)的[7]。磷在土壤中的擴(kuò)散距離只有 1—2 mm，對(duì)于缺磷土壤擴(kuò)散更加緩慢，而大部分作物僅可吸收距根表面1—4 mm的磷素，并且磷素在土壤中的擴(kuò)散系數(shù)很低，當(dāng)作物在高磷條件下可抵消根系對(duì)磷吸收的差異，當(dāng)作物缺磷時(shí)，作物根系發(fā)育增強(qiáng)，增大吸收面積，以尋求更多磷素供作物正常生長(zhǎng)[8-9]。同時(shí)也有研究表明，施磷可促進(jìn)小麥次生根根毛的生長(zhǎng)及根系直徑增大，適當(dāng)降低土壤水分并提高磷素含量有助于根系形態(tài)的發(fā)展[6]。李萬(wàn)春[10]對(duì)冬小麥水氮磷耦合的研究表明，干旱脅迫可以提高小麥的根系活力，從而提高小麥的水分調(diào)節(jié)特性。張歲岐等[5]研究表明，磷素對(duì)作物的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，一定程度上可以補(bǔ)償干旱帶來(lái)的不利影響。研究表明，細(xì)胞程序性死亡是研究作物抗性及其機(jī)理的重要手段[11]，當(dāng)作物遭到逆境脅迫時(shí)會(huì)加速細(xì)胞的衰亡，加劇細(xì)胞程序性死亡進(jìn)程，細(xì)胞基因組 DNA降解，出現(xiàn)片段化[12]。近年來(lái)，代謝組學(xué)正迅速成為基因功能注釋的關(guān)鍵工具，有助于全面理解細(xì)胞對(duì)生物條件變化的反應(yīng)。在小麥中，已有研究分析了代謝物對(duì)鹽脅迫[13]、溫度[14]和干旱脅迫[15]的響應(yīng)。作物對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)涉及的代謝途徑包括光合作用、糖代謝、三羧酸循環(huán)、糖酵解及激素合成等[16-18]。代謝溶質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、果糖和蔗糖，有助于抗旱性的提高[19-21]。然而，有關(guān)磷和干旱脅迫相關(guān)的代謝組分的研究報(bào)道較少。干旱脅迫對(duì)植物代謝有諸多影響，如生長(zhǎng)抑制、含水量降低、光合作用和呼吸速率降低、各種酶活性變化、生物大分子損傷、蛋白質(zhì)降解、大量細(xì)胞內(nèi)容物外滲等[22]。而所有這些過(guò)程都與金屬離子密切相關(guān)[23]，例如，Cu參與植物光合作用、電子傳遞、蛋白質(zhì)合成等代謝活動(dòng)并且是作物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素[24]，Mg參與植物酶活化、光合作用、N代謝、活性氧代謝等[25]，Na+/K+含量的多少將會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)離子區(qū)隔化，影響細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)離子平衡，最后干擾酶促反應(yīng)，使代謝紊亂[26]。并且該部分礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素是細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)重要的組成成分，參與調(diào)節(jié)部分酶的活動(dòng)，并起到電化學(xué)作用。植物體內(nèi)的離子平衡對(duì)維持作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用，而離子平衡失調(diào)會(huì)阻礙植物的正常生長(zhǎng)。因此，研究金屬離子在干旱條件下的吸收、運(yùn)輸和分布，對(duì)于研究植物的干旱損傷機(jī)理以及金屬離子在干旱損傷中的作用，提高作物的抗逆性具有重要意義。K可使得小麥的氣孔密度增加，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度減小，寬度增加，提高小麥的水分利用效率，因此K在干旱脅迫下對(duì)水肥的高效利用有重要意義[27]。正常水分條件下生長(zhǎng)的小麥幼苗葉綠體中含有少量的Ca2+，隨著水分脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠體中游離Ca2+含量逐漸增加，葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷加劇。復(fù)水后，葉綠體中游離Ca2+含量逐漸降低，葉綠體結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常[15,28]。然而，關(guān)于冬小麥在磷和干旱復(fù)合脅迫下離子變化的研究卻很少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆小麥生產(chǎn)面臨干旱脅迫和土壤磷素缺乏的問(wèn)題，大量施用磷肥已成為緩解土壤磷素脅迫、實(shí)現(xiàn)小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要措施之一。雖然，不同磷素供應(yīng)下小麥應(yīng)對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性機(jī)制已有相關(guān)報(bào)道，但從組學(xué)的角度全面解析的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選用新疆冬小麥主栽品種新冬23號(hào)為參試材料，解析兩種磷素供應(yīng)下小麥根系對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性機(jī)制。研究結(jié)果將為揭示小麥水磷互作機(jī)制及培育抗逆、磷高效的小麥品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料選用新疆主栽的冬小麥品種新冬 23號(hào)。種子由石河子大學(xué)麥類(lèi)作物研究所提供。選取籽粒飽滿(mǎn)度一致的小麥種子，用0.1%氯化汞溶液消毒15 min，蒸餾水漂洗3次，每次5 min，用濾紙吸干附著水。將種子均勻擺放在鋪兩層濾紙的滅菌發(fā)芽盒中，每盒種50粒，20℃暗培養(yǎng)。每天用蒸餾水澆灌，保持濕潤(rùn)。

試驗(yàn)于2020年6—9月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院冬麥課題組實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，當(dāng)幼苗長(zhǎng)到一葉一心時(shí)（約7 d，從播種開(kāi)始算起），選擇生長(zhǎng)良好且一致的幼苗移入黑色塑料培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培試驗(yàn)。每箱含有相同容量的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，常規(guī)磷水平為1.0 mmol·L-1（CP），低磷水平為0.05 mmol·L-1（LP）。在低磷條件下，用氯化鉀代替部分磷酸二氫鉀。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照18 h，溫度25℃；暗培養(yǎng)6 h，溫度20℃。培養(yǎng)14 d后，分別移入含有15%（w/v）PEG-6000配制的CP和LP的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中模擬干旱脅迫。干旱脅迫 7 d后，分別用不含 PEG-6000的兩種磷水平Hoagland營(yíng)養(yǎng)液復(fù)水3 d。由于脅迫對(duì)植物的傷害在復(fù)水后才可顯現(xiàn)出來(lái)，因此，分別于干旱脅迫0、3、5、7 d和復(fù)水3 d取樣觀察根的生長(zhǎng)情況并掃描拍照。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 根系形態(tài)的掃描 用蒸餾水沖洗根樣品，并用濾紙吸干表面水。為避免重疊，將根部完全展開(kāi)。使用根系掃描儀（Wanshen LS-A，Phantom 9850XL PLUS，中國(guó)）進(jìn)行根系相關(guān)數(shù)據(jù)的采集，具體使用方法參照儀器說(shuō)明。采用 WinRHIZO-PRO2009軟件對(duì)平均根直徑和根系總體積進(jìn)行分析。

1.2.2 根冠比的測(cè)定 植株鮮樣經(jīng)105℃殺青10 min，80°C烘干至恒重，分別測(cè)定小麥植株地上部分干重和根干重，計(jì)算其根冠比。

1.2.3 葉綠素含量的測(cè)定 取不同時(shí)期的小麥葉片剪成碎片，分別稱(chēng)取0.2 g，用95%乙醇，通過(guò)研磨和浸泡法提取葉綠素，以95%乙醇提取的樣品作為對(duì)照。于波長(zhǎng)649 nm、665 nm的分光光度計(jì)中分別測(cè)定其吸光度值，最后計(jì)算葉綠素濃度。Ca= 13.95A665-6.88A649；Cb=24.96A649-7.32A665；葉綠素含量=Ca+Cb。具體參照MAMRUTHA等[29]的方法。

1.2.4 根系DNA含量的測(cè)定 DNA含量測(cè)定參考朱廣廉[30]的方法，稱(chēng)取 0.5g樣品，用 CTAB法提取總DNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的含量。

1.2.5 離子組變化的測(cè)定 隨機(jī)采集CP和LP處理長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗（設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)），分離地上部和根部，采用安捷倫等離子發(fā)射光譜儀（Agilent，ICP-OES-710，USA）進(jìn)行元素含量分析。測(cè)定方法如下：測(cè)定元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1），用2%硝酸稀釋?zhuān)苽錁?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g干燥樣品置于聚四氟乙烯燒杯中，添加10 mL硝酸。將混合物在熱板上加熱12 h，然后在150℃消化至剩余液為2—3 mL，將冷卻后的剩余液轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，用2%硝酸定容。同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。鈣（Ca）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、錳（Zn）、銅（Cu）、鋅（Zn）、鈉（Na）、硅（Si）、鉀（K）和硫（S）含量采用硝酸-高氯酸消煮-ICP測(cè)定；磷（P）采用硫酸-雙氧水消煮一鉬銻抗比色法測(cè)定[31]。

1.2.6 代謝組測(cè)定 將小麥根系樣品在 4℃冰箱中進(jìn)行解凍，每個(gè)樣品各取100 μL加入EP管中，并加入-20℃預(yù)冷的異丙醇300 μL，渦旋1 min使樣品混勻，再將樣品置于-20℃冰箱中沉淀24 h后，4℃，14 000×g離心20 min，慢慢將EP管從離心機(jī)中拿出，按照樣品編號(hào)順序?qū)悠贩胖迷陔x心管架上，同時(shí)每個(gè)樣品上清液各取10 μL并混勻，作為質(zhì)控樣本（quality contral，QC）。

代謝組分析在華大基因生物技術(shù)公司完成。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）進(jìn)行代謝物分析，每個(gè)樣本設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。主要參數(shù)如下：流動(dòng)相A為0.1%乙腈/水（60∶40），流動(dòng)相B為異丙醇/乙腈（90∶10），進(jìn)樣量 10 μL，流速 0.4mL·min-1，柱溫40℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?—2 min，60%A，40%B相；2—2.1 min，57%A，43%B 相；2.1—6 min，50%A，50%B相；6—6.1 min，46%A，54%B相；6.1—8 min，30%A，70%B相；8—8.1 min，1%A，99%B相；8.1—10 min，60%A，40%B相。質(zhì)譜分析采用電噴霧電離（ESI+/ESI-）模式，掃描模式分別為正離子模式和負(fù)離子模式。毛細(xì)管電壓為0.25Kv（+）/2Kv（-）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用Excel和 SPSS 24.0軟件，所有數(shù)據(jù)至少3次重復(fù)，兩個(gè)樣本的顯著性檢驗(yàn)采用配對(duì)t-檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)圖表的繪制采用 Excel 和 Origin 軟件。

利用SIMCAP 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto Scaling和可視化，利用主成分分析PCA、正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析和T檢驗(yàn)篩選組間的差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 不同磷素水平下干旱脅迫對(duì)根系形態(tài)的影響

根系形態(tài)是所有內(nèi)在生物學(xué)過(guò)程的綜合表現(xiàn)。如圖1所示，干旱0 d，LP處理的根系較CP處理濃密，說(shuō)明低磷水平可促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)。干旱脅迫3 d至復(fù)水3 d，LP處理下根系形態(tài)仍比CP處理茂密，不同處理下根系均呈現(xiàn)淡黃色，各根尖均有明顯的膨大現(xiàn)象，但CP處理的根尖膨大更為明顯（圖1）。

圖1 兩種磷水平下干旱脅迫及復(fù)水對(duì)根系形態(tài)的影響Fig.1 The morphology of wheat roots cultured by CP and LP under drought stress and rehydration

2.2 不同磷素水平下干旱脅迫對(duì)小麥地上部和根系生理指標(biāo)的影響

由圖2-A和圖2-C看出，地上部和整株干物質(zhì)量在干旱脅迫和復(fù)水條件下的變化趨勢(shì)一致，但兩種磷水平下存在差異。從干旱脅迫0—7 d再到復(fù)水3 d，CP處理的地上部和整株干重呈先升后降的趨勢(shì)，但LP處理則呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)。其中，干旱0—3 d，地上部干重LP處理增加66.7%，CP處理增加41.0%；干旱7 d到復(fù)水3 d，LP處理增加32.5%；而CP處理則下降14.6%。兩種磷水平下根干重（圖2-B）均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中干旱0—3 d，根干重LP處理增加126.0%，CP處理增加57.9%；干旱7 d到復(fù)水3 d，LP處理降低39.5%；而CP處理則下降40.5%。

干旱脅迫及復(fù)水對(duì)兩種磷水平下根系總體積（圖2-D）影響一致，均為先升高后降低再升高的趨勢(shì)。干旱脅迫5 d，CP處理的根系總體積顯著高于LP處理，其余時(shí)期差異不顯著。干旱7 d到復(fù)水3 d，LP處理增加42.2%，CP處理增加24.0%。

LP和CP處理下干旱脅迫及復(fù)水條件下根系平均直徑（圖2-E）變化一致，均為先降低再升高的趨勢(shì)。干旱脅迫3—5 d CP處理下根系直徑大幅上升，之后保持相對(duì)穩(wěn)定；而LP處理則是小幅下降，之后逐漸上升。

脅迫對(duì)植物的傷害在復(fù)水后才可顯現(xiàn)出來(lái)。圖 2-F顯示，干旱脅迫0、3和5 d兩種磷素水平下根系DNA含量差異不顯著。干旱7 d，CP處理的DNA含量大幅上升，復(fù)水后下降，均極顯著高于LP處理。然而，干旱7 d到復(fù)水3 d，CP處理的DNA含量下降31.3%，LP處理則下降21.7%。說(shuō)明，LP處理對(duì)干旱脅迫的敏感性降低。

圖2-G顯示，干旱脅迫0—7 d，LP處理下小麥植株根冠比呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，而 CP處理變化幅度相對(duì)較小。其中干旱脅迫5 d和7 d時(shí)，LP處理的根冠比顯著高于CP處理。

圖2 兩種磷素水平下干旱脅迫對(duì)小麥地上部和根系生理指標(biāo)的影響Fig.2 The changes of plant weight and physiological characteristics of wheat plants cultured by CP and LP under drought stress

2.3 兩種磷素水平下干旱脅迫對(duì)小麥地上部葉綠素含量的影響

如圖3所示，干旱脅迫0—5 d，CP處理的葉綠素含量逐漸降低，之后變化不大；而 LP處理下干旱5—7 d葉綠素含量迅速下降，復(fù)水后迅速上升。干旱脅迫5 d，LP處理下葉綠素含量反而較高，顯著高于CP處理。干旱脅迫7 d至復(fù)水3 d，LP處理下葉綠素含量上升87.5%。此階段LP處理下葉綠素含量大幅上升的趨勢(shì)和地上部干重的變化趨勢(shì)一致。

圖3 兩種磷素水平下干旱脅迫對(duì)小麥葉綠素含量的影響Fig.3 The changes of chlorophyll content of wheat plants cultured by CP and LP under drought stress

2.4 兩種磷素水平下干旱脅迫對(duì)小麥離子組的影響

為探索不同磷素水平下小麥應(yīng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定了根系和地上部干旱脅迫7 d和復(fù)水3 d的11種元素的變化情況。

如表1所示，根系中離子變化情況如下：干旱脅迫7 d，與CP處理相比，LP處理有6種元素含量顯著下降，分別為 Ca、Na、Mn、Cu 、Zn、Fe；而 Si、P、S、K含量顯著增加，分別增加301.9%、275.7%、90.8%、24.0%；Mg含量變化不顯著。復(fù)水 3 d，LP處理根系仍有6種元素含量顯著低于CP處理，分別是 Ca、Na、Mn、Cu、Zn、Fe；而 K、P、Si、Mg、S含量顯著高于CP處理。

LP處理下，復(fù)水3 d與干旱脅迫7 d相比，根系中Na和Si含量顯著上升，分別增加405.3%、28.2%；Mn、Zn、P含量顯著下降，分別下降71.6%、41.9%、33.7%；K、Ca、Mg、Cu、Fe、S含量變化不顯著。CP處理下，復(fù)水3 d與干旱脅迫7 d相比，根系中Si、Mn、Cu、S含量顯著升高，上升幅度分別達(dá)34.6%、22.2%、102.1%和29.8%；K和Ca含量顯著下降，分別為 26.3%和 51.7%；P、Na、Mg、Zn和 Fe含量變化不顯著。

如表1所示，地上部中離子變化情況如下：干旱脅迫7 d，與CP處理相比，LP處理有3種元素含量顯著下降，分別為K、Si、Mg；7種元素顯著增加，其中 Cu含量增加幅度高達(dá) 707.7%，F(xiàn)e含量增加583.4%，Na含量增加297.3%，Mn增加293.8%，Ca含量變化不顯著。復(fù)水3 d，與CP處理相比，LP處理仍有3種元素含量顯著下降，分別是K、Si、Mg；7種顯著增加，其中Mn含量增加幅度高達(dá)992.8%；Ca含量基本保持不變。

表1 新冬23號(hào)小麥根系和地上部元素含量變化Table 1 The changes of elements content in the roots and shoots of wheat Xindong 23

LP處理下，復(fù)水3 d與干旱脅迫7 d相比，地上部 Mn、Si、Ca含量顯著上升，分別增加 198.0%、128.6%、20.4%；K、P、Na、Mg、Cu、Zn、Fe和 S 含量變化不顯著。CP處理下，復(fù)水3d與干旱脅迫7d相比，地上部Na和Cu元素含量顯著增加；K含量顯著下降；Ca、P、Si、Mn、Mg、Zn、Fe和 S含量變化不顯著。

2.5 兩種磷素水平下干旱脅迫對(duì)小麥代謝組的影響

為了更加詳細(xì)地了解兩種磷素水平下小麥應(yīng)對(duì)干旱脅迫的差異，對(duì)新冬23號(hào)小麥地上部和根系組織的代謝物進(jìn)行了LC-MS/MS檢測(cè)。在QC樣品中RSD＜30%的特征離子用于下一步分析。結(jié)果表明，LP和CP對(duì)比組中，干旱脅迫3 d根系共有24個(gè)差異離子，其中12個(gè)上調(diào)，差異離子涉及4條差異通路（表2），分別為代謝途徑、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次級(jí)代謝物的生物合成和類(lèi)胡蘿卜素生物合成代謝通路，4條差異代謝通路的差異代謝產(chǎn)物均為脫落酸，且含量均為顯著下調(diào)。

表2 新冬23號(hào)小麥LP和CP對(duì)比下干旱脅迫3 d根系差異代謝通路及差異代謝物Table 2 Differential metabolic pathways and metabolites in roots of wheat Xindong 23 under drought stress for 3 days compared with LP and CP

LP和CP對(duì)比組中，干旱脅迫7 d，根系共有8個(gè)差異離子，分別涉及8條差異代謝通路（表3），分別為葉酸生物合成、硫代葡萄糖苷生物合成、2-氧代羧酸代謝通路、嘧啶代謝、代謝途徑、嘌呤代謝、次生代謝物的生物合成通路、硫磺中繼系統(tǒng)通路，各通路的差異代謝物含量均為顯著下調(diào)。此外，干旱脅迫3、7 d的LP和CP對(duì)比組中地上部均未檢測(cè)到差異代謝通路。

表3 新冬23號(hào)小麥LP和CP對(duì)比下干旱脅迫7 d根系差異代謝通路及差異代謝物Table 3 Differential metabolic pathways and metabolites in roots of wheat Xindong 23 under drought stress for 7 days compared with LP and CP

兩種磷素供應(yīng)下干旱脅迫誘導(dǎo)小麥根系與地上部的代謝物種類(lèi)和含量存在顯著差異。如表4—5所示，地上部干旱脅迫3 d與干旱脅迫7 d相比較CP處理涉及57條差異代謝通路，包含509種差異代謝物，涉及的前5位差異代謝通路分別為次級(jí)代謝物合成通路、代謝途徑、萜類(lèi)生物合成通路、類(lèi)胡蘿卜素生物合成通路和異喹啉生物堿生物合成通路，包含的差異代謝物分別為129、109、52、32和18種（表4）。其中萜類(lèi)化合物是作物生長(zhǎng)發(fā)育中重要的次級(jí)生長(zhǎng)代謝物，直接或間接參與植物激素合成、細(xì)胞膜穩(wěn)定性及光合作用等一系列生物過(guò)程。植物營(yíng)養(yǎng)素的水平與萜類(lèi)代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)[32]。萜類(lèi)化合物的變化有助于植物的自我保護(hù)和防御反應(yīng)。本研究中 CP處理地上部干旱脅迫3 d的相關(guān)萜類(lèi)物質(zhì)含量顯著高于7 d，且地上部差異代謝物中涉及萜類(lèi)物質(zhì)多于根系組織。

表4 新冬23號(hào)小麥旱脅迫3 d和7 d對(duì)比下CP處理地上部差異代謝通路及差異代謝物Table 4 Differential metabolic pathways and metabolites in the shoot of CP treatment compared to 3 d and 7 d of drought stress in wheat Xindong 23

續(xù)表4 Continued table 4

干旱脅迫3 d/7 d，CP處理根系涉及18條差異代謝通路，包含57種差異代謝物（表5）；而在LP處理下未檢測(cè)到差異代謝物。表明新冬23號(hào)小麥在兩種磷素供應(yīng)下，干旱脅迫對(duì)CP處理的影響大于LP處理；其中 CP處理地上部差異代謝物數(shù)量多于根系，說(shuō)明地上部對(duì)干旱脅迫更加敏感。

干旱脅迫3 d/7 d根系涉及的差異代謝物最多的通路為亞油酸代謝。賴(lài)氨酸合成中（2R，3R）-3-甲基谷氨酰-5-半醛-N6-賴(lài)氨酸含量上升高達(dá)8.775倍，其次是氨基糖和核苷酸糖代謝差異物升高3.135倍。而色氨酸代謝、不飽和脂肪酸合成以及二萜和單萜生物合成均呈下降趨勢(shì)（表5）。

表5 新冬23號(hào)小麥干旱脅迫3 d和7 d對(duì)比下CP處理根系差異代謝通路及差異代謝物Table 5 Differential metabolic pathways and metabolites in the root of CP treatment compared to 3 d and 7 d of drought stress in wheat Xindong 23

3 討論

3.1 兩種供磷水平下干旱脅迫對(duì)小麥根系形態(tài)及生理指標(biāo)的影響

外界脅迫環(huán)境下小麥植株的表型是所有內(nèi)在生物學(xué)過(guò)程的綜合體現(xiàn)。在兩種施磷條件下，小麥植株干重差異不明顯。干旱脅迫3 d LP處理的根干重顯著高于CP處理，干旱脅迫5 d地上部干重、整株干重、根系體積和根系平均直徑均為 LP處理顯著低于 CP處理。然而，干旱脅迫7 d到復(fù)水3 d兩種磷水平下植株的表現(xiàn)不盡相同，CP處理下地上部和整株干物質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，而 LP處理則呈上升趨勢(shì)；對(duì)于根系總體積，LP處理上升42.2%，CP處理增加24.0%；CP處理的根系 DNA含量下降 31.3%，LP處理則下降21.7%。VAN DOORN W G[12]研究認(rèn)為，脅迫環(huán)境下植物細(xì)胞程序性死亡是作物對(duì)脅迫產(chǎn)生預(yù)警后發(fā)生的抵抗，隨著干旱脅迫程度的增加，細(xì)胞死亡的程度逐漸加劇，最終導(dǎo)致DNA含量降低。而本試驗(yàn)LP處理DNA含量下降率在干旱脅迫后期至復(fù)水后均顯著低于CP處理。綜上說(shuō)明，LP處理的小麥植株對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性增強(qiáng)，復(fù)水后恢復(fù)能力相對(duì)較強(qiáng)。前人研究表明，磷素缺乏的植物會(huì)產(chǎn)生一系列類(lèi)似于適應(yīng)水分脅迫的性狀[10]。如，王燕云等[33]從植物外部形態(tài)、生理生化與酶誘導(dǎo)等多方面闡述了植物缺磷時(shí)發(fā)生的變化；李春儉[34]指出，植物在應(yīng)對(duì)磷素缺乏時(shí)，在形態(tài)學(xué)方面最典型的是側(cè)根數(shù)量增加、根毛變細(xì)變長(zhǎng)、形成明顯的排根、根冠比變大，而在生理學(xué)方面最重要的生理變化之一是有機(jī)酸的代謝分泌。因此，當(dāng)磷素缺乏的植物遇到水分脅迫時(shí)，由于有了對(duì)干旱的適應(yīng)性，對(duì)水分脅迫的敏感性降低[4]。這和本研究的結(jié)果相一致。

從干旱脅迫0 d至7 d根系平均直徑降低，體積增加，主要與根毛的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。李萬(wàn)春[10]的土壤栽培試驗(yàn)表明脅迫環(huán)境對(duì)小麥根毛生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。本研究中，干旱脅迫3 d，根體積較干旱0 d大幅上升，說(shuō)明干旱脅迫對(duì)根系的生長(zhǎng)有一定的刺激作用；但CP處理的根體積上升幅度較LP處理大，而根平均直徑的下降幅度則大于LP處理，說(shuō)明干旱初期CP處理可通過(guò)增加根體積應(yīng)對(duì)干旱脅迫，而 LP處理對(duì)干旱脅迫的敏感性較低。本研究中，干旱脅迫下 CP處理的根尖膨大現(xiàn)象較 LP處理明顯。小麥根尖皮層細(xì)胞起著轉(zhuǎn)運(yùn)和貯藏水分的作用，皮層細(xì)胞形狀的改變是植物對(duì)水分虧缺環(huán)境的一種適應(yīng)性改變，體積變大和相對(duì)細(xì)胞表面積的增大，可增強(qiáng)根的吸水和保水能力，同時(shí)也表明根尖伸長(zhǎng)受阻，變粗膨大[10]。本研究中，干旱7 d和復(fù)水3 d CP處理的根系DNA含量極顯著高于LP處理，基于根尖膨大和DNA含量增加，推測(cè) CP處理的根尖細(xì)胞內(nèi)倍性水平可能高于 LP處理。內(nèi)多倍體是指一個(gè)個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞具有不同倍性細(xì)胞核的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是由于DNA量隨著DNA的復(fù)制以2n形式增長(zhǎng)，但不進(jìn)行染色體的分配和細(xì)胞分裂而產(chǎn)生，與植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性密切相關(guān)[35]。以往研究表明，在低磷脅迫下，大麥植株主根成熟區(qū)和側(cè)根多倍體水平均顯著下降，側(cè)根多倍體水平下降幅度大于主根[35]。內(nèi)倍性的降低有助于減少水分和礦質(zhì)養(yǎng)分有效利用過(guò)程中碳源等營(yíng)養(yǎng)元素的輸入，并增加光合面積。光合作用受到較大影響，但更多的光合產(chǎn)物被輸送到根部[36]，這對(duì)于磷脅迫等非生物脅迫下的植物尤其重要。可能也是本研究中 LP處理下葉綠素含量和根系干重與CP處理差異不顯著或高于CP處理的重要原因。此外，基于磷素在碳、氮等代謝途徑中的重要作用，即使在磷饑餓條件下，植物細(xì)胞仍然需要將磷素濃度維持在一定范圍內(nèi)[37]。因此，在磷素含量有限的情況下，節(jié)約磷素的消耗對(duì)植物的生存至關(guān)重要。研究表明，在低磷條件下生長(zhǎng)的植物根系中，總磷含量的59%至64%來(lái)自核酸物質(zhì)[38]。高的內(nèi)多倍體水平增加了rRNA的數(shù)量，rRNA是核酸的主要成分之一。因此，在磷素有限的條件下，側(cè)根多倍性水平的降低有助于減少基因組DNA、RNA等磷酸化代謝產(chǎn)物合成過(guò)程中的磷素消耗，最終有助于植物更好地適應(yīng)環(huán)境。本課題應(yīng)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究根系的內(nèi)倍性變化，探索其與磷素和水分脅迫的關(guān)系。

對(duì)普通豆類(lèi)的研究表明，與磷充足的植株相比，磷饑餓的植株的根冠比增加[39]，這和本研究的結(jié)果一致。此外，對(duì)擬南芥的研究也表明，磷饑餓可以誘導(dǎo)主根的發(fā)育[40]。目前已鑒定出與大豆磷獲取相關(guān)的根系構(gòu)型性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)，進(jìn)一步表明了根系結(jié)構(gòu)對(duì)大豆低磷適應(yīng)的重要性[41]。缺磷條件下根系構(gòu)型的變化是生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和乙烯內(nèi)部平衡的結(jié)果[42-43]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了一些與植物激素合成和磷反應(yīng)有關(guān)的代謝途徑和代謝產(chǎn)物含量發(fā)生顯著變化，如植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物堿合成和脫落酸等。隨著側(cè)根生長(zhǎng)量的增加，細(xì)胞壁合成和生長(zhǎng)相關(guān)基因?qū)α椎捻憫?yīng)加快。例如，萬(wàn)東莉等[44]對(duì)磷響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)分析表明，不同器官組織對(duì)磷脅迫響應(yīng)的模式不同，并篩選出3個(gè)表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

3.2 兩種供磷水平下干旱脅迫對(duì)小麥植株離子組的影響

干旱脅迫下，植物水分代謝受到嚴(yán)重影響，與水分代謝密切相關(guān)的離子代謝也受到影響。在干旱脅迫和復(fù)水條件下，不同供磷量對(duì)礦質(zhì)元素含量影響較大。在干旱脅迫7 d和復(fù)水3 d，與CP處理相比，LP處理下根系中Ca、Na、Mn、Cu、Zn、Fe含量均顯著降低，而K、P、Si、S和Mg（僅復(fù)水3 d）的含量顯著增加。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)第二信使在眾多細(xì)胞功能中具有調(diào)節(jié)作用。缺鈣或低鈣介質(zhì)將會(huì)終止細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，這可能也是脅迫下小麥根尖膨大的重要原因之一。前人研究表明，磷饑餓會(huì)影響礦質(zhì)元素在作物體內(nèi)的分布及積累情況[45]。隋方功等[46]發(fā)現(xiàn)，夏谷幼苗缺磷時(shí)顯著降低了對(duì)Mg的吸收；都韶婷[47]發(fā)現(xiàn)飯豆低磷處理下根系鐵濃度顯著低于中磷和高磷處理。本研究中，干旱脅迫7 d和復(fù)水3 d LP處理根系中所測(cè)元素大部分較 CP處理顯著減少，而地上部卻截然相反，大部分元素呈顯著上升或差異不顯著的趨勢(shì)。脅迫環(huán)境下植物根系表皮細(xì)胞壁上疏水物質(zhì)的積累可能影響根胞外體對(duì)礦質(zhì)元素的吸收和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[48]。同時(shí)本試驗(yàn)在磷素脅迫基礎(chǔ)上還設(shè)置了干旱脅迫，如前所述，磷素缺乏的植物會(huì)產(chǎn)生一系列類(lèi)似于適應(yīng)水分脅迫的性狀[10]。推測(cè)由于雙重脅迫，小麥幼苗失水，蒸騰張力增大，因此，運(yùn)輸速率增加，植株中金屬元素含量增加[49]。脅迫也可能導(dǎo)致地上部生長(zhǎng)受到抑制，光合產(chǎn)物庫(kù)減少，增加了累積同化物向根系的轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)了根系的滲透調(diào)節(jié)。隨后，根細(xì)胞擴(kuò)大，根系比例增加[50]，最終提高了根系的吸收能力，植物體內(nèi)金屬含量增加。

李仰銳等[51]研究表明，干旱使植株各部位 Cu含量降低（除輕度干旱處理莖部高于對(duì)照），且干旱程度越大降低越多；而植株各部位Mn含量干旱條件下均增加，且干旱程度越大增加越多。譚曉榮等[52]研究表明，輕度干旱使小麥幼苗體內(nèi)的Cu和Mn含量升高，重度干旱使Cu和Mn含量降低。本研究中干旱7 d和復(fù)水3 d根系中LP處理Cu含量均顯著下降，而地上部中則顯著上升，說(shuō)明磷素和干旱的疊加脅迫下對(duì)小麥不同部位Cu的吸收和積累能力影響不同。

本研究中，LP處理下根系復(fù)水3 d與干旱7 d相比，Si和Na元素含量顯著上升，而CP處理的Si、Mn、Cu和S元素顯著上升。硅含量的大幅上升，對(duì)復(fù)水后促進(jìn)根系的生長(zhǎng)，提高植物根系的活力，促進(jìn)植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收有重要作用[53]。硫可以調(diào)節(jié)植物對(duì)主要營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，植物體內(nèi)的一些含硫化合物（如谷胱甘肽）可通過(guò)一些生化反應(yīng)途徑淬滅游離基團(tuán)，從而提高植物體的抗逆性[54]。此外，值得注意的是，復(fù)水后 LP處理的根系 Na離子含量上升405.3%。而過(guò)量的 Na+離子濃度可能會(huì)誘導(dǎo)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，最終促進(jìn)有機(jī)酸的合成，這也可能是小麥植株適應(yīng)磷素和干旱雙重脅迫，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)離子濃度平衡和控制高pH所必需的潛在因素。

3.3 兩種供磷水平下干旱脅迫對(duì)小麥植株代謝組的影響

本研究采用代謝組學(xué)方法，分別研究了干旱脅迫3 d和7 d兩種磷水平下小麥根系和地上部代謝產(chǎn)物的差異。正如上文所述，LP處理由于對(duì)干旱脅迫的敏感性降低，干旱3 d和7 d的對(duì)比組中地上部和根系均未檢測(cè)到差異代謝通路。而干旱脅迫對(duì) CP處理的影響大于LP處理，其中對(duì)CP處理地上部的影響大于對(duì)根系的影響。前人研究表明，脅迫環(huán)境對(duì)植物體內(nèi)糖代謝影響較大，特別是蔗糖、果糖、葡萄糖、甘露糖等在受脅迫的植株體內(nèi)積累水平較高，參與滲透調(diào)節(jié)，保護(hù)膜和蛋白質(zhì)免受ROS的損害[39]。然而本研究中，新冬 23號(hào)小麥體內(nèi)涉及糖代謝顯著變化的物質(zhì)并不多。在地上部差異代謝物中，干旱脅迫3 d涉及的大量氨基酸合成與代謝的物質(zhì)含量顯著高于干旱脅迫7 d。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸的合成受到了明顯抑制，說(shuō)明對(duì)于新冬23號(hào)小麥更多的是氨基酸參與滲透調(diào)節(jié)，地上部中氨基酸的活性對(duì)脅迫環(huán)境的耐受性至關(guān)重要。然而，干旱實(shí)質(zhì)上是抑制了氮代謝水平、糖酵解和氨基酸的生產(chǎn)。此外，與干旱脅迫 3 d相比，脂肪酸的含量在干旱7 d顯著下降，而類(lèi)胡蘿卜素的含量顯著上升。類(lèi)胡蘿卜素是植物體內(nèi)一種重要的烯萜類(lèi)化合物，在植物的光合作用中可保護(hù)葉綠素分子免遭光氧化的損傷，起到輔助吸收光能并保護(hù)光合作用的細(xì)胞器的重要功能[55]。同時(shí)，類(lèi)胡蘿卜素也是一種強(qiáng)氧化劑，在清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面均發(fā)揮作用，另外，它還是ABA合成的前體物質(zhì)[56]。由此推斷，干旱 7 d，類(lèi)胡蘿卜素含量的顯著上升與維持葉片葉綠素含量以及根系A(chǔ)BA含量上升有重要關(guān)系。

如上文所述，磷素和干旱脅迫可能會(huì)影響小麥細(xì)胞的內(nèi)多倍化進(jìn)程，雖然本研究未涉及細(xì)胞周期的相關(guān)研究，但是研究表明磷酸鹽饑餓和干旱脅迫均會(huì)改變植物根系和莖的多倍化水平[35]。特別是玉米素可以導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白合成在性質(zhì)上的改變。本研究中CP處理干旱脅迫3 d/7 d樣本的玉米素代謝通路中S-腺苷-L-甲硫氨酸增加2倍，暗示對(duì)小麥地上部的內(nèi)多倍性有重要影響，也是小麥植株對(duì)脅迫環(huán)境的一種反應(yīng)。

多數(shù)萜類(lèi)化合物參與了地上部的不同代謝活動(dòng)。萜類(lèi)化合物是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的次生代謝產(chǎn)物，直接或間接參與植物激素合成、細(xì)胞膜穩(wěn)定性和光合作用等一系列生物過(guò)程。植物營(yíng)養(yǎng)素的水平與萜烯代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)[32]。萜類(lèi)化合物的變化有助于植物的自我保護(hù)和防御反應(yīng)。在本研究中，CP處理干旱脅迫3 d樣本中相關(guān)萜類(lèi)化合物的含量顯著高于干旱7 d。此外，萜類(lèi)化合物在地上部差異代謝產(chǎn)物中的參與程度高于根系，說(shuō)明 CP處理下干旱脅迫對(duì)地上部萜類(lèi)化合物合成的影響大于根系，且受早期干旱的影響更大。

本研究中，CP處理根系與地上部響應(yīng)干旱脅迫的代謝物差異很大，地上部中隨著干旱時(shí)間延長(zhǎng)，氨基酸、脂肪酸和萜類(lèi)物質(zhì)合成顯著下降；類(lèi)胡蘿卜素顯著上升；而根系中賴(lài)氨酸、氨基糖和大部分脂肪酸合成顯著下降，萜類(lèi)物質(zhì)合成顯著上升。說(shuō)明對(duì)干旱的脅迫反應(yīng)存在著不同的機(jī)制。

干旱脅迫3 d，與CP處理相比，新冬23號(hào)小麥LP處理的 4條差異代謝通路的差異代謝產(chǎn)物均為脫落酸，且含量均為顯著下調(diào)。前人研究表明，在缺水脅迫下，根部 ABA的濃度會(huì)上升，根尖分生組織停止分裂[57]。本研究中結(jié)果與此相反，干旱3 d根部ABA含量下降。這可能是 LP處理下根系長(zhǎng)期處于缺磷狀態(tài)，對(duì)干旱脅迫的耐受性升高，ABA含量不升反降，進(jìn)而促進(jìn)了根系的生長(zhǎng)發(fā)育，增加了根冠比。

磷素參與核酸的合成與代謝。同時(shí)磷素與氮素存在互作，LP處理下磷素的缺乏可能會(huì)影響小麥植株氮營(yíng)養(yǎng)狀況。在氮素供應(yīng)不足時(shí)，游離氨基酸和核酸含量降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，細(xì)胞分裂就會(huì)受到抑制。本研究中，干旱脅迫7 d，與CP處理相比，LP處理中嘧啶代謝和嘌呤代謝通路的差異代謝物含量均為顯著下調(diào)。這可能也是干旱7 d時(shí)LP處理的根系DNA含量極顯著低于CP處理的原因之一。

4 結(jié)論

兩種磷素水平下小麥對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)機(jī)制不同。主要表現(xiàn)如下：（1）LP（0.05 mmol·L-1）處理下根系濃密，對(duì)干旱脅迫適應(yīng)性增強(qiáng)，復(fù)水后 LP處理根系總體積上升率顯著高于正常磷處理，而根系DNA含量下降率低于CP（1.0 mmol·L-1）處理。根尖膨大現(xiàn)象和相關(guān)代謝物變化暗示 LP處理下根系細(xì)胞內(nèi)多倍性降低，有助于有效利用水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。（2）離子組分析表明，與CP處理相比，LP處理中根系Ca、Na、Mn、Cu、Zn、Fe含量下降，地上部P、Na、Mn、Cu、Zn、Fe、S含量上升。LP處理下根系比例增加，提高了根系的吸收能力，植物體內(nèi)礦質(zhì)元素含量增加。（3）代謝組分析表明，CP處理對(duì)干旱脅迫更加敏感，其中干旱脅迫對(duì)CP處理地上部影響大于根系。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)氨基酸、脂肪酸和萜類(lèi)物質(zhì)的代謝影響更大。CP處理小麥根系與地上部響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制不同。LP處理小麥植株對(duì)干旱脅迫的敏感性降低，適應(yīng)性更強(qiáng)，復(fù)水后恢復(fù)能力強(qiáng)于CP處理，其主要原因是根系形態(tài)的改變、離子平衡的重排以及氨基酸和脫落酸代謝的改變，以調(diào)節(jié)滲透平衡，維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫的耐性。