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    假單胞菌耐酸機(jī)制研究進(jìn)展

    2022-02-23 10:28:30蘇熠程誠王琪
    河北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:耐酸外排生物膜

    蘇熠,程誠,王琪

    (南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院,江蘇 南京210044)

    1 引言

    近年來,假單胞菌屬在生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)方面具有廣闊發(fā)展前景,在動植物和人類病原體醫(yī)學(xué)研究方面具有重要意義,因此受到人們越來越多的關(guān)注[1]。假單胞菌是重要的植物生長促生菌之一,其能夠快速生長,并在根際表現(xiàn)出良好的定殖能力[2];能夠產(chǎn)生抗生素、鐵載體和多糖,具有抑制土壤病原體的巨大潛力[3]。假單胞菌屬可以利用各種基質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì),并能在各種對于其他細(xì)菌來說很艱難的條件下生存。一些假單胞菌菌株可以通過產(chǎn)生葡萄糖酸從黑云母、長石和磷酸鹽等礦物中溶解鉀和磷以及其他元素[4~7],而分泌有機(jī)酸是根際細(xì)菌溶解含磷礦物的主要途徑[4]。由于質(zhì)子的分泌,植物根際環(huán)境通常呈酸性,pH值較非根際土壤低2個(gè)單位[8]。另外,一些經(jīng)過基因工程改造的假單胞菌已經(jīng)應(yīng)用于醛酸的高效生產(chǎn),在食品、化妝品和制藥行業(yè)廣泛應(yīng)用[9~11]。

    產(chǎn)酸假單胞菌對酸的耐受性,不僅能夠促使其更有效地風(fēng)化礦物[12],而且在其適應(yīng)酸性環(huán)境過程中也起重要作用。微生物內(nèi)部環(huán)境的酸化會增加細(xì)胞外滲透性,破壞細(xì)胞質(zhì)中生物大分子的結(jié)構(gòu)[13]。此外,細(xì)胞質(zhì)酸化會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),降低細(xì)胞內(nèi)酶的活性,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解并導(dǎo)致DNA損傷[14],因此細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的pH值通常接近中性[15]。假單胞菌已知和潛在的耐酸機(jī)制包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性、外排泵、堿性化合物的合成、能量代謝、DNA損傷修復(fù)、生物膜。深入理解假單胞菌菌株的耐酸機(jī)制,將有助于進(jìn)一步深入了解根際周圍植物和微生物之間的相互作用與機(jī)制,且能為微生物菌肥的研發(fā)與應(yīng)用、土壤有益元素活化、食品防腐工藝開發(fā)以及藥物研發(fā)等提供新的技術(shù)途徑。

    2 耐酸機(jī)制

    2.1 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性

    當(dāng)細(xì)菌暴露于酸性環(huán)境時(shí),細(xì)胞膜可能會發(fā)生一系列變化,包括囊泡形成、磷脂成分變化和細(xì)胞膜通透性降低[16~18]。研究表明,外部酸性環(huán)境可以作為細(xì)菌細(xì)胞壁應(yīng)激的信號[13],誘導(dǎo)細(xì)胞壁修復(fù)酶的合成,防止細(xì)胞壁降解。

    參與細(xì)胞壁和膜合成的物質(zhì)會對酸性環(huán)境產(chǎn)生反應(yīng)。如,青霉素結(jié)合蛋白(MrcA)是參與細(xì)胞壁肽聚糖(PNG)合成的主要酶,為構(gòu)成革蘭氏陰性細(xì)菌薄壁組織的重要成分[19]。脂多糖(LPS)是膜的主要成分,對膜的穩(wěn)定性起著重要作用。Kelly等[19]發(fā)現(xiàn),在革蘭氏陰性細(xì)菌遭受酸脅迫時(shí),負(fù)責(zé)PNG水解,催化細(xì)胞壁聚糖鏈斷裂的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶和裂解轉(zhuǎn)糖苷酶數(shù)量降低。

    參與膜穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)在假單胞菌的耐酸性中也起著重要作用。當(dāng)暴露于高濃度對香豆酸時(shí),ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體中的Ttg2ABC基因缺失會損害惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的正常生長[20]。據(jù)報(bào)道,這種轉(zhuǎn)運(yùn)體參與了抵抗其他脅迫的過程,如氧化脅迫、重金屬和抗生素以及甲苯[21]。外膜脂蛋白(VacJ)與大腸桿菌(Escherichia.coli)和志賀氏菌(Shigella flexneri)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān),也被認(rèn)為與惡臭假單胞菌對于對香豆酸和藥物的耐性有關(guān)[20]。在細(xì)胞膜將被破壞時(shí),VacJ在維持外膜穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[22,23],并且其缺失會導(dǎo)致外膜滲透性增加[23]。此外,乳酸(LBA)暴露后,熒光假單胞菌的機(jī)械敏感性離子通道蛋白上調(diào)。這種蛋白質(zhì)是滲透安全閥,可以防止細(xì)胞在低滲透性的休克期間因?yàn)槟B透屏障的短暫損傷而破裂[13]。

    2.2 外排泵

    外排泵能繞過周質(zhì)去除細(xì)胞中的有毒物質(zhì),有效提高細(xì)胞在有毒環(huán)境中的存活率[24]。通過應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和相關(guān)基因的刪除,Wang等[12]發(fā)現(xiàn),在添加黑云母的條件下,具有高效礦物風(fēng)化功能的生氮假單胞菌(P.azotosomes)菌株F77中編碼NADH脫氫酶的基因(包括nuoE、nuoF和nuoI)顯著上調(diào)。NADH脫氫酶和其他NADH-泛素氧化還原酶可以將H+泵出細(xì)胞,提高細(xì)胞內(nèi)部的pH值[25],從而緩解酸的脅迫效應(yīng)。

    超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MFS)可促進(jìn)各種底物(包括離子、糖磷酸鹽、藥物、氨基酸和肽)在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)膜上移動[26]。Ma等[27]證實(shí)了惡臭假單胞菌菌株KT2440中的MFS2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇PP_1271、PP_1272和PP_1273在耐受丙酸(PA)過程中的作用。PA是一種廣泛使用的食品防腐劑,對微生物生長具有顯著的抑制作用。因此,PA對菌株生長的抑制也是對其高效微生物發(fā)酵生產(chǎn)的巨大挑戰(zhàn)。PP_1271、PP_1272和PP_1273的過表達(dá)不僅促進(jìn)了菌株KT2440在丙酸鈉環(huán)境下正常生長,而且還增加了PA產(chǎn)量,這可能是MFS2轉(zhuǎn)運(yùn)體向細(xì)胞外不斷運(yùn)輸PA導(dǎo)致的[27,28]。

    能識別多種藥物的藥物外排泵稱為多藥外排泵,能通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)從細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)中向細(xì)胞外泵出多種抗生素,導(dǎo)致細(xì)菌能同時(shí)耐受多種藥物[29,30]。乳酸是一種多功能有機(jī)酸,天然存在于酸奶等發(fā)酵乳制品中,廣泛用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品。當(dāng)暴露于LBA時(shí),熒光假單胞菌(P.fluorescens)中的耐藥-結(jié)瘤-分裂(RND)型多藥外排泵數(shù)量上調(diào)。RND外排泵的表達(dá)受外界應(yīng)激因素的影響,如活性氧[31]。因此,外排泵可能是一種通用的菌體自我保護(hù)機(jī)制的一種,以對抗酸脅迫引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。

    2.3 堿性化合物的生成

    細(xì)菌通過產(chǎn)生堿性化合物(包括脲酶、腐胺、亞精胺和NH3+)來抵消細(xì)胞質(zhì)的酸化[32]。尿素酶能特定催化尿素水解成氨(NH3)和二氧化碳(CO2),從而中和細(xì)菌微生境中的酸。已有報(bào)道表明,提高尿素酶活性是幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的主要耐酸機(jī)制[31],其催化產(chǎn)生的NH3可以作為緩沖液離開菌體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),以NH4+的形態(tài)進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)空間。精氨酸脫胺酶(ADI)能將精氨酸分解為鳥氨酸、NH3和CO2。這些堿性化合物有助于提高細(xì)胞pH值來應(yīng)對酸性環(huán)境[33~35]。例如,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)通過ADI途徑產(chǎn)生NH4+,以獲得ATP來對抗酸脅迫[36]。

    研究發(fā)現(xiàn),生氮假單胞菌(P.azotoformans)F77主要通過生成葡萄糖酸和降低培養(yǎng)基的pH值來加速黑云母風(fēng)化[12]。在培養(yǎng)基中添加黑云母的條件下,當(dāng)菌株F77受到酸脅迫時(shí),負(fù)責(zé)編碼堿性物質(zhì)(如NH3、腐胺和亞精胺)的基因,包括ureD、ureC、ureaA、ureB、urgeG、ureJ、potF和orf02258顯著上調(diào)。生理試驗(yàn)結(jié)果也表明,在黑云母存在的低pH值條件下,F(xiàn)77菌株細(xì)胞內(nèi)NH3+的產(chǎn)生會增加。

    2.4 能量代謝

    由于耐酸菌株需要從細(xì)胞中運(yùn)送額外的質(zhì)子來維持細(xì)胞內(nèi)的pH值,因此,跨膜質(zhì)子能量是細(xì)菌很重要的耐酸機(jī)制之一[37]。H+-ATP酶是一種由多個(gè)亞基組成的酶,具有質(zhì)子轉(zhuǎn)移膜通道的功能[38],通過產(chǎn)生ATP為細(xì)胞在酸性環(huán)境中維持生存提供能量。這種酶可以利用質(zhì)子驅(qū)動力,通過消耗底物水平磷酸化產(chǎn)生的ATP將質(zhì)子從細(xì)胞中排出。因此,較高的H+-ATP酶和能量積累有利于細(xì)菌菌株維持pH值穩(wěn)態(tài)[39]。當(dāng)生氮假單胞菌和嗜熱乳桿菌(Lactobacillus thermophilus)分別處于低pH值環(huán)境時(shí),H+-ATP酶的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)[12,40]。

    編碼成熟細(xì)胞色素c系統(tǒng)的基因ccmCDEF和編碼硫氧化還原蛋白的基因dsbE對細(xì)菌耐受香豆酸意義重大。當(dāng)暴露于對香豆酸時(shí),ccmF和ccmC的缺失顯著抑制了惡臭假單胞菌KT2440的正常生長。細(xì)胞色素c成熟系統(tǒng)可以促進(jìn)血紅素基團(tuán)附著在周質(zhì)中的脫細(xì)胞色素c上,使c型細(xì)胞色素在細(xì)胞呼吸和ATP合成中發(fā)揮重要功能[41]。缺乏對香豆酸耐受性的功能操縱子,會使細(xì)胞表現(xiàn)出高能量需求或膜電位的破壞現(xiàn)象,導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放[42]。此外,大腸桿菌中參與能量代謝的基因(如nuo和cyo操縱子)相對豐度的增加,也證明能量代謝在由游離脂肪酸引起的應(yīng)激中起著重要作用[43]。

    2.5 DNA損傷修復(fù)

    乳糖酸(LBA)是一種多功能有機(jī)酸,天然存在于酸奶等發(fā)酵乳制品中,廣泛用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品[44]。LBA使食品中的主要腐敗菌熒光假單胞菌(P.fluorescens)具有良好的抗菌活性。Li等[13]應(yīng)用全理論片段離子質(zhì)譜(SWATH-MS)對熒光假單胞菌進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)LBA可能通過細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的積累在P.fluorescens中引起氧化應(yīng)激反應(yīng),同時(shí)誘導(dǎo)抗氧化酶/解毒酶對抗活性氧。ROS誘導(dǎo)的氧化損傷可能導(dǎo)致DNA損傷。為了應(yīng)對DNA損傷帶來的不利影響,細(xì)胞中形成了各種修復(fù)機(jī)制[45]。在P.fluorescens中,負(fù)責(zé)多聚磷酸(polyP)合成的多磷酸激酶(PPK)經(jīng)-LBA處理顯著上調(diào)。PolyP在各種應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)、運(yùn)動和生物膜形成中起著關(guān)鍵作用[46,47]。此外,PPK可以穩(wěn)定蛋白質(zhì),或刺激對高溫、酸和氧化條件敏感的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶MetA的抑制性變性聚集體的降解,來保護(hù)腸沙門氏菌(Salmonella enterica)免受弱有機(jī)酸脅迫[48]。LBA暴露后,分別介導(dǎo)核苷酸和堿基切除修復(fù)的常見DNA修復(fù)蛋白——UvrABC系統(tǒng)蛋白C(UvrC)和外脫氧核糖核酸酶Ⅲ(ExoⅢ)在P.fluorescens上調(diào)??偟膩碚f,酸脅迫導(dǎo)致DNA損傷,而PPK、UvrC和ExoⅢ被誘導(dǎo)產(chǎn)生來修復(fù)DNA損傷。

    2.6 生物膜

    生物膜是自然界微生物相互聚集的一種形式,是在細(xì)菌、細(xì)菌接觸表面以及細(xì)菌增殖中形成了具有一定三維空間結(jié)構(gòu)的群體,在這個(gè)群體的共同作用下,細(xì)菌粘附在接觸表面并產(chǎn)生了大量胞外聚合物(EPS)[49]。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí),如營養(yǎng)缺乏和酸脅迫,粘附在生物膜中的細(xì)菌將繼續(xù)進(jìn)化并向相鄰細(xì)胞傳播耐藥性,導(dǎo)致群體對不利環(huán)境的總體耐藥性顯著提高[50,51]。如生物膜內(nèi)的P.fluorescensNCM90也比游離細(xì)胞更耐酸性電解水[52]。

    在被細(xì)菌包裹的生物膜中通常有大量的EPS。這些EPS是一種有效的物理屏障,可以防止酸性物質(zhì)的滲透或氫離子的消耗[51],以確保細(xì)菌在生物膜中能正常生長。

    此外,生物膜的最內(nèi)層通常沒有可消耗的氧氣,形成了厭氧環(huán)境。同時(shí),一些細(xì)胞會可逆地進(jìn)入緩慢生長或低生長代謝狀態(tài)[53],在營養(yǎng)供應(yīng)受限等應(yīng)激反應(yīng)時(shí)降低對外部酸性環(huán)境的敏感性[54]。存活的菌株會降低生長速度,延長生長恢復(fù)時(shí)間,增加細(xì)菌膜的合成,從而細(xì)胞的耐受性增強(qiáng)[55]。

    群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)是一種細(xì)胞間信號傳遞過程,使細(xì)菌能夠集體控制基因表達(dá),從而協(xié)調(diào)一些僅在高種群密度下才能產(chǎn)生的活動。S-核糖同型半胱氨酸酶(LuxS)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)通過LuxS酶的活性產(chǎn)生一種自動誘導(dǎo)劑-2(AI-2)的通用信號分子,一般出現(xiàn)在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌中,用于種內(nèi)和種間通信。LuxS介導(dǎo)的QS可以調(diào)節(jié)細(xì)菌的重要生理特性,如毒力基因表達(dá)[56]、細(xì)胞運(yùn)動[57]、生物膜形成[58,59]、對酸和氧化應(yīng)激的耐受性[60,61]等。乳酸桿菌中,細(xì)胞的AI-2活性增加,luxS基因轉(zhuǎn)錄顯著增加[62],這表明luxS通過AI-2活性介導(dǎo)的群體感應(yīng)可能參與酸脅迫應(yīng)激反應(yīng)。QS在假單胞菌生物膜的形成中也有重要作用。如,銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)生物膜中胞外DNA(eDNA)的形成受QS系統(tǒng)控制[63]。因此,QS也可能在假單胞菌的耐酸性中發(fā)揮潛在作用。

    生物膜,尤其是較厚的生物膜,可能為細(xì)菌細(xì)胞提供一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境,以充分表達(dá)其適應(yīng)性生存機(jī)制。由于三維結(jié)構(gòu)、高細(xì)胞密度和擴(kuò)散障礙,生物膜內(nèi)不同位置的細(xì)菌細(xì)胞可能無法同時(shí)感受到相同程度的pH值。首先感受到pH值脅迫的細(xì)胞可能會迅速處理信息,并通過細(xì)胞間信號系統(tǒng)將信號傳遞給群體中的其他成員,啟動針對pH值脅迫的協(xié)調(diào)保護(hù)反應(yīng)去應(yīng)對可能致命的酸。與需要達(dá)到信號分子和細(xì)胞密度的臨界濃度的游離細(xì)胞不同,生物膜可以讓信號分子在局部環(huán)境中快速積累,從而更快地啟動協(xié)調(diào)活動[64,65]。此外,在生長速率、生長階段或代謝活動方面,生活在生物膜中的細(xì)菌細(xì)胞的生理狀態(tài)是混雜的。這允許細(xì)胞以不同的方式對壓力做出反應(yīng)。顯然,生物膜內(nèi)的菌體細(xì)胞相對于游離細(xì)胞,有更多的時(shí)間、足夠的信號分子濃度和較高的群體密度來適應(yīng)外部環(huán)境[66]。

    3 總結(jié)與討論

    假單胞菌在自然環(huán)境中面臨各種生物、非生物脅迫,在自然壓力的選擇下,假單胞菌進(jìn)化出多種適應(yīng)性機(jī)制,表現(xiàn)出豐富的代謝多樣性。假單胞菌在溶解土壤礦物、促進(jìn)植物生長、防控植物病原菌、生物修復(fù)污染物等方面具有重要意義。高通量測序技術(shù)和模式生物脅迫機(jī)制的建立推動了對重要生物脅迫機(jī)制的分析,但是目前關(guān)于假單胞菌耐酸機(jī)制的研究仍然有限,有待進(jìn)一步深入研究。

    現(xiàn)有關(guān)于假單胞菌的研究多采用菌株全基因組分析結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析等多組學(xué)技術(shù),通過比較假單胞菌在有/無酸脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組或蛋白組的變化,篩選與酸脅迫相關(guān)功能基因或蛋白,并結(jié)合q-RT PCR、基因敲除對其功能進(jìn)行驗(yàn)證。但是,相關(guān)功能基因?qū)賳伟砩匦约按x物的影響仍缺乏深入、系統(tǒng)的研究。今后的研究不僅需要利用多組學(xué)技術(shù)發(fā)掘與假單胞菌耐酸相關(guān)的候選基因,更要投入大量精力揭示潛在的耐酸基因功能。

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