功能化自組裝肽水凝膠在細胞培養(yǎng)中應(yīng)用

張書筠，于 鑫，丁 晨，林 曉，朱 偉

（牡丹江醫(yī)學院 免疫教研室，黑龍江 牡丹江157011）

細胞培養(yǎng)是生物醫(yī)學領(lǐng)域中重要研究方法，在研究細胞功能、探討疾病發(fā)病機制中發(fā)揮巨大作用。細胞在體內(nèi)處于三維環(huán)境，接收微環(huán)境中物理、化學信號，維持細胞生物學功能，并且通過增殖或分泌因子，對受損組織進行修復(fù)［1－2］。傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)屬于二維細胞培養(yǎng)，沒有細胞外基質(zhì)支持，長時間培養(yǎng)將影響細胞形態(tài)特征及生長、分化等生物學功能［3］。因此，越來越多的學者研究三維支架材料制備及材料與細胞間相互作用，期望能更好模擬細胞體內(nèi)微環(huán)境，保證微環(huán)境結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及體外細胞培養(yǎng)的直觀性、可控性［4］。雖然這些材料在一定程度上模擬細胞微環(huán)境和細胞與細胞外基質(zhì)間的信號，但仍然存在一些問題，如高感染風險率、較差相容性等。理想細胞支架通常應(yīng)具備適合細胞生長的孔徑、良好相容性、可降解產(chǎn)物無毒及易于合成等特點［5］。

自組裝肽水凝膠是通過對多肽分子的構(gòu)成氨基酸序列進行設(shè)計，在特定條件下，可以使得多肽分子自發(fā)組裝。由于大部分多肽鏈本身并不具備直接自組裝成凝膠的性能，需要向體系中引入一些能夠起到橋連作用的分子，誘導水凝膠的形成。通常的橋連劑包括蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子表面活性劑等［6］。功能化自組裝多肽水凝膠是在設(shè)計多肽鏈時增加功能基序，或者在多態(tài)水凝膠結(jié)構(gòu)中嵌入生長因子、轉(zhuǎn)化因子等細胞因子，從而滿足不同細胞生長需要。

1 自組裝肽水凝膠概述

早在20世紀90年代，就有研究人員在酵母蛋白中發(fā)現(xiàn)一種天然蛋白序列Zuotin，其具有β折疊結(jié)構(gòu)，能自發(fā)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［7］?？茖W家們從中受到啟發(fā)，利用氨基酸的基本特性，根據(jù)需要設(shè)計出不同的多肽鏈形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，在合適的條件下，通過范德華力、疏水作用、π-π堆積力等相互作用，使得其能自發(fā)形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，自組裝肽序列的設(shè)計得到不斷優(yōu)化，逐漸形成第一代自組裝肽。第一代自組裝肽序列特征是帶電親水性及疏水性氨基酸周期性交替排列。在納米纖維親水性表面上，帶有正、負電荷氨基酸殘基重復(fù)性的交替排列，有助于互補的離子相互作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并進一步形成含水量超過99.5%的水凝膠支架［8－10］（圖1）。為提高自組裝肽生物學活性，近年來研究人員在第一代自組裝肽氨基酸序列基礎(chǔ)上，加入功能性基序，合成具有生物學活性的功能性自組裝肽水凝膠即第二代自組裝肽［11］。

圖1 自組裝肽水凝膠的形成過程［10］Fig.1 Formation of self-assembled peptide hydrogels［10］

功能性自組裝肽制備方法通常是將功能性基序通過甘氨酸連接到自組裝肽C末端，不同功能性基序賦予自組裝肽不同細胞特異性，目前研究發(fā)現(xiàn)的功能基序及其作用見表1［11－19］。

表1 自組裝肽水凝膠的常見功能基序Table 1 Common functional motifs of self-assemble peptide hydrogels

除上述功能化基序外，生長因子、轉(zhuǎn)化因子等可溶性蛋白也可直接或間接固定在自組裝肽水凝膠上，為細胞提供信號刺激，有助于效應(yīng)分子停留在靶標部位，并且以受控的方式向四周釋放［20］。如攜帶胰島素樣生長因子Ⅰ［21］或血管內(nèi)皮生長因子［22］的自組裝肽納米纖維NFs水凝膠，將其注射到實驗性心肌梗死的動物模型體內(nèi)，可刺激缺血部位血管內(nèi)皮細胞增生，改善心肌缺血缺氧狀態(tài)，并加快組織再生。

雖然功能性自組裝肽具有良好生物學活性，但其剛度與實際的組織匹配度較差，因此近年來研究人員將自組裝肽水凝膠與惰性生物材料混合制成復(fù)合材料，以此為細胞培養(yǎng)提供更接近于體內(nèi)的微環(huán)境。Sheikholeslam等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在碳納米管中離子互補型肽EFK8（FEFEFKFK）分散存在，加入單價鹽溶液，觸發(fā)形成EFK8-SWNT水凝膠，可增強NIH- 3T3、A549細胞的附著、擴散及增殖；同時他們發(fā)現(xiàn)，改變水凝膠剛度不影響NIH -3T3細胞的行為，但可使A549細胞形態(tài)從球狀轉(zhuǎn)變?yōu)槔鞈B(tài)。Anderson等［24］研究發(fā)現(xiàn)，不同類型細胞，其培養(yǎng)底物剛度閾值不同。Xu等［25］在自組裝肽水凝膠中加入羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）可以增加穩(wěn)定性，同時促進MC3TC -E1細胞分化。這些結(jié)果表明：將惰性材料與水凝膠混合可擴大自組裝肽水凝膠在組織工程中的應(yīng)用范圍。

2 功能化自組裝肽水凝膠在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

2.1 對干細胞移植和培養(yǎng)的促進作用

干細胞移植治療在臨床上表現(xiàn)出明顯的治療效果，但是由于受損組織存在不同程度炎癥反應(yīng)，會影響干細胞的活性和數(shù)量，而生物材料可為干細胞提供生長環(huán)境，促進干細胞增殖和分化。Luo等［26］研究發(fā)現(xiàn)：用腺病毒轉(zhuǎn)載修飾間充質(zhì)干細胞（MSC）的人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子hBDNF的基因，并用PRG基序修飾RADA16（Ac -（RADA）4-CONH2）水凝膠來培養(yǎng)，可促進細胞向支架內(nèi)部遷移，增加細胞活性而且誘導分化為神經(jīng)元。此外，Cai等［18］將QHREDGS基序修飾RADA16形成新的自組裝肽水凝膠DSAP，將DSAP包裹的MSC進行體內(nèi)外研究時發(fā)現(xiàn)：DSAP -MSC可通過活化AKT，促進胰島素樣生長因子Ⅰ、肝細胞生長因子表達，減少心肌細胞凋亡，保護在氧和葡萄糖缺乏環(huán)境中的心肌細胞，可使心肌梗死模型鼠梗死區(qū)域膠原蛋白含量降低，心肌細胞凋亡和梗死面積減少；同時，DSAP -MSC也可促進心肌梗死模型鼠梗死區(qū)域微血管的形成，改善心臟功能。這些研究結(jié)果表明：功能性自組裝肽水凝膠可以作為傳遞系統(tǒng)為干細胞治療治療心肌梗死提供新的方法和策略。

在自組裝肽水凝膠中添加功能性基序不僅可以促進間充質(zhì)干細胞黏附、生存，而且可以促進干細胞向成骨和軟骨細胞分化。Tavakol等［27］將骨髓歸巢肽1（BMHP1）基序通過甘氨酸與自組裝肽RADA4結(jié)合形成水凝膠R -BMHP1，R-BMHP1不但能增強骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）的生存能力，而且R -BMHP1納米纖維的拓撲結(jié)構(gòu)與骨成型蛋白受體1A產(chǎn)生強靜電相互作用，觸發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導，導致BMSC成骨基因過度表達，發(fā)生鈣沉積。這項研究表明，R -BMHP1具有成為成骨修復(fù)支架的可行性。

利用脫細胞技術(shù)，去除軟骨組織細胞成分和遺傳物質(zhì)，保留細胞外基質(zhì)成分及其力學性能，制備脫軟骨細胞基質(zhì)（ACM）支架，該支架不僅可模擬軟骨細胞體內(nèi)生存微環(huán)境，而且促進MSC附著、增殖及分化為軟骨細胞［28-29］。為促進干細胞的培養(yǎng)，Lu等［30］將ACM支架與RAD／PFS功能化自組裝肽結(jié)合，形成復(fù)合水凝膠支架ACM／RAD／PFS培養(yǎng)MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACM／RAD／PFS混合水凝膠促進MSC附著、增殖、軟骨分化。同時，Mushahary等［31］研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)合水凝膠支架中，PFS基序有助于快速有效地招募間充質(zhì)干細胞，為組織再生開辟新途徑。

功能化自組裝肽水凝膠還可用于神經(jīng)干細胞（NSC）的三維細胞培養(yǎng)。Mehrban等［32］在α-螺旋卷曲肽形成的自組裝水凝膠hSAF上添加RGDS基序，微管相關(guān)蛋白2表達增加，而膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達減少；與未修飾的hSAF相比，hSAF -RGDS促進NSC向成熟神經(jīng)元分化，形成更大神經(jīng)球。另外，RGDS基序還可促進NSC定向遷移。

自組裝肽水凝膠的功能性基序可促進干細胞黏附、分化，增強細胞活性。除此之外，自組裝肽水凝膠的力學性能也可影響干細胞活性。如：Farrukh等［33］將多聚賴氨酸（PL）和IKVAV基序分別通過胺基、硫醇基與聚丙烯酰胺（PA）結(jié)合，制成雙功能水凝膠，研究在PL和IKVAV基序協(xié)同作用下，其剛性對胚胎和成人神經(jīng)元干細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在胚胎干細胞培養(yǎng)中，將雙功能水凝膠剛度調(diào)至2 kPa，可促進胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元分化，形成包含β-整聯(lián)蛋白的黏著斑；在成人神經(jīng)干細胞培養(yǎng)中，水凝膠剛度調(diào)至20 kPa，可促進NSC細胞存活、成熟、神經(jīng)突起生長以及神經(jīng)再生。這表明自組裝肽水凝膠支架的力學性能具有引導干細胞行為的潛力。

2.2 對成骨細胞的增殖作用

功能化自組裝肽水凝膠不僅可以為成骨細胞提供三維環(huán)境，還可以誘導骨細胞分泌骨特異性蛋白。Horii等［19］在自組裝肽水凝膠RADA16上添加功能性基序ALK、DGR和PGR，可有效促進成骨細胞MC3T3-E1增殖，并促使細胞向三維支架遷移。Tsutsumi等［34］研究發(fā)現(xiàn)：兩親性肽E1Y9（Ac- EYEYKYEYKY -NH2）自組裝水凝膠，具有為磷酸鈣礦化儲備Ca2＋優(yōu)點，將ALK、DGR、PGR和RGD基序與E1Y9制成混合水凝膠，所有功能化的E1Y9／E1Y9混合水凝膠對MC3T3-E1細胞均表現(xiàn)出良好黏附能力和相容性。特別是E1Y9-ALK／E1Y9混合水凝膠可明顯促進細胞增殖，增加堿性磷酸酶、骨橋蛋白的表達，且細胞外基質(zhì)有明顯礦化現(xiàn)象。

2.3 對血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的促進作用

Liu等［16］將功能性基序PRG、KLT復(fù)合到自組裝肽RADA16上，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PRG、KLT可明顯提高自組裝肽RADA16的生物活性，并為內(nèi)皮細胞遷移和出芽提供理想的微環(huán)境。其中，KLT／RADA16表現(xiàn)出更好血管生成活性，在無血管內(nèi)皮生長因子時，仍可以在支架中形成新的毛細血管。為體外培養(yǎng)HUVEC提供類似于細胞外基質(zhì)力學抗性結(jié)構(gòu)，Martínez-Ramos等［35］將聚丙烯酸乙酯（PEA）支架與RAD16結(jié)合形成混合自組裝肽水凝，經(jīng)流式細胞儀和掃描電鏡檢測發(fā)現(xiàn)：混合自組裝肽水凝膠可增加細胞存活率、增殖，促進細胞間交流。由此可見，功能性自組裝肽水凝膠是體外內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的良好生物底物。

2.4 對腫瘤細胞的抑制作用

自裝肽水凝膠RADA16可以構(gòu)建三維腫瘤細胞培養(yǎng)模型［36］，并且在腫瘤細胞惡性表型逆轉(zhuǎn)方面發(fā)揮效應(yīng)［37］?；赗ADA16在腫瘤細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，Liu等［38］設(shè)計出RADA-KLA（RADARADARADARADARADARADARADARADAGGKLAKLAKKLAKLAK-NH2）功能化自組裝肽水凝膠，培養(yǎng)HepG2細胞后發(fā)現(xiàn)，RADA -KLA水凝膠能夠誘導細胞死亡，降低細胞存活率和抑制細胞黏附和遷移。這說明，RADA -KLA在體外具有抗腫瘤作用，但是在體內(nèi)的作用仍需要進一步研究。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，自組裝肽水凝膠制備過程中可通過改變氨基酸序列、添加功能性基序等方式，設(shè)計出具有特定性能自組裝肽水凝膠，為不同類型組織細胞培養(yǎng)提供合適的細胞外基質(zhì)。自組裝肽具有可降解、低免疫原性、生物相容性好等優(yōu)勢，但自組裝肽應(yīng)用仍然面臨很多挑戰(zhàn)，例如：如何調(diào)整制備條件得到具有理想結(jié)構(gòu)自組裝肽，怎樣進一步提高功能性自組裝肽生物學活性等。因此，仍需研究者更深入探討，使自組裝肽走向成熟，在細胞培養(yǎng)中發(fā)揮更大作用。