香菇柄多糖乙酰化修飾及其抗氧化活性

李順峰,許方方,崔國梅,田廣瑞,高帥平,劉麗娜,王安建,魏書信

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南 鄭州,450002)

香菇(Lentinusedodes)是中國栽培面積和產(chǎn)量最大的食用菌[1]。香菇不僅富含營養(yǎng)物質(zhì),還含有大量多糖、酚酸類以及活性蛋白等生物大分子而具有藥用保健功效[2]。香菇柄是香菇商品化處理中的副產(chǎn)物,約占香菇總重的20%～30%[3-4],由于其呈纖維化,適口性差,大部分被廢棄,造成了極大的資源浪費。香菇柄同菌蓋一樣由菌絲組成,同樣含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸等[5]。

多糖具有提高免疫力、抗病毒等多種生物活性,其活性的發(fā)揮與結(jié)構(gòu)、化學(xué)基團(tuán)等密切相關(guān),而將某些化學(xué)基團(tuán)引入到多糖大分子鏈中,不僅可改變多糖的理化性質(zhì)、增強(qiáng)生物活性,而且還可以產(chǎn)生新的活性,如乙?；噱X柳多糖可激活樹突細(xì)胞,提高抗突變能力[6]；硫酸化修飾枸杞多糖可顯著促進(jìn)免疫淋巴細(xì)胞增殖,提高免疫力[7]等。目前,常用的多糖化學(xué)修飾方法有乙?；⒘蛩狨セ?、羧甲基化等[8-12]。多糖經(jīng)過乙?；揎椇笊锘钚燥@著提高[8,13-14]。TANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖經(jīng)乙酰化修飾后的抗氧化活性以及對肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制活性高于其硫酸化修飾多糖和羧甲基化修飾多糖。本文以香菇柄為原料,經(jīng)水提醇沉等工藝制得香菇柄多糖,對其進(jìn)行乙?；?乙酸酐法)修飾,通過控制修飾試劑的比例(使用量)分別制備3種乙?；嗵?考察了修飾試劑的比例(使用量)對化學(xué)修飾香菇柄多糖取代度、多糖和蛋白質(zhì)含量的影響,并用紫外光譜、紅外光譜和剛果紅試劑對乙?；揎椙昂笙愎奖嗵沁M(jìn)行初步結(jié)構(gòu)分析,最后對乙?；揎椙昂蠖嗵堑目寡趸钚赃M(jìn)行評價,為香菇柄多糖抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究和香菇柄資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇柄購自鄭州信基調(diào)味品市場,經(jīng)50 ℃烘干至含水率低于8%后,粉碎過40目篩后備用。

重蒸酚、DPPH、葡萄糖、無水乙醇、三氯化鐵、硫酸亞鐵、甲醇、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

FA2004C型分析天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司；RV8V-C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,德國IKA 集團(tuán)；LD-Y300A型高速萬能粉碎機(jī),上海頂帥電器有限公司；DF-10型恒溫磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限公司；H2050R型臺式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香菇柄多糖的制備及多糖和蛋白質(zhì)含量的測定

1.2.1.1 香菇柄多糖的制備

將香菇柄粉與蒸餾水按照料液比1∶15(g∶mL)混勻,沸水浸提2次,每次2 h,上清液經(jīng)濃縮、醇沉、干燥后即為香菇柄多糖。

1.2.1.2 多糖和蛋白質(zhì)含量的測定

采用苯酚-硫酸法[16]測定多糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[17]測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 香菇柄多糖的乙酰化修飾

1.2.2.1 NaOH-乙酸酐法修飾多糖

參照文獻(xiàn)[18]方法對多糖進(jìn)行乙?；揎?乙酸酐用量分別為1、5、10 mL,反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)透析、醇沉、干燥,即為乙?；嗵?分別標(biāo)記為NaOH乙?；嗵?、NaOH乙?；嗵?、NaOH乙酰化多糖10,用于后續(xù)測定。

1.2.2.2 甲酰胺-乙酸酐法修飾多糖

參照文獻(xiàn)[8,19]方法進(jìn)行多糖乙酰化修飾,乙酸酐用量分別為1、5、10 mL,經(jīng)透析、醇沉、干燥,即為乙酰化多糖,分別標(biāo)記為甲酰胺乙?；嗵?、甲酰胺乙酰化多糖5、甲酰胺乙酰化多糖10,用于后續(xù)測定。

1.2.3 測定方法

乙酰基取代度的測定:采用酸堿滴定法測定乙?；〈萚20]。

紫外光譜分析:將香菇柄多糖及其乙?；嗵侵瞥?.2 mg/mL水溶液,于190～800 nm下進(jìn)行掃描。

紅外光譜分析:稱取香菇柄多糖及其乙?；嗵菢悠犯? mg,與200 mg經(jīng)過干燥的溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨均勻,壓片后用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進(jìn)行光譜掃描。

剛果紅實驗:參照文獻(xiàn)[21]測定三螺旋結(jié)構(gòu)。

抗氧化活性測定:參照文獻(xiàn)[8]對DPPH自由基清除率和還原能力進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù)3次,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析,GraphPad Prism軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇柄乙?；嗵堑闹苽?/h3>

香菇柄多糖乙酰化修飾的乙?；〈热绫?所示,香菇柄多糖提取物中的多糖含量為36.42 g/100 g,經(jīng)乙?；揎椇?隨著乙酸酐用量的增加,NaOH體系乙酰化修飾的多糖含量逐漸增大,而甲酰胺體系乙?；揎椀亩嗵呛匡@著減小(P<0.05)；蛋白質(zhì)含量為17.12 g/100 g,經(jīng)乙?；揎椇?隨著乙酸酐用量的增加,NaOH體系和甲酰胺體系乙酰化修飾多糖中的蛋白質(zhì)含量均顯著減少(P<0.05),與MA等[22]報道的樺褐孔菌多糖化學(xué)修飾后蛋白質(zhì)含量下降的結(jié)果一致。隨著乙酸酐用量的增加,NaOH體系和甲酰胺體系乙?；嗵堑娜〈染噬仙厔?并且NaOH體系乙酰化多糖的取代度及其增幅顯著高于甲酰胺體系乙?；嗵恰Ｉ壑轭I(lǐng)等[20]對樺褐孔菌多糖進(jìn)行了乙?；揎?發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖乙酰基的取代度隨乙?；揎椩噭┯昧吭龃蟪噬仙厔?與本結(jié)果相似。在乙酸酐用量為5 mL時,NaOH體系和甲酰胺體系乙?；嗵蔷色@得較好的取代度,分別為0.31和0.14。這一結(jié)果說明乙酸酐用量對香菇柄多糖的乙?；〈兄匾绊?。

表1 香菇柄多糖乙?；揎椚〈燃岸嗵呛偷鞍踪|(zhì)含量Table 1 Substitution degree and contents of polysaccharide and protein of acetylated modification of L.edodes stipe polysaccharide

2.2 紫外光譜和紅外光譜分析

由圖1可知,與粗多糖相比,NaOH體系乙?；嗵呛图柞０敷w系乙?；嗵窃?60和280 nm處的紫外吸光值均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢,并且隨著乙酸酐用量的增加,在260和280 nm處的紫外吸光值越小,表明乙酰化過程對脫除多糖中的蛋白質(zhì)具有一定的作用。這一結(jié)果與表1中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果一致。

從圖2可以看出,香菇柄多糖及NaOH體系乙?；嗵呛图柞０敷w系乙?；嗵嵌季哂卸嗵堑奶卣魑辗?。3 416 cm-1左右為糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O—H伸縮振動峰,2 932 cm-1為次甲基(—CH2—)中的C—H的伸縮振動的吸收峰。

a-NaOH體系乙?；嗵?b-甲酰胺體系乙?；嗵菆D2 香菇柄多糖及其乙?；嗵堑募t外光譜圖Fig.2 The FT-IR spectra of L.edodes stipe polysaccharide and its acetylated polysaccharide

2.3 剛果紅實驗

剛果紅是一種酸性染料,可與具有三螺旋鏈構(gòu)象的多糖形成配合物,配合物的最大吸收波長與剛果紅相比發(fā)生紅移[21]。香菇柄多糖及其乙?；嗵桥c剛果紅在不同NaOH濃度下溶液的最大吸收波長λmax的變化如圖3所示。香菇柄多糖及NaOH體系乙?；嗵桥c剛果紅的混合溶液λmax均發(fā)生了紅移,表明NaOH體系乙?；嗵蔷哂腥菪Y(jié)構(gòu)；甲酰胺體系乙?；嗵?與剛果紅的混合溶液λmax發(fā)生了輕微的紅移,其余甲酰胺乙?；嗵桥c剛果紅的混合溶液及剛果紅對照溶液的λmax均沒有發(fā)生紅移,表明甲酰胺體系乙酰化多糖不具有三螺旋結(jié)構(gòu),造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于甲酰胺體系乙酰化過程中未對溶液pH值進(jìn)行調(diào)整,溶液pH值較小,多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)在酸性條件下被破壞；而NaOH體系乙?；嗵窃谝阴；^程中pH值始終保持在8～9,沒有破壞多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)。出現(xiàn)這一結(jié)果可能與分子間氫鍵是否被破壞有關(guān)[11]。

圖3 不同NaOH濃度下香菇柄多糖及其乙酰化多糖與 剛果紅配合物的λmax變化Fig.3 λmax changes of Congo with L.edodes stipe polysaccharide and its acetylated polysaccharide complex under various concentrations of sodium hydroxide

2.4 乙?；揎棇ο愎奖嗵求w外抗氧化活性的影響

從圖4-a可以看出,在實驗濃度范圍內(nèi),隨著多糖濃度的增大,香菇柄多糖及NaOH體系和甲酰胺體系乙?；嗵菍PPH自由基清除率均呈增強(qiáng)趨勢。在多糖質(zhì)量濃度小于4 mg/mL時,香菇柄多糖和NaOH乙?；嗵?對DPPH自由基清除率高于NaOH乙?；嗵?和10,之后繼續(xù)增大多糖濃度,則低于NaOH乙?；嗵?和10對DPPH自由基的清除率；在多糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL時,NaOH乙?；嗵?、5和10對DPPH自由基清除率比香菇柄多糖(41.76%)分別高4.51%、11.15%和12.29%。而甲酰胺乙?；嗵菍PPH自由基清除率則低于香菇柄多糖,且取代度越大,清除能力越弱；在多糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL時,甲酰胺乙?；嗵?、5和10對DPPH自由基清除率比香菇柄多糖分別低3.39%、12.42%和15.84%。相關(guān)研究表明,多糖經(jīng)乙?；揎椇笃淇寡趸钚员憩F(xiàn)不一,如邵珠領(lǐng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)乙?；瘶搴挚拙嗵菍PPH自由基清除能力高于未乙?；揎椂嗵?。而徐田甜等[18]研究發(fā)現(xiàn)乙?；蓸滢Χ嗵菍PPH自由基清除活性比未修飾的活性低。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因為乙?；揎椫阅軌?qū)Χ嗵腔钚援a(chǎn)生影響,不僅與取代度有關(guān),還與取代位置、以及反應(yīng)過程中多糖結(jié)構(gòu)是否被破壞有關(guān)[6,18,24]。

a-DPPH清除能力;b-還原力圖4 香菇柄多糖及其乙?；嗵菍PPH自由基的清除 作用及還原力的影響Fig.4 Scavenging capacities of L.edodes stipe polysaccharide and its acetylated polysaccharide on DPPH free radicals and its reducing power

根據(jù)還原能力的測定方法,在波長700 nm測定的吸光值越大,則表明樣品的還原能力越強(qiáng)。由圖4-b可知,在實驗所測定的濃度范圍內(nèi),NaOH乙?；嗵堑倪€原能力高于香菇柄多糖,且隨著乙酰化試劑用量的增大,多糖的還原能力增強(qiáng)；而甲酰胺乙?；嗵堑倪€原能力低于香菇柄多糖,并且隨著乙酰化試劑用量的增大,還原能力逐漸減弱。

HU等[8]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲酰胺體系乙酰化修飾后的藤五加多糖的還原能力弱于未乙?；揎椂嗵?與本研究結(jié)果相似。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于乙?；揎椄淖兞硕嗵欠肿拥亩ㄏ蛐院蜋M向次序,從而改變糖鏈的空間排布,減少了活性羥基的密度進(jìn)而阻止了乙酰基與金屬離子的結(jié)合,進(jìn)而降低了還原能力[8,20]。

3 結(jié)論

隨著乙酸酐用量增加,NaOH體系和甲酰胺體系乙?；揎椣愎奖嗵堑囊阴；〈染噬仙厔?乙?；〈扰c乙酸酐用量呈正相關(guān)。在乙酸酐用量為5 mL時,可以得到較好的取代度。紫外光譜表明,香菇柄多糖乙?；揎椙昂蠡沮厔菀恢?。紅外光譜表明,乙?；揎椣愎奖嗵浅哂卸嗵翘卣鞣逋?還出現(xiàn)了乙?；奶卣魑辗?表明香菇柄多糖的乙酰化修飾成功。NaOH體系乙酰化修飾后多糖仍然具有三螺旋結(jié)構(gòu),而甲酰胺體系乙?；揎椇蠖嗵堑娜菪Y(jié)構(gòu)被破壞。隨著多糖濃度的增加,香菇柄多糖及NaOH體系和甲酰胺體系乙?；嗵堑目寡趸芰鰪?qiáng)。且NaOH體系乙酰化多糖的抗氧化活性強(qiáng)于香菇柄多糖,甲酰胺體系乙?；嗵堑目寡趸钚匀跤谙愎奖嗵?。