射干種子萌發(fā)的影響因素及其對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

耿曉東， 吉愛(ài)偉， 周 英， 汪成忠， 錢劍林

(蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215008)

圖1 種子外部形態(tài)及解剖形態(tài)

射干(BelamcandachinensisL.)為鳶尾科射干屬多年生草本植物。射干屬植物全世界僅有2種，其中的射干產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、華中、西南等22個(gè)省、市、自治區(qū)，多生長(zhǎng)于海拔較低的林緣或山坡草地[1]。射干花朵艷麗，精致有趣，在少花的夏季盛開(kāi)，是優(yōu)秀的觀賞資源和育種資源。射干適應(yīng)性廣泛，抗寒和抗旱性均強(qiáng)，是水土保持、防風(fēng)固沙的優(yōu)選材料，在我國(guó)大部分區(qū)域的城市園林內(nèi)都適宜栽培。由于其根狀莖具有藥用價(jià)值，很多學(xué)者對(duì)其研究較多的是射干的藥理成分和藥效方面[2-3]，少部分研究涉及射干的生物學(xué)特性、系統(tǒng)分類等方面[4-6]，關(guān)于射干種子的相關(guān)研究較為少見(jiàn)。

種子萌發(fā)是植物發(fā)育的起點(diǎn)和適應(yīng)外界環(huán)境的初始環(huán)節(jié)，也是植物生活史中最為關(guān)鍵和脆弱的階段[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，射干在自然條件下發(fā)芽緩慢、發(fā)芽率低、出苗不整齊，這成為限制射干規(guī)模化生產(chǎn)、影響其種苗繁育和雜交育種的重要因素。系統(tǒng)探究射干種子的萌發(fā)能力和促進(jìn)發(fā)芽的便捷手段，對(duì)提高射干在城市園林中的有效應(yīng)用顯得十分必要。射干具有很強(qiáng)的抗性，在壩地、風(fēng)沙灘地、鹽堿地都可以生長(zhǎng)[9]，但目前鮮見(jiàn)相關(guān)研究。由于萌發(fā)階段的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可從多角度揭示植物的逆境脅迫機(jī)制，加深對(duì)植物響應(yīng)環(huán)境脅迫的理解，本研究在明晰射干種子萌發(fā)條件基礎(chǔ)上，利用萌發(fā)期對(duì)逆境脅迫極為敏感的特性，摸清射干種子的抗鹽幅度范圍，以期為射干的后續(xù)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為耐鹽植物的篩選和應(yīng)用擴(kuò)大種質(zhì)資源庫(kù)。

1 材料與方法

選取栽植于蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院相城科技園基地的三年生射干植株及采收的種子作為研究對(duì)象，2017—2019年分階段進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。

1.1 種子產(chǎn)量與構(gòu)成因素測(cè)定

隨機(jī)選取30株射干植株。統(tǒng)計(jì)每花序的單花數(shù)、坐果率、胚珠數(shù)、種子質(zhì)量[10-11]。

1.2 種子生活力、含水量及吸水速率的測(cè)定

種子生活力采用四唑染色法進(jìn)行測(cè)定[12]；種子含水量采用烘干法進(jìn)行測(cè)定[14]；種子吸水速率的測(cè)定：選取完整的射干種子和去皮種子各30粒，3次重復(fù)。稱量后放入燒杯在25 ℃恒溫箱中進(jìn)行吸脹，每隔1 h進(jìn)行一次稱重。重復(fù)此操作直到質(zhì)量恒定。

種子吸水率(%)=[(吸水后質(zhì)量-吸水前質(zhì)量)/吸水前質(zhì)量]×100%。

1.3 抑制物萌發(fā)試驗(yàn)

粗提物的抑制活性測(cè)定[12]：分別取射干的兩個(gè)不同部位(種皮和胚乳)的粗提液進(jìn)行白菜種子萌發(fā)試驗(yàn)。28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，24 h后測(cè)發(fā)芽率，48 h后測(cè)幼根長(zhǎng)度，每處理重復(fù)3次，蒸餾水作為對(duì)照(ck)。白菜種子千粒重為3.41 g，含水量約70 mg/g。

1.4 種子發(fā)芽試驗(yàn)

大田萌發(fā)：射干種子在采收后于翌年4月播種于大田。觀察90 d的發(fā)芽情況。

溫度處理： 1) 不同恒溫條件的處理：觀察5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃恒溫條件下種子發(fā)芽情況； 2) 晝夜變溫處理：白天(08：00—16：00時(shí)共8 h)用高溫處理，夜間(16：00—08：00時(shí)共16 h)用低溫處理。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后，篩選出兩種變溫處理方式：30 ℃(8 h)/20 ℃(16 h)和25 ℃(8 h)/15 ℃(16 h)。

機(jī)械及層積處理： 1) 新采收的種子經(jīng)碾壓后去除外種皮，20 ℃條件下發(fā)芽試驗(yàn)； 2) 射干種子采收后散置于濕度為60%的濕沙箱內(nèi)，在4 ℃冰箱內(nèi)保存30 d。常規(guī)發(fā)芽試驗(yàn)。

發(fā)芽試驗(yàn)方法：40 ℃溫水浸種。選擇沉水種子每處理30粒，3次重復(fù)。統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)。

發(fā)芽率(%)=(種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

相對(duì)發(fā)芽率(%)=(脅迫處理的發(fā)芽率/對(duì)照的發(fā)芽率)×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt。

式中，Gt為第t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

1.5 種子萌發(fā)對(duì)NaCl脅迫的耐受性試驗(yàn)

NaCl脅迫試驗(yàn)中設(shè)置5個(gè)NaCl濃度水平，依次為：100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L。將等量的NaCl溶液分別加入培養(yǎng)皿中，保證皿內(nèi)濾紙全部浸濕且達(dá)到飽和狀態(tài)，隨機(jī)放置30粒種子。25 ℃(8 h)/15 ℃(16 h)條件下培養(yǎng)，3次重復(fù)。以等量的蒸餾水作為對(duì)照(ck)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖使用Excel 2016軟件，差異顯著性分析使用SPSS 22.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 射干種子潛在產(chǎn)量

植物結(jié)實(shí)的最終目的是獲得最大的種子產(chǎn)量。種子產(chǎn)量的高低，直接影響單株植物的繁殖效率，說(shuō)明其擴(kuò)大再生產(chǎn)的能力。觀察統(tǒng)計(jì)30株射干植株的開(kāi)花和坐果情況，如表1所示。稱重后計(jì)算平均值，種子單粒重為22.91 mg，由所有數(shù)據(jù)計(jì)算得出射干的潛在種子產(chǎn)量為21.67 g，實(shí)際種子產(chǎn)量占潛在種子產(chǎn)量的77.8%。說(shuō)明射干的實(shí)際種子產(chǎn)量很高，可以滿足規(guī)模化育苗的需要。

表1 射干的開(kāi)花數(shù)和坐果率

2.2 射干種子生活力和含水量

射干種子的含水量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)大幅度下降且差異極顯著(p<0.05)。新鮮種子及采收4個(gè)月、8個(gè)月、12個(gè)月后，種子含水量分別為14.6%、10.7%、9.1%及8.9%。貯藏4個(gè)月的種子含水量下降26.7%，貯藏8個(gè)月的種子含水量下降37.7%。因此采收8個(gè)月內(nèi)是種子失水的高峰期。

表2 不同貯藏時(shí)間的射干種子生活力和含水量

2.3 射干種子的吸水速率

從吸水試驗(yàn)可以看出(表3)，射干的去皮種子和帶皮種子吸水速率均較高，在吸脹2 h時(shí)吸水率即達(dá)到58.96%和35.22%，吸脹60 h后趨于飽和。帶皮種子在吸脹第1天的吸水率達(dá)96.71%，說(shuō)明射干種皮的透水性較好。

表3 射干種子的吸水率

2.4 射干抑制物萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果

抑制物萌發(fā)試驗(yàn)中，白菜種子在射干種皮浸提液中的發(fā)芽率降低21.48%，胚根長(zhǎng)度在萌發(fā)48 h和72 h后僅為ck的50%左右。種皮浸提液對(duì)白菜種子的發(fā)芽和胚根生長(zhǎng)影響顯著(p<0.05)(表4)。說(shuō)明射干種皮雖有較好的透水性，但其含有的某些內(nèi)源物質(zhì)仍抑制了種子萌發(fā)。

表4 抑制物萌芽試驗(yàn)的發(fā)芽情況

2.5 射干種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1大田發(fā)芽率

觀察發(fā)現(xiàn)，射干種子在大田播種后的12～14 d陸續(xù)發(fā)芽，至30 d左右時(shí)發(fā)芽率為30.27%。其后發(fā)芽率極為緩慢，在80 d時(shí)統(tǒng)計(jì)大田發(fā)芽率為43.84%。說(shuō)明射干種子在自然條件下的發(fā)芽率較低。

2.5.2溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響

如表5所示，射干種子在恒溫條件下的發(fā)芽情況十分不理想。在較為適宜的溫度條件下(25 ℃、20 ℃)發(fā)芽率也僅為28.76%和40.51%。而在兩種變溫條件下，種子發(fā)芽率得到顯著提高(p<0.05)。發(fā)芽率分別達(dá)到84.04%和88.68%，較恒溫條件的發(fā)芽率提高了2倍以上，說(shuō)明變溫是提高射干種子發(fā)芽率的重要手段。25 ℃/15 ℃與30 ℃/20 ℃相比，發(fā)芽率稍高，但兩者之間差異不顯著(p>0.05)。

表5 不同恒溫及變溫條件下射干種子的發(fā)芽情況

2.5.3機(jī)械去皮及層積處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

我不知怎么竟然摸到了一根竹竿。這根竹竿是前幾天同屋里的一位同事從積木場(chǎng)上順回來(lái)晾曬他的內(nèi)衣內(nèi)褲的，那上邊還有花花答答的褲衩子?，F(xiàn)在我要派上用場(chǎng)了。

如表6所示，將射干去除種皮后在20 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，發(fā)芽率達(dá)到50.04%，與完整種子同溫處理40.51%的發(fā)芽率差異顯著(p<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明射干種皮抑制發(fā)芽。

經(jīng)過(guò)2個(gè)月的低溫沙藏，觀察發(fā)現(xiàn)有少量射干種子已經(jīng)在濕沙中發(fā)芽，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率為1.64%，說(shuō)明種子在長(zhǎng)期的低溫層積過(guò)程中已經(jīng)打破休眠。低溫層積后的3種溫度條件發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明(表6)，仍是25 ℃/15 ℃變溫處理下發(fā)芽率最高，達(dá)到96.47%，同時(shí)這一處理下的發(fā)芽勢(shì)也較非層積處理后的發(fā)芽勢(shì)高，說(shuō)明低溫層積不但能夠打破休眠，提高種子發(fā)芽率，而且對(duì)提高發(fā)芽整齊度具有重要促進(jìn)作用。

表6 機(jī)械去皮及低溫層積處理后射干種子的發(fā)芽情況

2.6 NaCl脅迫對(duì)射干種子萌發(fā)的影響

如表7所示，100 mmol/L NaCl脅迫下射干種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均稍高于ck，但差異不顯著(p>0.05)。此時(shí)的發(fā)芽率可高達(dá)90%以上，說(shuō)明低濃度的NaCl脅迫可以小幅促進(jìn)種子的萌發(fā)；200 mmol/L的NaCl脅迫下各項(xiàng)指標(biāo)與ck持平，兩者之間差異不顯著(p>0.05)；當(dāng)NaCl脅迫濃度高于300 mmol/L時(shí)，各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)開(kāi)始發(fā)生顯著降低(p<0.05)；400 mmol/L NaCl脅迫濃度時(shí)，種子發(fā)芽率僅為ck的36.4%，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)也分別為ck的38.4%和52.6%；至500 mmol/L時(shí)，種子發(fā)芽率已降低至10%左右，僅為ck的14.5%，且發(fā)芽不整齊，此時(shí)種子活力下降幅度大，嚴(yán)重影響了種苗的質(zhì)量。

表7 不同濃度NaCl處理下射干種子的發(fā)芽情況

將種子發(fā)芽率下降到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的NaCl脅迫濃度作為種子萌發(fā)的臨界值。將種子發(fā)芽率下降到25%時(shí)所對(duì)應(yīng)的NaCl脅迫濃度作為種子萌發(fā)的極限值[12]。據(jù)此發(fā)現(xiàn)NaCl溶液濃度和射干種子發(fā)芽率之間呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。一元線性回歸方程進(jìn)行擬合后效果較好，回歸方程為y=-0.207 8x+120.02(R2=0.942 9)。據(jù)此預(yù)測(cè)射干種子NaCl脅迫的臨界值為337 mmol/L，極限值為457 mmol/L。

3 討 論

3.1 射干種子的發(fā)芽能力及影響因素

卡恩吸水理論[15]認(rèn)為，種子吸水率能夠達(dá)到38%及以上是保障其萌發(fā)的基本條件之一。射干種子的種皮質(zhì)地較為疏松，吸水速率較高，在吸脹2 h的吸水率為58.69%，說(shuō)明射干種皮的透水性滿足其萌發(fā)需求。剛采收的新鮮射干種子的生活力為70.0%，且在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，說(shuō)明生活力也不是限制射干種子萌發(fā)的主要因素。研究表明，多數(shù)休眠種子體內(nèi)含有內(nèi)源抑制物質(zhì)[16-17]，種子浸提液的生物測(cè)定可以有效檢測(cè)抑制物是否存在[18]。本研究結(jié)果表明，射干的種皮較胚乳對(duì)白菜種子的萌發(fā)抑制作用顯著。后續(xù)的20 ℃恒溫條件萌發(fā)試驗(yàn)中，去除種皮后的種子發(fā)芽率比完整種子的發(fā)芽率提高了40.9%，表明去除種皮是提高種子發(fā)芽率的有效手段。胚乳浸提液雖對(duì)小白菜種子萌發(fā)有輕微抑制，但抑制作用不顯著，說(shuō)明抑制物主要為種皮，其導(dǎo)致射干種子的生理休眠。種皮內(nèi)源抑制物質(zhì)的有機(jī)成分和具體含量還需要進(jìn)一步測(cè)定和驗(yàn)證。

溫度作為種子萌發(fā)的先決條件，對(duì)植物的萌發(fā)結(jié)果影響顯著[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，恒溫條件并不適合射干種子萌發(fā)，各梯度處理中20 ℃下最高，但萌發(fā)率也僅為35.51%。這一研究結(jié)果與曲艷等[20]得出的射干種子在20 ℃恒溫條件下發(fā)芽率最高的結(jié)論有一定差異。是否因不同種源、不同年份種子造成了這種差異值得進(jìn)一步探究。從另一方面來(lái)看，射干種子萌發(fā)的溫度跨度很大，這與其南北均有分布的廣大范圍、溫度差異大的生長(zhǎng)環(huán)境是相適應(yīng)的。經(jīng)過(guò)10 ℃溫差的晝夜變溫處理后，射干種子的發(fā)芽率超過(guò)80%，較恒溫條件提高了50%以上，說(shuō)明溫差是射干種子發(fā)芽極其重要的因素。很多研究表明，在種子發(fā)育過(guò)程中，低溫能夠打破新收獲種子的休眠[21]，晝夜變溫能夠促進(jìn)種子萌發(fā)的速率和整齊度。有學(xué)者曾經(jīng)測(cè)定85種植物種子的萌發(fā)條件，發(fā)現(xiàn)變溫有利于68種植物種子的萌發(fā)[22]。很多相關(guān)研究均證實(shí)了這一點(diǎn)[23-24]，本研究也與這些研究結(jié)果一致。

層積處理30 d后，射干種子在恒溫條件下的發(fā)芽率得到較為顯著的提升，說(shuō)明層積改善了種子對(duì)溫度的敏感度。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，層積后的種子種皮表皮空隙變大，種胚體積明顯增大，種胚彎曲幅度降低，種胚伸長(zhǎng)，胚乳開(kāi)始被消耗。說(shuō)明層積解除了射干種子的形態(tài)休眠，這與其他一些植物的低溫層積后種胚的發(fā)育階段是一致的[25-26]。相關(guān)研究也表明，層積能夠消除種子內(nèi)源抑制物，誘導(dǎo)胚發(fā)育所需物質(zhì)的形成。綜合各種萌發(fā)處理方式的效果和難易程度，本研究提出適宜射干種子萌發(fā)的便捷方法為：低溫層積處理30 d后置于25/15 ℃晝夜變溫條件下萌發(fā)。如果進(jìn)行大田播種，30 d左右的層積處理也有利于提高種子發(fā)芽勢(shì)，使得出苗整齊，有利于規(guī)?；a(chǎn)。

3.2 射干種子的NaCl耐受能力

射干抗性強(qiáng)，有一定的耐鹽堿能力，本研究在種子階段證明了這一點(diǎn)。結(jié)果表明，射干種子的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)在0～200 mmol/L NaCl脅迫下變化不顯著，其中100 mmol/L NaCl溶液濃度甚至輕微促進(jìn)了種子萌發(fā)，這在一定程度上是Na+刺激作用的結(jié)果[27]。當(dāng)脅迫濃度增加到300 mmol/L以上時(shí)，射干種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)隨著脅迫濃度的提高均呈顯著降低趨勢(shì)。當(dāng)脅迫濃度增加到500 mmol/L時(shí)，射干種子的發(fā)芽能力、發(fā)芽數(shù)量已經(jīng)嚴(yán)重下降，表現(xiàn)為岀苗不整齊、長(zhǎng)勢(shì)不整齊，部分胚根變質(zhì)，嚴(yán)重影響后續(xù)的種苗正常發(fā)育。本研究根據(jù)相關(guān)方程預(yù)測(cè)射干種子NaCl脅迫的臨界值和極限值分別為337 mmol/L、457 mmol/L，這一結(jié)果為射干的實(shí)生苗繁育、改良土壤、降低土壤的堿性提供數(shù)據(jù)參考。關(guān)于射干種子在不同萌發(fā)階段和不同器官的NaCl耐受性和耐受機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。