核因子E2相關(guān)因子2在椎間盤退變中的作用△

陳海偉，劉明強(qiáng)，張廣智，康學(xué)文

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730030）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是一種臨床常見的肌肉骨骼系統(tǒng)退行性疾病，大約70%～85%的人一生中至少會經(jīng)歷一次腰痛，嚴(yán)重降低了生活質(zhì)量［1］。然而，IDD的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為，多種因素參與IDD的發(fā)生發(fā)展，例如：炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、機(jī)械負(fù)荷異常、營養(yǎng)剝奪和遺傳因素等［2～4］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2）是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時也是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者。Nrf2是調(diào)控IDD細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有可能作為治療IDD的潛在靶點(diǎn)。本文就這方面研究進(jìn)展作一綜述，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 Nrf2的結(jié)構(gòu)與功能

Nrf2是亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper,bZIP）轉(zhuǎn)錄因子，由7個Nrf2-ECH同源結(jié)構(gòu)域（Neh1–7）的模塊蛋白組成，每個域具有不同的功能［5］。Neh1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是高度保守的基本區(qū)域，可介導(dǎo)Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements,ARE）序列的結(jié)合；Neh2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與Nrf2負(fù)調(diào)控因子Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）和7個賴氨酸殘基的相互作用，用于Nrf2的泛素化和隨后的蛋白酶體降解；C端Neh3結(jié)構(gòu)域具有反轉(zhuǎn)錄活性，并與Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域協(xié)同激活Nrf2靶基因的轉(zhuǎn)錄；Neh6域是一個富含絲氨酸的區(qū)域，參與獨(dú)立于Keap1的Nrf2穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)節(jié)；Neh7結(jié)構(gòu)域抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性［6］。

Nrf2可通過協(xié)同誘導(dǎo)ARE驅(qū)動的細(xì)胞保護(hù)性基因轉(zhuǎn)錄來抵消氧化應(yīng)激、炎癥和線粒體功能障礙［7］；其中ARE的基因包括NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1），血紅素加氧酶-1（HO-1），超氧化物歧化酶1（SOD-1），過氧化氫酶1，谷胱甘肽過氧化物酶，谷胱甘肽還原酶，過氧化物酶等等。Nrf2的功能通過增加ARE下游基因表達(dá)來體現(xiàn)［8］。因此，Nrf2及其下游基因?qū)τ诩?xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。

2 椎間盤的結(jié)構(gòu)及Nrf2的表達(dá)

椎間盤（intervertebral disc,IVD）是一個復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，由周圍部的纖維環(huán)（anulus fibrosus,AF）、中間部的髓核（nucleus pulposus,NP）和連接上下椎體的軟骨終板（cartilage endplate,CEP）三部分構(gòu)成［9，10］。AF由一系列同心片層組成，主要由相互交替I型膠原纖維束構(gòu)成，提供抗拉強(qiáng)度；NP主要由富含II型膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）組成，其中蛋白聚糖是高負(fù)離子的物質(zhì)，提供滲透特性，使NP在壓縮載荷下保持高度和膨脹；CEP在結(jié)構(gòu)上將椎間盤固定在相鄰的椎骨上，其細(xì)胞外基質(zhì)主要富含II型膠原蛋白和蛋白多糖［11］。椎間盤退變的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)破壞增加，基質(zhì)合成異常，椎間盤高度喪失，導(dǎo)致神經(jīng)根受到壓迫，產(chǎn)生下腰痛。最近研究表明，IDD患者NP組織中Nrf2的表達(dá)隨著NP變性加重而逐漸降低，且Nrf2的缺乏會加劇NP細(xì)胞衰老［12］。因此，Nrf2的缺乏可能參與了IDD的發(fā)生發(fā)展。

3 Nrf2的表達(dá)受到非編碼RNA調(diào)控

最近研究表明，非編碼RNA（noncoding RNAs,ncRNAs）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并在IDD過程中起關(guān)鍵作用［13］。已經(jīng)證實(shí)多種miRNA參與細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，炎癥反應(yīng)及軟骨終板的退變［14］。最近研究表明，lncRNA能夠通過調(diào)節(jié)Nrf2的表達(dá)，參與IDD的進(jìn)程。Li等［15］用實(shí)時定量PCR分析臨床組織標(biāo)本，結(jié)果顯示LncRNA NEAT1表達(dá)水平隨IDD等級的增加而增加；在人NP細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染lncRNA NEAT1使其過表達(dá)，可導(dǎo)致Nrf2的表達(dá)降低。同樣，Kang等［16］用實(shí)時定量PCR檢測ln?cRNA ANPODRT的表達(dá)，結(jié)果顯示ANPODRT的表達(dá)隨著IDD等級的增加而減少；在NP細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染ANPODRT使其過表達(dá)，可以破壞Keap1與Nrf2締合，從而抑制其下游靶基因的激活。這些結(jié)果表明，表觀遺傳學(xué)中的ncRNAs可能調(diào)控Nrf2及其下游分子的表達(dá)，減緩IDD的發(fā)展 （圖1）。

4 Nrf2在IDD的作用機(jī)制

4.1 Nrf2在IDD中的抗氧化作用

氧化應(yīng)激可以定義為促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡，導(dǎo)致過量的活性氧（ROS）對細(xì)胞的損傷。ROS包括超過氧化陰離子（O2-），羥基自由基（-OH）和過氧自由基（ROO-），是正常細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的一種信號分子，可促進(jìn)細(xì)胞生存和組織更新或抑制細(xì)胞生存基因的表達(dá)［17，18］。研究表明，隨著IDD的進(jìn)展，IVD中的ROS產(chǎn)生增加［19］。過量ROS破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，可使NP細(xì)胞衰老和凋亡加速，且形成炎癥微環(huán)境，最終導(dǎo)致ECM降解增加。Nrf2在抑制氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用，能夠激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，包括NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1），血紅素加氧酶1（HO-1）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）等［20］。TBHP 和 H2O2是氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)劑。Tang等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的表達(dá)與人體椎間盤退變呈負(fù)相關(guān)，H2O2誘導(dǎo)大鼠NP細(xì)胞發(fā)生退變，導(dǎo)致Nrf2的表達(dá)降低。Ke?ap1基因沉默會抑制Keap1與Nrf2的解離，導(dǎo)致p62的表達(dá)增加，而其靶基因HO-1和NQO1的表達(dá)減少。Bai等［21］用免疫組化顯示嚴(yán)重IDD的患者NP存在較高水平的ROS，其研究證實(shí)Nrf2的過表達(dá)能減少ROS的水平，減輕氧化應(yīng)激的損傷。這些結(jié)果表明Nrf2基因可以調(diào)控NP細(xì)胞的退變過程。

最近的研究表明，多種化合物單體可以激活Nrf2基因的表達(dá)，保護(hù)NP細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，從而延緩IDD的進(jìn)展。金線蓮苷是從烏參中提取出來的一種活性化合物，具有肝保護(hù)和抗骨質(zhì)疏松癥等功能［22］。Wang 等［23］研究報道，金線蓮苷增加Nrf2的表達(dá)，減輕由TBHP誘導(dǎo)NP細(xì)胞中線粒體ROS的水平，而Nrf2敲除降低了金線蓮苷清除ROS的能力。金雀異黃素是豆科植物的天然類黃酮，具有抑制炎癥，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用［24］。在氧化應(yīng)激下，Wang等［25］報道了金雀異黃素可降低H2O2誘導(dǎo)NP細(xì)胞中ROS的水平，增加Nrf2以及下游分子HO-1和NQO1的表達(dá)；而Nrf2敲除會減弱金雀異黃素的抗氧化作用。茶多酚是綠茶中的主要多酚類化合物，對多種病理疾?。òò┌Y、糖尿病和心血管疾?。┚哂杏幸孀饔茫?6］。Song 等［27］研究表明，茶多酚增加Nrf2及其下游NOX4和SOD2的表達(dá)，減少ROS的產(chǎn)生，其抗氧化的機(jī)制是通過Keap1/Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮作用。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最豐富的類黃酮成分，能夠調(diào)控端粒和端粒酶的活性，延緩細(xì)胞的衰老［28］。Wang 等［29］發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以減輕體內(nèi)大鼠椎間盤退變，促進(jìn)退變NP細(xì)胞增殖，并抑制NP細(xì)胞中炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)。另外，Hua等［30］通過DCFH-DA探針檢測ROS的含量，H2O2刺激導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加；而用淫羊藿苷預(yù)處理可以增加NP細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，并且減少ROS的產(chǎn)生。同樣，蘿卜硫烷是一種來自于葡甘露聚糖的異硫氰酸鹽，能夠靶向激活Nrf2，減少ROS的產(chǎn)生［31］。這些研究結(jié)果表明Nrf2是調(diào)控ROS水平的關(guān)鍵調(diào)控因子。

線粒體是產(chǎn)生ROS的主要場所，線粒體功能障礙或線粒體損傷均會導(dǎo)致ROS的水平異常，對細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。其中線粒體靶向抗氧化劑Mitoqui?none（MitoQ）可防止線粒體氧化損傷［32］。Kang等［33］研究發(fā)現(xiàn)MitoQ可降低壓縮誘導(dǎo)下的人NP細(xì)胞中線粒體ROS的產(chǎn)生和Keap1蛋白表達(dá)，而增加Nrf2蛋白表達(dá)；Nrf2沉默部分消除了MitoQ對抗氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷作用。線粒體的抗氧化劑（Mito-TEMPO）可清除細(xì)胞內(nèi)的ROS。Kang等［34］研究發(fā)現(xiàn)Mito-TEMPO可降低H2O2誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞中線粒體ROS的升高，增加Nrf2蛋白及其靶標(biāo)SOD-2、HO-1和NQO-1的表達(dá)；而Nrf2敲除導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的水平增加。這些結(jié)果表明Nrf2參與線粒體功能的維持，從而減少氧化應(yīng)激的損害。此外，研究表明在軟骨終板細(xì)胞中，細(xì)胞自噬會影響Nrf2的表達(dá)和核易位，從而控制抗氧化蛋白的表達(dá)，保護(hù)軟骨終板免受氧化應(yīng)激引起的變性［35］（表1，圖1）。

4.2 Nrf2在IDD中的抗炎作用

IVD細(xì)胞或巨噬細(xì)胞所分泌的促炎性細(xì)胞因子的升高與IDD的進(jìn)展有關(guān)；在退化級聯(lián)反應(yīng)中，內(nèi)部AF和NP的血管形成，使巨噬細(xì)胞遷移到IVD中，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的放大，從而加速了IDD的進(jìn)程［36］。分泌的炎性介質(zhì)，特別是 TNF-α、IL-1α/β、IL-6、IL-8、IL-2、IL-17、IL-10、IL-4、IFN-γ 和PGE 2，促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)降解、衰老和凋亡［37］。最近研究表明，Nrf2通過協(xié)調(diào)炎癥細(xì)胞的募集和通過ARE調(diào)節(jié)基因表達(dá)來促進(jìn)抗炎過程［38］。因此，Nrf2信號通路可能是調(diào)控炎癥的重要途徑。

植物來源的單體化合物，例如漢黃芩素、槲皮素、金合歡素、桑辛素及姜黃素等的抗炎作用，是通過激活Nrf2基因的表達(dá)，從而保護(hù)NP細(xì)胞免受炎癥的損傷。Fang等［39］報道漢黃芩素激活大鼠NP細(xì)胞中Nrf2基因，以及SOD-2、NQO-1和HO-1基因的表達(dá)，抑制炎性介質(zhì)的表達(dá)；而Nrf2的沉默進(jìn)一步證實(shí)炎癥介質(zhì)的表達(dá)由Nrf2介導(dǎo)。Shao等［40］研究表明，槲皮素促進(jìn)Nrf2及其下游效應(yīng)蛋白HO-1的表達(dá)，抑制了IL-1β介導(dǎo)的NP細(xì)胞中IL-6和IL-8水平的升高。Wang等［41］發(fā)現(xiàn)金合歡素增加核內(nèi)Nrf2蛋白以及下游HO-1、NQO1和SOD的表達(dá)，抑制THBP誘導(dǎo)的炎癥因子iNOS和COX-2的表達(dá)。Gu等［42］用ELISA檢測炎癥因子的表達(dá)，結(jié)果顯示LPS刺激顯著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，Nrf2和HO-1水平下調(diào)；而桑辛素處理顯著增加了Nrf2和SOD的表達(dá)，減輕了炎癥因子的表達(dá)；而當(dāng)Nrf2基因被沉默時，桑辛素的抗炎作用被大大逆轉(zhuǎn)。Cherif等［43］用免疫組化顯示退化的椎間盤組織中Nrf2的表達(dá)減少；而經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，Nrf2的表達(dá)增加，ELISA顯示IL-6、IL-8的表達(dá)減少。小豆蔻素通過激活Nrf2/HO-1信號軸來抑制NP細(xì)胞中IL-1β誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)［44］。這些結(jié)果表明，Nrf2以及其下游的分子參與NP細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。因此，Nrf2可能是參與調(diào)控NP細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子 （表1，圖1）。

4.3 Nrf2改善IDD中的線粒體功能障礙

線粒體是IVD細(xì)胞中能量供應(yīng)的主要來源，其通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生三磷酸腺苷（Adenosine tri?phosphate,ATP）從而保證細(xì)胞的正常功能活動，并且也是ROS產(chǎn)生的貢獻(xiàn)者［45］。線粒體自噬會清除過多的ROS以維持線粒體穩(wěn)態(tài)；ROS水平過高導(dǎo)致線粒體功能障礙，觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡，加速IDD的進(jìn)展［37-46］。Drp1從細(xì)胞質(zhì)遷移到線粒體是線粒體裂變的先決條件。Kang等［33］研究發(fā)現(xiàn)壓縮增強(qiáng)Drp1向線粒體的易位；用線粒體裂變阻滯劑Mdivi-1處理NP細(xì)胞，Mdivi-1顯著抑制了Drp1向線粒體的易位。因此，線粒體結(jié)構(gòu)的完整對于線粒體穩(wěn)態(tài)和NP細(xì)胞存活至關(guān)重要。

研究證實(shí)，植物來源的單體化合物可以激活Nrf2基因，參與維持線粒體的結(jié)構(gòu)與功能。線粒體中的促凋亡蛋白Cytochrome C（Cyto C）釋放到細(xì)胞質(zhì)中，能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。金線蓮苷減少TBHP誘導(dǎo)的線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）的丟失，并抑制了Cyto C的釋放；而Nrf2的沉默減弱金線蓮苷對線粒體的保護(hù)作用［23］。Mito?Tracker Green是一種綠色熒光染料，能夠顯示活細(xì)胞中線粒體膜電位的高低。Wang等［47］用MitoTracker Green染色顯示白藜蘆醇可以減輕TNF-α誘導(dǎo)的NP細(xì)胞熒光強(qiáng)度的損失和ATP生成減少，并增加核Nrf2和HO-1的水平；Nrf2敲低顯示更弱的Mito?Tracker熒光強(qiáng)度，提示Nrf2在線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起保護(hù)作用。Hua等［30］用JC-1染色顯示線粒體的跨膜電位（ΔΨm）的強(qiáng)度，淫羊藿苷可以增加NP細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，并且降低H2O2刺激NP細(xì)胞中ΔΨm的產(chǎn)生，維持線粒體膜電位的穩(wěn)定。

除上述研究之外，線粒體的抗氧化劑（Mito-TEMPO） 通過增加Nrf2的表達(dá)降低H2O2處理引起終板軟骨細(xì)胞的ΔΨm產(chǎn)生，并且增加ATP的生成，減輕線粒體功能障礙［34］。這些結(jié)果表明，Nrf2可能通過改善線粒體的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)而延緩IDD的進(jìn)展（表1，圖1）。

圖1 Nrf2作用IDD可能的機(jī)制圖 多種不利因素刺激導(dǎo)致IVD細(xì)胞發(fā)生炎癥、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙，加速IDD的進(jìn)展。Nrf2的激活劑和非編碼RNA能夠調(diào)控Nrf2基因及其下游分子（NQO1、SOD、HO-1和NOX4）的表達(dá)、調(diào)節(jié)自噬，發(fā)揮抗氧化、抗炎、改善線粒體功能障礙，從而延緩IDD的發(fā)展

表1 Nrf2的激活劑

5 小結(jié)

Nrf2的表達(dá)與IVD的變性程度呈負(fù)相關(guān)，并且Nrf2的表達(dá)還受到表觀遺傳學(xué)的調(diào)控，因此，Nrf2基因與IDD的進(jìn)展密切相關(guān)。Nrf2除有上述抗氧化、抗炎、改善線粒體功能障礙的作用外，Nrf2還可通過誘導(dǎo)自噬蛋白p62和其他自噬相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)自噬，調(diào)控氧化應(yīng)激對髓核細(xì)胞的損害；很多從天然產(chǎn)物提取的化合物如金線蓮苷、金雀異黃素、茶多酚、淫羊藿苷、漢黃芩素、槲皮素和白藜蘆醇等可有效激活Nrf2，減輕氧化應(yīng)激、炎癥對IVD細(xì)胞的損傷，并維持線粒體的結(jié)構(gòu)與功能。另外，激活Nrf2對骨關(guān)節(jié)炎、慢性腎病、糖尿病等也有一定的改善作用。目前，有關(guān)Nrf2的研究大多是通過細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的，缺乏相應(yīng)的臨床依據(jù)。隨著對Nrf2基因不斷地深入研究，有望研制出靶向Nrf2的臨床藥物，為IDD的預(yù)防和治療提供新的方法和思路。