河北省旱堿麥品質(zhì)和抗性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記檢測

王 偉， 張 宸， 王 志， 張衛(wèi)軍， 王偉偉， 于 亮， 鈕力亞， 王奉芝， 張景儉

(1.滄州市農(nóng)林科學(xué)院/河北省農(nóng)作物耐鹽堿評價與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗室, 河北 滄州 061001;2.滄縣鑫翰種植專業(yè)合作社, 河北 滄縣 061731;3.滄州渤海新區(qū)中捷產(chǎn)業(yè)園區(qū)農(nóng)務(wù)局, 河北 滄州 061108)

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一，其產(chǎn)量關(guān)系著國家糧食安全[1]。小麥的銹病和赤霉病嚴(yán)重影響著小麥的豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性，導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降[2-3]。穗發(fā)芽對小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)等方面均有影響，而且小麥穗發(fā)芽抗性易受基因型與環(huán)境因素的共同影響[4-5]。干旱是限制小麥生產(chǎn)主要的非生物逆境脅迫因素之一，對小麥產(chǎn)量要素和品質(zhì)性狀的形成有著嚴(yán)重影響[6-7]。選育和推廣抗病、抗逆的小麥品種是保障國家糧食安全，促進(jìn)小麥生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。河北省鹽堿地總面積約71.61萬hm2，是我國鹽堿地的主要類型之一[8]，旱堿麥?zhǔn)菫I海鹽堿地產(chǎn)出的特色小麥產(chǎn)品[9]。明確河北省旱堿麥優(yōu)質(zhì)、抗病、抗旱和抗穗發(fā)芽等性狀相關(guān)功能基因的組成分布，對于河北省小麥優(yōu)質(zhì)專用旱堿麥的生產(chǎn)以及鹽堿地資源的開發(fā)利用具有重要意義。

小麥籽粒高分子量麥谷蛋白亞基只占小麥貯藏蛋白的10%左右，分別由位于第一同源群染色體長臂上的Glu-A 1、Glu-B 1和Glu-D 1位點(diǎn)的基因編碼[10-11]，是決定面粉烘烤品質(zhì)最主要的因素[3]。小麥葉銹病是小麥的重要病害之一，主要通過侵害小麥葉片從而影響光合作用來降低小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[12]。Lr34和Lr68屬于慢銹病基因，抗病效果持久[13]。小麥赤霉病是一種危害性很強(qiáng)的真菌病害，而Fhb1是抗小麥抗赤霉病的主效基因[14]。小麥的穗發(fā)芽抗性主要受種子休眠性、種皮顏色和穎殼抑制物等因素的影響，休眠特性與穗發(fā)芽抗性能力顯著相關(guān)[15]。Tasdr-B1基因?qū)π←溗氚l(fā)芽抗性有重要調(diào)控作用，基因型Tasdr-B1a的發(fā)芽指數(shù)顯著低于Tasdr-B1b，為Tasdr-B1基因的抗穗發(fā)芽單倍型[16-17]。TaPHS1基因?qū)π←溗氚l(fā)芽抗性起正向調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)控小麥成熟期的種子休眠性[18]。干旱缺水是影響小麥產(chǎn)量的重要因素，小麥的抗旱性是多個基因共同作用的數(shù)量性狀。Dreb-B1是應(yīng)答干旱脅迫的一個小麥轉(zhuǎn)錄因子[19-20]。抗旱基因TaSST-A1是一種小麥莖稈水溶性碳水化合物合成基因，可提高小麥粒重和產(chǎn)量[21]。

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)是一項靈活、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的SNP檢測方法[22]。目前已利用KASP技術(shù)標(biāo)記了小麥重要性狀如株高，抗病性、抗旱性等相關(guān)功能基因的KASP標(biāo)記，可用于相應(yīng)功能基因的快速分型檢測[23-26]。本試驗利用小麥品質(zhì)基因高分子量谷蛋白亞基、抗病和抗逆性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記，對54份河北省旱堿麥品種，進(jìn)行優(yōu)質(zhì)、抗病和抗逆性狀相關(guān)基因進(jìn)行單倍型檢測，旨在了解河北省旱堿麥優(yōu)質(zhì)、抗病和抗逆性狀相關(guān)基因的分布情況，篩選含有目標(biāo)基因的優(yōu)異種質(zhì)資源，為河北省鹽堿地上旱堿麥的優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆育種提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為河北省內(nèi)相關(guān)育種單位選育的常規(guī)旱堿麥品種(25份)和收集的農(nóng)家種(29份)，共54份，品種信息見表3。

1.2 試驗方法

每份材料取10粒種子置于培養(yǎng)皿內(nèi)，室內(nèi)超純水培養(yǎng)，萌發(fā)后第8天取幼苗葉片放入加有鋼珠的2.0 mL的Eppendorf管中，每個材料3次重復(fù)。將樣品液氮速凍后，在研磨機(jī)上研磨成粉狀。利用天根植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

根據(jù)文獻(xiàn)[23]，由中玉金標(biāo)記生物技術(shù)股份有限公司合成抗葉銹病、抗赤霉病、抗穗發(fā)芽和品質(zhì)相關(guān)基因等的KASP標(biāo)記引物(表1)。利用KASP 5000 V 4.0 2×MasterMix (LGC公司，英國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括4.78 μL DNA (5～50 ng/μL)，5 μL KASP 5 000 V 4.0 2×MasterMix，0.14 μL KASP Assay Mix，0.08 μL Mg+。KASP Assay Mix是由3條引物的稀釋獲得：先將引物稀釋成100 μmol/L，再按FAM-primer∶HEX-primer∶Common primer∶ddH2O=12∶12∶30∶46的比例混合[17]。PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX 96 PCR儀上進(jìn)行。每次反應(yīng)設(shè)置4個空白對照組(NTC)。PCR反應(yīng)為降落PCR，反應(yīng)程序為：94 ℃熱處理15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火和延伸60 s 10個循環(huán)(每個循環(huán)下降0.6 ℃)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火和延伸60 s，26個循環(huán)；4 ℃避光保存[25]。待PCR反應(yīng)程序結(jié)束后進(jìn)行熒光掃描，然后進(jìn)行基因型分析。

表1 試驗所用的KASP標(biāo)記引物

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)相關(guān)基因

本研究共檢測了2個品質(zhì)相關(guān)基因Glu-D1和Glu-A1。有15份材料含有Glu-D1基因的高分子量麥谷蛋白亞基5+10，占全部供試材料的68.52%；有32份材料是Glu-A1基因的Ax1orAx2*強(qiáng)筋單倍型，占全部供試材料的59.26%(表2)。

表2 河北省54份旱堿麥品質(zhì)和抗性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記檢測

2.2 抗病相關(guān)基因

本研究共檢測了3個抗病基因，包括抗葉銹病基因(Lr34和Lr68)和抗赤霉病基因Fhb1。結(jié)果顯示，52份旱堿麥材料中含有抗葉銹病基因Lr34的材料占比為46.20%，在29份農(nóng)家種中的占比高達(dá)86.21%；52份旱堿麥材料中有3份含有抗葉銹病基因Lr68，分別為滄麥12，滄麥14和衡4399；52份旱堿麥材料中有27份含有抗赤霉病基因Fhb1，占比50.00%，而在29份農(nóng)家種中占比高達(dá)86.21%。說明絕大部分小麥農(nóng)家種具有葉銹病和赤霉病抗性。

2.3 抗穗發(fā)芽相關(guān)基因

在抗穗發(fā)芽基因方面，本研究共檢測了4個抗穗發(fā)芽的基因，分別為TaSdr-B1、TaPHS1、TaMoc-A1和TaMFT-A1。有24份材料含TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗發(fā)芽單倍型，占全部供試材料的44.44%；有47份材料含有TaPHS1基因的RioBlancotype抗穗發(fā)芽單倍型，占全部供試材料的87.03%；僅有9份材料含有TaMoc-A1基因的Hap-H抗穗發(fā)芽單倍型，占全部供試材料的16.67%；在所有供試材料中含TaMFT-A1基因的Jagger-type和Zen/2174-type抗穗發(fā)芽單倍型的材料數(shù)分別為10份和28份，分別占全部供試材料的18.52%和51.85%(表2)。

2.4 抗旱相關(guān)基因

本研究共檢測了3個與小麥抗旱性相關(guān)的基因，分別為COMT-3B、Dreb-B1和TaSST-4A。有44份材料含有COMT-3B基因的3Ba單倍型，占全部供試材料的81.48%；僅有12份材料含有Dreb-B1基因的TaDREB-B1a抗旱單倍型，占全部供試材料的22.22%；有49份材料含有TaSST-4A基因的A2a抗旱單倍型，占全部供試材料的90.74%(表3)。其中，石優(yōu)20、石優(yōu)17、石15鑒21、邯優(yōu)361和衡0628均聚合了這3個小麥抗旱性基因的抗旱單倍型。

表3 河北省54份旱堿麥品質(zhì)和抗性相關(guān)基因KASP標(biāo)記的基因分型

3 討 論

河北省是我國重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大省，土壤鹽堿化嚴(yán)重且面積較大，已成為影響河北省農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一。培育耐鹽堿農(nóng)作物新品種，利用生物途徑提高作物耐鹽堿能力是有效利用鹽堿耕地的重要途徑。而KASP標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確性高，成本低廉，采用KASP標(biāo)記輔助選擇能顯著提高育種效率。目前，國內(nèi)外研究者利用不同性狀的相關(guān)基因?qū)Σ煌愋偷男←溒贩N進(jìn)行KASP標(biāo)記分型[23,25]。本研究利用KASP標(biāo)記技術(shù)，鑒定出河北省旱堿地小麥的品質(zhì)、抗病性、抗旱性和抗穗發(fā)芽等相關(guān)基因的單倍型，為河北省旱堿麥優(yōu)質(zhì)抗病抗逆育種提供理論依據(jù)。

3.1 河北省旱堿麥品質(zhì)基因的KASP標(biāo)記檢測

蛋白質(zhì)作為小麥籽粒的重要貯藏物質(zhì)，占籽粒重量的10%～15%，小麥高分子量麥谷蛋白亞基約占小麥貯藏蛋白的10%[27]?；騁luD1和GluA1是其中兩個編碼高分子麥谷蛋白亞基的基因[10]，與GluB1基因相互作用，對面筋的彈性起著決定性作用[28]。其中，5+10亞基具有較好的和面特性[29]，5+10基因型具有較好的蘭州拉面品質(zhì)[30]。本研究表明，5+10亞基多出現(xiàn)在常規(guī)小麥品種中，29個小麥農(nóng)家種均是2+12 or other單倍型；在Glu-A1基因KASP標(biāo)記檢測結(jié)果中，農(nóng)家種多為Ax1orAx2*強(qiáng)筋單倍型；優(yōu)質(zhì)旱堿麥滄麥119、藁優(yōu)8901和石麥22同時聚合了這2種強(qiáng)筋單倍型。這些研究結(jié)果為河北省優(yōu)質(zhì)旱堿麥育種提供遺傳信息和親本選擇依據(jù)。

3.2 河北省旱堿麥抗病基因的KASP標(biāo)記檢測

河北省旱堿麥農(nóng)家種多攜帶抗赤霉病基因Fhb1[14]，而且農(nóng)家種中攜帶抗葉銹基因Lr34的頻率亦較高，說明Fhb1基因和Lr34在旱堿麥農(nóng)家種中分布較高，一定程度上解釋了小麥抗病育種常識中農(nóng)家種抗病性好的原因。這些農(nóng)家種可為河北省旱堿麥抗病育種提供親本材料，是培育小麥抗赤霉病和葉銹病品種的基礎(chǔ)條件。

3.3 河北省旱堿麥抗逆基因的KASP標(biāo)記檢測

小麥的抗旱性和穗發(fā)芽抗性是小麥抗逆育種的重要目標(biāo)。河北省的濱海鹽堿地分布廣泛，土地鹽堿化程度高，冬春兩季干旱少雨，獨(dú)特的環(huán)境條件使得旱堿麥抗逆性較好。在穗發(fā)芽抗性的KASP標(biāo)記檢測中，在29份農(nóng)家種中，有23份材料含有TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗發(fā)芽單倍型；有27份材料含有TaPHS1基因的RioBlancotype抗穗發(fā)芽單倍型；僅有2份材料含有TaMoc-A1基因的Hap-H抗穗發(fā)芽單倍型；有24份材料含有TaMFT-A1基因的Zen/2174-type抗穗發(fā)芽單倍型；白葫蘆頭和大紅芒均含有這4種抗穗發(fā)芽的單倍型(表3)。對于小麥抗旱性KASP標(biāo)記的檢測中，大部分材料含有COMT-3B基因的3Ba抗旱單倍型和TaSST-4A基因的A2a抗旱單倍型(表3)。其中，石優(yōu)20、石優(yōu)17、石15鑒21、邯優(yōu)361和衡0628均聚合了本文中3個小麥抗旱性基因的抗旱單倍型。這可能是河北省旱堿麥尤其是農(nóng)家種多具有抗旱性和穗發(fā)芽抗性的原因，或許也與旱堿麥長期適應(yīng)外界環(huán)境條件有關(guān)。這些檢測結(jié)果，可為小麥抗逆性育種提供種質(zhì)資源。