γ射線照射導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死性凋亡和線粒體損傷

張愉寧，張 幻，周 穎，董曦文，易 靜，陳肖華，胡舜英，王 華

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺及骨、軟組織腫瘤內(nèi)科，廣西 南寧 530021；3.解放軍總醫(yī)院心血管病醫(yī)學(xué)部，北京 100853）

放射性心臟病常見于胸部惡性腫瘤患者接受放療后［1］，早期通常無明顯臨床癥狀，晚期病變往往會(huì)波及心包膜、心肌、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)及冠狀動(dòng)脈等［2］，引起較重的臨床癥狀，患者的晚期生存率和生活質(zhì)量下降。對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究，傾向于認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞是射線損傷的靶細(xì)胞［3］，心肌細(xì)胞變性和心肌纖維化是繼發(fā)于內(nèi)皮細(xì)胞受損后心臟微循環(huán)障礙所致［4］。而心肌細(xì)胞作為心臟結(jié)構(gòu)及功能重要組成部分被歸屬為放射不敏感細(xì)胞，放射對(duì)心肌細(xì)胞本身的影響、損傷機(jī)制、心肌細(xì)胞損傷在放射性心臟病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用尚不十分清楚。其他放射性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，輻射暴露常誘導(dǎo)多種并存的死亡方式，除引起細(xì)胞凋亡外，也會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死［5］。細(xì)胞壞死認(rèn)為是一種不受調(diào)控的細(xì)胞被動(dòng)死亡方式，然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中存在著控制壞死的專用分子通路［6］，其中研究最為深入的是壞死性凋亡。壞死性凋亡是一種主動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞壞死的方式，在形態(tài)上與壞死極為相似，但卻受到具體的通路調(diào)節(jié)，主要通過受體相互作用蛋白激酶 1（receptor protein-interacting kinase 1，RIPK1）和RIPK3傳遞死亡信號(hào)，募集并磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed series protein kinase-like domain，MLKL），磷酸化的MLKL多聚化并定位在細(xì)胞膜上，影響細(xì)胞膜的完整性和通透性，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死［7］。有研究顯示，壞死性凋亡參與缺血再灌注過程中心肌損傷的病理生理過程［8］，心肌細(xì)胞壞死性凋亡在心肌重塑和心力衰竭中也扮演著重要角色［9］，通過RIPK1抑制劑、基因調(diào)控對(duì)壞死性凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)可發(fā)揮心肌保護(hù)作用［10］。然而壞死性凋亡是否參與輻射誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡尚不清楚。諸多研究表明，壞死性凋亡的發(fā)生在很大程度上取決于線粒體功能紊亂和氧化應(yīng)激水平増高［11-12］。線粒體酪氨酸磷酸化酶 1（protein tyrosine phosphatase，mitochondrial 1，PTPMT1）是一種新發(fā)現(xiàn)的僅存在于線粒體內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸酶，廣泛定位于各種組織的線粒體內(nèi)膜［13］。已有研究表明，PTPMT1參與調(diào)控構(gòu)成線粒體內(nèi)膜的重要磷脂成分之一——心磷脂的合成路徑，PTPMT1表達(dá)下降可影響心磷脂的合成，從而嚴(yán)重干擾線粒體功能［14-15］，但PTPMT1在輻射引起的細(xì)胞損傷中發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究將通過單次照射H9C2細(xì)胞，檢測(cè)線粒體功能的改變和壞死性凋亡的相關(guān)表型，探討γ射線照射對(duì)大鼠心肌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

大鼠心肌H9C2細(xì)胞，美國菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)基、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒，美國Thermo公司；胎牛血清，美國Gemini公司；HEPES液，北京索萊寶公司；RIPA裂解液和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）（ΔΨm）檢測(cè)試劑盒，北京碧云天公司；細(xì)胞線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）檢測(cè)試劑盒，上海杰美基因公司；APCAnnexinⅤ/7AAD凋亡檢測(cè)試劑盒，美國Biogens公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒，上海奕衫生物公司；兔抗大鼠活化的胱天蛋白酶3（cleavedcaspase 3）多抗、兔抗大鼠胱天蛋白酶原3（procaspase 3）多抗、兔抗大鼠RIPK1單抗、兔抗大鼠RIPK3單抗和兔抗大鼠磷酸化MLKL（phosphorylated MLKL，p-MLKL）單抗（一抗），美國CST公司；兔抗大鼠GAPDH單抗、兔抗大鼠β肌動(dòng)蛋白多抗和兔抗大鼠PTPMT1多抗（一抗），美國Proteintech公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG單抗（二抗），北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光液，北京莊盟公司。Power-Pac164-5050電泳儀，美國Bio-Rad公司；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司；x-Light V3轉(zhuǎn)盤共聚焦，意大利CrestOptics公司；7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，美國ABI公司；Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀，上海天能公司；Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀，美國Thermo公司。

1.2 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

以含有10%胎牛血清與1% HEPES液的DMEM為H9C2細(xì)胞的培養(yǎng)基，置37℃，5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液，待細(xì)胞生長至80%～90%融合度時(shí)傳代，傳代比例為1∶3。

1.3 H9C2細(xì)胞60Co γ射線照射

將生長狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞以3×108L-1的密度接種于6孔板內(nèi)（每孔2 mL）或96孔板中（每孔100 μL）置37℃，5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞均勻貼壁后，使用60Co γ射線分別以5，10和20 Gy進(jìn)行照射，并設(shè)未照射的細(xì)胞對(duì)照組。細(xì)胞照射后立即換液。

1.4 CCK-8法檢測(cè)H9C2細(xì)胞存活率

H9C2細(xì)胞經(jīng)5，10和20 Gy照射后24，48和72 h，每劑量和時(shí)間點(diǎn)設(shè)4復(fù)孔，吸棄基，加含有10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)基100 mL繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在激發(fā)光波長為450 nm的條件下，使用光譜掃描多功能讀數(shù)儀檢測(cè)吸光度值（A450nm）。以含有10% CCK8的新鮮培養(yǎng)基為空白組，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（照射組A450nm-空白組A450nm）/（對(duì)照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡率

H9C2細(xì)胞經(jīng)10和20 Gy照射后24，48和72 h，收集上清，300×g離心5 min收集培養(yǎng)上清中的細(xì)胞；隨后用不含EDTA的胰酶消化貼壁的H9C2細(xì)胞，300×g離心5 min，收集細(xì)胞。兩者混合，用PBS漂洗2次。加5 μL APC-AnnexinⅤ混勻，室溫避光孵育15 min；再加入7AAD細(xì)胞核染料5 μL混勻，室溫避光孵育10 min。洗滌后加入PBS 400 μL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析計(jì)算H9C2細(xì)胞凋亡率〔早期凋亡細(xì)胞（APC+7AAD-）和晚期凋亡或壞死細(xì)胞（APC+/7AAD+）〕。

1.6 Western印跡法檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

H9C2細(xì)胞經(jīng)10和20 Gy照射后24，48和72 h，用RIPA裂解液裂解，10 000×g，4℃離心10 min，吸取上清液。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整各組蛋白質(zhì)濃度，以4∶1體積比加入5×上樣緩沖液混勻，100℃煮10 min。將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為20 μg，分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。后加入一抗（抗活化的胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶3酶原、RIPK1、RIPK3、p-MLKL和PTPMT1抗體，稀釋比均為1∶2000），4℃孵育過夜。TBS-T清洗4次，每次5 min。隨后加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗）（1∶5000），室溫孵育1 h，TBS-T洗膜4次，每次5 min。以β肌動(dòng)蛋白或GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。發(fā)光、顯影、掃描后分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA），待測(cè)蛋白表達(dá)水平用IA待測(cè)蛋白/IAGAPDH比值或IA待測(cè)蛋白/IAβ肌動(dòng)蛋白比值表示。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2細(xì)胞活性氧水平

H9C2細(xì)胞經(jīng)5，10和20 Gy照射后6，24和48 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，更換2 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10 mmol·L-1的H2DCFDA探針 2 μL，使探針終濃度為 10 μmol·L-1，孵 育30 min。孵育結(jié)束后用PBS清洗3次，胰酶消化，離心棄上清；用PBS漂洗2次，加PBS 400 μL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度，反映ROS水平。

1.8 免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2細(xì)胞線粒體膜電位

按線粒體膜電位免疫熒光檢測(cè)試劑盒操作說明操作。H9C2細(xì)胞經(jīng)5，10和20 Gy照射后24和48 h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL和JC-1染色工作液0.5 mL，充分混勻，孵育20 min；孵育結(jié)束后吸棄上清，用預(yù)冷1×JC-1緩沖液洗滌2次，加細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，在激光共聚焦顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞，進(jìn)行定性分析。紅色熒光減弱、綠色熒光增強(qiáng)表明MMP（ΔΨm）下降。

H9C2細(xì)胞經(jīng)5，10和20 Gy照射后24和48 h，胰酶消化細(xì)胞，離心棄上清，用PBS漂洗1次，加培養(yǎng)基500 μL重懸細(xì)胞；再加染色工作液500 μL，混勻置培養(yǎng)箱避光孵育20 min；4℃，300×g離心5 min，棄上清，用預(yù)冷1×緩沖液漂洗2次；1×緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，對(duì)MMP的變化進(jìn)行定量分析。

1.9 免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2細(xì)胞線粒體膜通道孔開放狀態(tài)

按mPTP檢測(cè)試劑盒操作說明操作。H9C2細(xì)胞經(jīng)5，10和20 Gy照射后24和48 h，小心吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加37℃預(yù)熱的清理液0.5 mL清洗1次，再加染色工作液0.5 mL，充分混勻，置培養(yǎng)箱37℃避光孵育20 min，孵育結(jié)束后吸棄染色工作液，用預(yù)熱的清理液清洗2次，通過激光共聚焦顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞，進(jìn)行mPTP開放定性分析。綠色熒光減弱表明mPTP活性增強(qiáng)、開放增加。

H9C2細(xì)胞經(jīng)5，10和20 Gy照射后24和48 h，胰酶消化細(xì)胞，離心棄上清，使用PBS漂洗1遍，加清理液500 μL重懸細(xì)胞，離心棄上清，再加工作液500 μL，混勻置培養(yǎng)箱避光孵育20 min，用預(yù)熱的清理液漂洗2次后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度，對(duì)mPTP活性進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射各時(shí)間組，5和10 Gy照射48和72 h組H9C2細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of γ ray irradiation on cell survival of H9C2 cells by CCK-8 kit.H9C2 cells were irradiated by60Co γ ray of 5，10 and 20 Gy and the cell survival rates were detected after 24，48 and 72 h，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.2 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）；10 Gy照射48和72 h組H9C2細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of γ ray irradiation on apoptosis of H9C2 cells by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞活化的胱天蛋白酶3水平顯著升高（P＜0.05），胱天蛋白酶原3水平顯著降低（P＜0.05）；10 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞活化的胱天蛋白酶3水平顯著升高（P＜0.05）；10 Gy照射24 h組H9C2細(xì)胞胱天蛋白酶原3水平顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of γ ray irradiation on levels of cleaved-caspase 3 and pro-caspase 3 in H9C2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B1 and B2 were the semi-quantitative results of A1（24 h），A2（48 h）and A3（72 h）.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.4 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞p-MLKL，RIPK1和RIPK3水平顯著升高（P＜0.01）；10 Gy照射24 h組H9C2細(xì)胞RIPK1水平顯著升高（P＜0.05）；10 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞p-MLKL水平顯著升高（P＜0.01）；5 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞RIPK3水平顯著升高（P＜0.01），5 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞p-MLKL水平顯著升高（P＜0.05）；提示γ射線照射誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

Fig.4 Effect of γ ray irradiation on levels of receptor protein-interacting kinase 1（RlPK1），RlPK3，and phosphorylated mixed series protein kinase-like domain（p-MLKL）in H9C2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B1，B2 and B3 were the semi-quantitative results of A1（24 h）and A2（48 h）.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖5）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.01）；10 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05）；5 Gy照射24 h時(shí)間組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05）；表明γ射線照射導(dǎo)致H9C2細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加。

Fig.5 Effect of γ ray irradiation on reactive oxygen species（ROS）production in H9C2 cells by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖6）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞紅色熒光比例明顯減少（P＜0.01）；10 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞紅色熒光比例明顯減少（P＜0.01）；5 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞紅色熒光比例明顯減少（P＜0.05），表明γ射線照射會(huì)導(dǎo)致H9C2細(xì)胞線粒體去極化，線粒體膜電位下降。激光共聚焦顯微鏡定性觀察（圖7）結(jié)果與上述結(jié)果一致。

Fig.6 Effect of γ ray irradiation on mitochondrial membrane potential（MMP）in H9C2 cells by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.7 Effect of γ ray irradiation on MMP in H9C2 cells by laser confocal fluorescence imaging.See Fig.1 for the cell treatment.The intensity variation of red or green fluorescence represents the change of MMP in H9C2 cells after different treatment.

2.7 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞線粒體膜通道孔開放的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖8）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，20 Gy照射各時(shí)間組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.01）；10 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.01）；5 Gy照射48 h組H9C2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.05）；提示γ射線照射導(dǎo)致H9C2細(xì)胞mPTP開放、活性增強(qiáng)。激光共聚焦顯微鏡定性觀察（圖9）結(jié)果與上述結(jié)果一致。

Fig.8 Effect of γ ray irradiation on mitochondrial permeability transition pore（mPTP）opening in H9C2 cells by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.9 Effect of γ ray irradiation on mPTP opening in H9C2 cells by laser confocal fluorescence imaging.SeeFig.1 for the cell treatment.The intensity variation of green fluorescence represents the change of mPTP opening in H9C2 cells after different treatment.

2.8 γ射線照射對(duì)H9C2細(xì)胞PTPMT1表達(dá)水平的影響

Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖10）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，10和20 Gy照射組各時(shí)間點(diǎn)H9C2細(xì)胞PTPMT1水平均顯著降低（P＜0.01），5 Gy照射24 h組H9C2細(xì)胞PTPMT1水平顯著降低（P＜0.05）。

Fig.10 Effect of γ ray irradiation on levels of protein tyrosine phosphatase，mitochondrial 1（PTPMT1） in H9C2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B were the semi-quantitative result of A1（24 h）and A2（48 h）.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

3 討論

放射性心臟病是一種常見的放療不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，其發(fā)生發(fā)展包含了炎癥浸潤、電離損傷和凋亡水平增加等多種機(jī)制。在對(duì)大鼠進(jìn)行心臟局部照射的在體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，線粒體在輻射效應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用，照射后心臟中分離的心肌線粒體存在功能障礙，表現(xiàn)為mPTP開放增加和線粒體膜電位降低［16］。本研究用體外照射模型證實(shí)，照射可損傷H9C2細(xì)胞線粒體，引起mPTP開放、活性增加，線粒體膜電位降低，ROS產(chǎn)生增多。

心肌作為終末分化永久性細(xì)胞，過去常認(rèn)為心肌細(xì)胞的死亡形式主要為壞死和凋亡，Kung等［17］提出壞死性凋亡是一種介導(dǎo)心血管疾病中細(xì)胞死亡的新形式，壞死性凋亡過程主要涉及RIPK1，RIPK3和MLKL等幾個(gè)關(guān)鍵分子。有研究指出，壞死性凋亡在心肌梗死缺血再灌注心肌重塑和心衰中至關(guān)重要［18］，RIPK3缺陷小鼠在發(fā)生缺血再灌注后，心肌細(xì)胞死亡減少，心衰情況改善，其中RIPK3通過介導(dǎo)鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ的激活，觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放以及心肌細(xì)胞壞死性凋亡［9］。此外有研究證明，Nec-1作為一種特異性壞死性凋亡抑制劑，還可減少過氧化物誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞死亡，該作用機(jī)制在于Nec-1延遲了mPTP的開放［19］。MLKL作為壞死性凋亡的終末效應(yīng)分子，磷酸化的MLKL多聚化并錨定在細(xì)胞膜上，是引起細(xì)胞死亡的關(guān)鍵點(diǎn)，目前對(duì)于MLKL如何觸發(fā)細(xì)胞死亡仍不清楚。有研究指出，p-MLKL會(huì)與磷脂酰肌醇脂類和心磷脂結(jié)合，直接滲透細(xì)胞膜［20］。本研究表明，大劑量γ射線照射可在短期內(nèi)對(duì)心肌細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞的損傷包括凋亡和壞死性凋亡，其中流式結(jié)果顯示受照后心肌細(xì)胞多為晚期凋亡和壞死，早期凋亡所占比例較少，結(jié)合免疫印跡結(jié)果48 h凋亡相關(guān)蛋白變化不明顯，而壞死性凋亡相關(guān)蛋白差異具有顯著性，因此推測(cè)照射引起的H9C2細(xì)胞死亡存在動(dòng)態(tài)的變化過程，起初凋亡占主要部分，隨著時(shí)間延長壞死性凋亡所占比例上升居于主導(dǎo)地位。照射誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與壞死性凋亡之間的關(guān)系與動(dòng)態(tài)變化，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

PTPMT1是一類在各類組織的線粒體廣泛分布的酪氨酸磷酸酶，參與調(diào)控作為構(gòu)成線粒體內(nèi)膜的重要磷脂成分之一的心磷脂的合成路徑，PTPMT1表達(dá)下降會(huì)影響心磷脂的合成，從而干擾線粒體功能并改變線粒體形態(tài)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，照射可引起H9C2細(xì)胞PTPMT1表達(dá)降低，提示PTPMT1分子可能參與調(diào)控心肌細(xì)胞壞死性凋亡和線粒體損傷。

本研究基于放射性損傷與線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激、以及壞死性凋亡發(fā)生之間的緊密聯(lián)系，結(jié)合PTPMT1分子在線粒體結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮的重要作用，采用激光共聚焦、流式、Western印跡等方法，系統(tǒng)探究了γ射線照射對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9C2一系列表型的影響。研究還存在許多不足和局限性。例如，本研究以心肌細(xì)胞系作為研究對(duì)象進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需用原代細(xì)胞或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；尚未充分探討照射導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡的相互關(guān)系；未揭示照射損傷心肌細(xì)胞線粒體和壞死性凋亡之間的明確關(guān)系以及PTPMT1在其中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。上述問題均有待進(jìn)一步研究。