液液微萃取結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物

孫細(xì)珍,熊亞青,唐娟,杜佳煒,錢全全,陳雅慧

1(勁牌有限公司,湖北 黃石,435100) 2(中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃石,435100)

GB/T 17204—2021《飲料酒術(shù)語和分類》中將乙醇體積分?jǐn)?shù)在0.5%以上的酒精飲料定義為飲料酒,包括發(fā)酵酒、蒸餾酒以及配制酒。揮發(fā)性酚類化合物是飲料酒的重要香味組分,對(duì)飲料酒的香氣、口味以及穩(wěn)定性等方面均具有重要的作用[1]。此外研究表明,酚類物質(zhì)還具有一定的生理活性[2]。它們主要來源于釀酒原料中的阿魏酸、木質(zhì)素、單寧等,經(jīng)過細(xì)菌和酵母的發(fā)酵形成,或是由微生物轉(zhuǎn)化制曲過程的中間產(chǎn)物形成[3]。

揮發(fā)性酚類物質(zhì)對(duì)飲料酒的產(chǎn)品品質(zhì)有較大影響[4],準(zhǔn)確定量分析飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物對(duì)研究產(chǎn)品風(fēng)味質(zhì)量、調(diào)控優(yōu)化生產(chǎn)工藝具有重要意義。目前,已報(bào)道的酒樣中微量成分的前處理方法主要有直接進(jìn)樣、固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)、液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、固相萃取(solid phase extraction,SPE)、攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)等方法[5]；揮發(fā)性酚類化合物的檢測(cè)方法主要是上述前處理方法與GC、GC-MS、HPLC等方法聯(lián)合使用[6-8]。2010年朱燕等[9]應(yīng)用SPME和GC-MS分析白酒中游離揮發(fā)性酚類化合物,發(fā)現(xiàn)不同香型成品白酒中這些揮發(fā)性酚類化合物的種類、質(zhì)量濃度差異較大,其中濃香型成品白酒中酚類物質(zhì)總質(zhì)量濃度較高。2017年孫嘯濤等[10]采用渦旋輔助LLE結(jié)合GC-MS法建立了白酒中4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚的檢測(cè)方法,不同添加水平的平均回收率為80.1%～88.0%。2018年趙雅敏等[11]采用液液微萃取(liquid-liquid microextraction,LLME)結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)建立了1種檢測(cè)飲料酒中9種揮發(fā)性酚類化合物的方法。飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物性質(zhì)差異較大、質(zhì)量濃度低,選擇適合的提取方法至關(guān)重要。SPME方法具有操作簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)[5],但是萃取效果會(huì)受到較多因素的影響且基質(zhì)影響嚴(yán)重[12]；SBSE方法具有萃取容量高等優(yōu)點(diǎn)[5],但該方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作步驟多[12]。與傳統(tǒng)LLE相比,LLME 具有加快萃取平衡速率、提高萃取效率的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)減少低沸點(diǎn)化合物的損失[13]。HPLC常用于難揮發(fā)性物質(zhì)分析,不適于揮發(fā)性酚類化合物的定量分析；相較于GC-MS,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)具有選擇性高、定量更準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)[14],目前LLME結(jié)合GC-MS/MS在揮發(fā)性酚類化合物分析方面的應(yīng)用還少有報(bào)道。

本研究采用LLME結(jié)合GC-MS/MS,通過對(duì)萃取溶劑、酒樣酒精度、酒樣加入NaCl質(zhì)量濃度、靜置時(shí)間4個(gè)影響因素進(jìn)行單因素考察,建立了1種定量飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物的方法,相較于SPME-GC-MS方法,本方法萃取效率和準(zhǔn)確度更高。進(jìn)一步,使用該方法定量分析了5種不同香型白酒、威士忌及保健酒共35個(gè)樣品中的揮發(fā)性酚類化合物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10種揮發(fā)性酚類化合物在不同類型飲料酒中的質(zhì)量濃度具有較大差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共35個(gè)實(shí)驗(yàn)酒樣,樣品信息見表1。

表1 樣品信息列表Table 1 Information of test samples

標(biāo)準(zhǔn)品與試劑：苯酚、4-甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基苯酚、丁子香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚、4-甲基苯酚-d7、2-甲氧基-d3-苯酚、4-乙基苯酚-d10、丁子香酚-d3,均為色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；無水乙醇、無水乙醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷,均為色譜純,德國(guó)CNW公司；NaCl、Na2SO4,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用水為本實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB135-S十萬分之一電子分析天平,瑞士Mettler-Toledo公司；FA2004萬分之一天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司；Multi Reax渦旋振蕩儀,德國(guó)海道夫儀器公司；3K15高速離心機(jī),美國(guó)SIGMA公司；SK8200HP超聲波清洗器,上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；8890B—7000D氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)、7890B-5977C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),美國(guó)Agilent科技有限公司；MPS 2多功能樣品前處理平臺(tái),德國(guó)Gerstel公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取頭,美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 目標(biāo)化合物混合溶液的配制

以無水乙醇為溶劑配制苯酚、4-甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基苯酚、丁子香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚共10種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度均為10.0 mg/L。以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液為溶劑將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋20倍,標(biāo)識(shí)為Model樣品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制

以乙酸乙酯為溶劑配制苯酚、4-甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基苯酚、丁子香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚共10種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度均為5.0 mg/L。用乙酸乙酯將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,質(zhì)量濃度依次為2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L。

1.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

以乙酸乙酯為溶劑配制2-甲氧基-d3-苯酚(IS1)、4-甲基苯酚-d7(IS2)、4-乙基苯酚-d10(IS3)、丁子香酚-d3(IS4)共4種化合物混合溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液,質(zhì)量濃度均為5.0 mg/L。

1.3.4 樣品前處理

1.3.4.1 LLME法的優(yōu)化

采用單因素法依次優(yōu)化萃取溶劑(乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正已烷)、酒樣酒精度(體積分?jǐn)?shù)依次為10%、20%、30%、40%、50%、60%)、酒樣中加入NaCl質(zhì)量濃度(0、0.12、0.24、0.36 g/mL)、靜置時(shí)間(2、4、8、12、24 h)4個(gè)影響因素。萃取溶劑的選擇：準(zhǔn)確吸取4 mL 1.3.1中所述Model樣品于50 mL離心管中,稀釋至體積分?jǐn)?shù)為10%,加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液,混合均勻,加入NaCl飽和,振搖5 min,再分別加入2 mL不同萃取溶劑,振搖5 min,超聲10 min,以8 000 r/min離心10 min,靜置12 h,收集上層萃取液,加入無水Na2SO4置于冰箱冷凍室(-18 ℃)內(nèi)干燥過夜,過濾后所得樣液用于GC-MS/MS分析。其他3個(gè)因素依次進(jìn)行優(yōu)化。上述實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.2 酒樣前處理

準(zhǔn)確吸取1.1中所述酒樣4 mL于50 mL離心管中,采用上述優(yōu)化后的方法進(jìn)行前處理,所得樣液,用于GC-MS/MS分析。

1.3.5 分析條件

氣相色譜條件：載氣為高純He(純度≥99.999%),恒流模式,流速為1.0 mL/min；升溫程序?yàn)槌鯗?0 ℃,保持1 min,以20 ℃/min升至180 ℃,再以3.5 ℃/min升至240 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃,進(jìn)樣量為1 μL,不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源(EI Xtr350)能量為70 eV；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；輔助通道加熱溫度280 ℃；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(dMRM)。10種酚類物質(zhì)和4種同位素內(nèi)標(biāo)物經(jīng)GC-MS/MS進(jìn)行SCAN模式的全掃描(m/z30～550),得到全掃描質(zhì)譜圖。選擇豐度較高,質(zhì)荷比合適的碎片離子作為母離子,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,從二級(jí)質(zhì)譜圖中選擇響應(yīng)較高的碎片離子作為子離子。通過改變碰撞電壓來優(yōu)化能量,最終選取表2中的保留時(shí)間和質(zhì)譜特征離子對(duì)。

表2 十種揮發(fā)性酚類化合物保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì) 和碰撞電壓表Table 2 The retention time,monitoring ion pair,and collision voltage for 10 phenols

2 結(jié)果與分析

2.1 LLME方法中4個(gè)優(yōu)化因素對(duì)揮發(fā)性酚類物質(zhì)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了4個(gè)因素(萃取溶劑、酒樣酒精度、酒樣加入NaCl質(zhì)量濃度、靜置時(shí)間)對(duì)LLME萃取10種目標(biāo)揮發(fā)性酚類化合物的結(jié)果影響,取1 mL 1.3.2中與Model樣品相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液于樣品瓶中,加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液,混合均勻后直接進(jìn)樣,以內(nèi)標(biāo)峰面積法計(jì)算Model樣品中10種揮發(fā)性酚類化合物的質(zhì)量濃度和回收率,分析結(jié)果如圖1所示。

由于待測(cè)酚類化合物種類較多,理化性質(zhì)存在差異,選擇的萃取溶劑需考慮多種酚類的萃取效果,實(shí)驗(yàn)比較了乙醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷分別為萃取溶劑時(shí)揮發(fā)性酚類化合物的萃取效果(圖1-a)。4種有機(jī)溶劑的萃取效果從優(yōu)到差依次為乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正已烷,其中以乙酸乙酯萃取溶劑時(shí),酚類化合物的萃取效果最佳,10種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為95.81%～102.49%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)<5%,這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酚類化合物的化學(xué)性質(zhì)較為吻合,因此選擇乙酸乙酯作為酚類化合物的萃取溶劑。

由于樣品中酒精體積分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效果存在影響,實(shí)驗(yàn)通過調(diào)整酒精度的方法,考察了60%、50%、40%、30%、20%、10%酒精體積分?jǐn)?shù)水平下?lián)]發(fā)性酚類化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1-b)。部分酚類化合物的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨著酒精度的增加出現(xiàn)下降趨勢(shì),酒精度為10%時(shí),酚類化合物的萃取效果最佳,10種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為99.67%～102.49%,且RSD<5%,因此實(shí)驗(yàn)確定樣品萃取酒精度為10%；對(duì)于酒精度低于10%的樣品,可以直接萃取,無需稀釋步驟。

Na+可以改變樣品溶液中水相的極性,影響萃取效果,實(shí)驗(yàn)通過加入質(zhì)量濃度0、0.12、0.24、0.36 g/mL 的NaCl溶液測(cè)定了揮發(fā)性酚類化合物的萃取效果(圖1-c),加入NaCl質(zhì)量濃度為0.36 g/mL,即飽和狀態(tài)時(shí),酚類化合物的萃取效果最佳,10種揮發(fā)性酚類化合物的加標(biāo)回收率為99.67%～102.49%,且RSD<5%,因此實(shí)驗(yàn)選擇加入質(zhì)量濃度為0.36 g/mL的NaCl為后續(xù)樣品前處理實(shí)驗(yàn)條件。

為了水相和有機(jī)相達(dá)到最佳的分離狀態(tài),樣品萃取過程需進(jìn)行靜置。實(shí)驗(yàn)考察了2、4、8、12、24 h共5個(gè)靜置時(shí)間下酚類化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1-d),酚類化合物的萃取效果隨靜置時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),當(dāng)靜置時(shí)間達(dá)到12 h后,回收率趨于穩(wěn)定,10種揮發(fā)性酚類化合物的加標(biāo)回收率為98.81%～102.13%,且RSD<5%,綜合考慮工作效率,選擇12 h作為最佳靜置時(shí)間。

2.2 LLME方法參數(shù)的確認(rèn)

綜上所述,LLME最優(yōu)萃取條件為：以乙酸乙酯為萃取溶劑,酒樣酒精度稀釋至體積分?jǐn)?shù)為10%,加入0.36 g/mL NaCl溶液,靜置時(shí)間為12 h；在該優(yōu)化條件下,Model樣品中10種揮發(fā)性酚類化合物均具有良好的峰形,GC-MS/MS色譜圖如圖2所示。

a-萃取溶劑；b-酒樣酒精度；c-NaCl質(zhì)量濃度；d-靜置時(shí)間圖1 萃取溶劑、酒樣酒精度、酒樣加入NaCl質(zhì)量濃度、靜置時(shí)間對(duì)LLME結(jié)果的影響Fig.1 Effect of LLME parameters:extraction solvent,alcoholic content of liquor,NaCl concentration, resting time on the extraction efficiency of volatile compounds

1-2-甲氧基-d3-苯酚；2-愈創(chuàng)木酚；3-4-甲基愈創(chuàng)木酚；4-苯酚；5-4-乙基愈創(chuàng)木酚；6-4-甲基苯酚-d7；7-4-甲基苯酚；8-4-乙基苯酚-d10；9-丁子香酚-d3；10-丁子香酚；11-4-乙基苯酚；12-4-乙烯基愈創(chuàng)木酚；13-2,6-二甲 氧基苯酚；14-2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚圖2 十種酚類化合物的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatogram of 10 phenol compounds

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限

將1.3.2中8個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)入GC-MS/MS分析,獲得10種目標(biāo)酚類化合物與4種內(nèi)標(biāo)物的峰面積,以各化合物與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)(y),以相應(yīng)質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各待測(cè)化合物的線性方程。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限(limit of detection,LOD),以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算定量限(limit of quantitation,LOQ),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。10種揮發(fā)性酚類化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2均大于0.998,10種揮發(fā)性酚類化合物的LOD為1.0～10.0 μg/L,LOQ為3.5～35.0 μg/L,表明該方法具有良好的線性和靈敏度。

表3 10種酚類化合物的線性范圍、線性關(guān)系、檢出限及定量限Table 3 Linear range,linear equations,LODs,and LOQs of 10 phenols

2.3.2 回收率與精密度

以酚類化合物質(zhì)量濃度較低的酒樣XQJ-3為基質(zhì),分別按照高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定,每個(gè)濃度水平共6個(gè)平行樣,目標(biāo)化合物的回收率和精密度見表4。10種酚類化合物在不同濃度下的添加回收率為92.3%～100.7%,RSD為0.3%～3.7%。本方法的準(zhǔn)確度與精密度均符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。

表4 十種酚類化合物的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of 10 phenols in liquor samples (n=6)

2.3.3 方法的對(duì)比分析

將本實(shí)驗(yàn)建立的LLME-GC-MS/MS與HS-SPME-GC-MS方法進(jìn)行對(duì)比。根據(jù)2.3.2的方法,以酒樣XQJ-3為基質(zhì),分別按照高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定,每個(gè)濃度水平共6個(gè)平行樣,分別采用LLME-GC-MS/MS與HS-SPME-GC-MS方法進(jìn)行分析。HS-SPME-GC-MS參照文獻(xiàn)[15]的方法稍做改進(jìn),將上述待測(cè)樣品用超純水稀釋至體積分?jǐn)?shù)10%,取8 mL稀釋液于20 mL頂空瓶中并加NaCl至飽和,加入20.0 μL內(nèi)標(biāo)溶液充分混合并在50 ℃下孵育5 min以達(dá)到平衡,將固相微萃取纖維頭(先行在250 ℃下老化30 min)插入頂空瓶中并萃取45 min,定期振動(dòng)(每振動(dòng)10 s后停止2 s),萃取結(jié)束后將纖維頭插入GC-MS進(jìn)樣口,在250 ℃下解吸5 min,進(jìn)行GC-MS分析,計(jì)算10種目標(biāo)化合物的回收率和精密度,2種方法的結(jié)果如圖3所示。采用HS-SPME-GC-MS方法測(cè)定時(shí),10種揮發(fā)性酚類化合物的回收率為88.4%～95.2%,RSD為3.6%～11.3%?；厥章事缘陀诒緦?shí)驗(yàn)建立的LLME-GC-MS/MS方法,而方法的重復(fù)性則明顯不及LLME-GC-MS/MS。表明該實(shí)驗(yàn)建立的方法在測(cè)定飲料酒中10種揮發(fā)性酚類化合物時(shí),具有更為準(zhǔn)確而穩(wěn)定重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。

1-愈創(chuàng)木酚；2-4-甲基愈創(chuàng)木酚；3-苯酚；4-4-乙基愈創(chuàng)木酚； 5-4-甲基苯酚；6-丁子香酚；7-4-乙基苯酚； 8-4-乙烯基愈創(chuàng)木酚；9-2,6-二甲氧基苯酚； 10-2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚圖3 采用LLME-GC-MS/MS與HS-SPME-GC-MS分析10種 揮發(fā)性酚類化合物回收率對(duì)比圖Fig.3 Comparison of recoveries of 10 phenols in liquor samples by LLME-GC-MS/MS and HS-SPME-GC-MS

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的GC-MS/MS方法定量分析不同香型白酒、威士忌、保健酒樣品中的揮發(fā)性酚類物質(zhì),其中小曲清香型白酒、大曲清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒、米香型白酒、威士忌及中國(guó)勁酒各5個(gè),共計(jì)35個(gè)樣品,結(jié)果見表5。

表5 不同飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物含量 單位：μg/L

有研究表明,4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等揮發(fā)性酚在酒中的總質(zhì)量濃度<400 μg/L,為酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)辛香、煙氣和革香韻,當(dāng)其總質(zhì)量濃度>620 μg/L時(shí),會(huì)使酒的“酚樣特征”過于明顯；酒會(huì)產(chǎn)生腥異味,掩蓋酒的香味[16]。表5結(jié)果表明,7種不同飲料酒中酚類化合物種類和質(zhì)量濃度間存在顯著差異。10種酚類化合物在中國(guó)勁酒中均有檢出,而且質(zhì)量濃度都比較高,中國(guó)勁酒中質(zhì)量濃度最高的酚類化合物為丁子香酚,質(zhì)量濃度范圍為4 935.22～6 611.65 μg/L,其他飲料酒中均未檢出丁子香酚。丁子香酚天然存在于丁香油、丁香羅勒油等中,具有辛香、煙熏香、甜香香味,可以抗菌、抗氧化,同時(shí)還具有解熱鎮(zhèn)痛、麻醉等藥效[17]；此外,在中國(guó)勁酒中質(zhì)量濃度較高的揮發(fā)性酚類化合物還包括4-甲基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚等,這些化合物多具有獨(dú)特的辛香、煙熏香、草藥香,天然主要存在于合金歡、茴香、肉桂和芹菜籽中[18]；其中4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚能夠通過抑制自由基的生成來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),是優(yōu)良的自由基清除劑,4-乙基愈創(chuàng)木酚還可以通過抑制炎癥因子和炎性體的表達(dá),從而起到細(xì)胞內(nèi)抗炎的作用[19]；愈創(chuàng)木酚可用于慢性支氣管炎多痰咳嗽的治療[20]。中國(guó)勁酒屬于配制酒,使用了大量的中藥材,這是中國(guó)勁酒中酚類化合物的主要來源；酚類化合物是中國(guó)勁酒煙熏香的主要來源,對(duì)中國(guó)勁酒藥香、辛香和甜香等特征香氣的形成也具有重要作用；高濃度的酚類化合物對(duì)中國(guó)勁酒的保健功能同樣具有重要影響。

酚類物質(zhì)為白酒提供獨(dú)特的煙熏風(fēng)味、焦醬味、奶香味和窖泥味等,是白酒主要風(fēng)味的組成[16,21]。在5種不同類型白酒中,米香型白酒中酚類化合物種類最少、質(zhì)量濃度最低,這與米香型白酒的生產(chǎn)工藝有關(guān),米香型白酒采用液態(tài)或者半固態(tài)發(fā)酵工藝,用曲量少,發(fā)酵期短,且釀造米香型白酒所使用的糖化發(fā)酵劑的主要微生物是糖化力很強(qiáng)的根霉和發(fā)酵力旺盛的酵母,酶系較為簡(jiǎn)單[22]。有些酚類化合物帶給飲料酒異嗅味,如苯酚具有藥氣味、煙臭味,4-甲基苯酚具有窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、動(dòng)物臭,4-乙基苯酚呈動(dòng)物臭、馬廄臭[23]。從表5可知,這3種化合物在各香型白酒中均有檢出,其中濃香型白酒中4-甲基苯酚質(zhì)量濃度最高,可達(dá)1 840 μg/L,明顯高于其他飲料酒。江南大學(xué)徐巖團(tuán)隊(duì)通過檢測(cè)窖泥中的可揮發(fā)性組分后,確認(rèn)濃香型白酒產(chǎn)生窖泥臭的化合物是4-甲基苯酚[24]。此外,通過數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn),小曲清香型白酒中酚類化合物的質(zhì)量濃度和種類與其生產(chǎn)工藝具有重要關(guān)系,如樣品XQJ-1為傳統(tǒng)工藝釀造,相較于自動(dòng)化生產(chǎn)工藝釀造的小曲清香型白酒樣品,酚類化合物的種類更多、質(zhì)量濃度更高,這與傳統(tǒng)工藝為開放式生產(chǎn),釀造過程中微生物酶系更為復(fù)雜具有關(guān)系。在5種不同類型白酒中,醬香型白酒中愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚質(zhì)量濃度最高；4-乙基愈創(chuàng)木酚在高濃度時(shí)聞香呈臭豆醬氣味,低濃度時(shí)似醬香空杯留香氣味,曾被認(rèn)為醬香型白酒的主體香氣化合物[25]；愈創(chuàng)木酚具有水果香、焦醬香,茅臺(tái)酒中的愈創(chuàng)木酚質(zhì)量濃度與“糧香”強(qiáng)度具有相關(guān)性,其對(duì)“糧香”有著十分重要的作用[26]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)在一輪次醬香型白酒中愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚質(zhì)量濃度高于其他輪次酒,而三、四輪次質(zhì)量濃度則較為接近,這個(gè)結(jié)果后續(xù)還需要通過增加樣品量進(jìn)行深入驗(yàn)證。

相較于白酒,威士忌酒中酚類化合物的種類和質(zhì)量濃度都較高,尤其是愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基苯酚、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚等化合物的質(zhì)量濃度相對(duì)較高,這些化合物的來源與威士忌酒采用橡木桶作為儲(chǔ)存容器具有重要關(guān)系,它們?yōu)橥考删铺峁┫鹉鞠愫蜔熝瑲馕?是形成威士忌酒獨(dú)特風(fēng)味的重要化合物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用液液微萃取結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),通過對(duì)比考察前處理實(shí)驗(yàn)參數(shù),優(yōu)選了1種飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物的實(shí)驗(yàn)方法。采用該方法對(duì)5種不同香型的白酒、威士忌及中國(guó)勁酒樣品中揮發(fā)性酚類化合物進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,該方法在白酒、威士忌、保健酒樣品中均適用,所測(cè)10種酚類化合物在不同類型飲料酒中質(zhì)量濃度分布差異較大。米香型白酒中酚類化合物種類最少、質(zhì)量濃度最低；苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚在所有香型白酒中均存在,其中濃香型白酒中4-甲基苯酚質(zhì)量濃度最高；醬香型白酒中愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚質(zhì)量濃度最高；10種酚類化合物在中國(guó)勁酒中均有檢出,而且質(zhì)量濃度都比較高,中國(guó)勁酒中質(zhì)量濃度最高的酚類化合物為丁子香酚,其他飲料酒中均未檢出丁子香酚。本方法可為飲料酒中酚類化合物的研究提供方法參考。