脈絡(luò)舒通丸對(duì)血栓閉塞性脈管炎模型大鼠的治療作用

王夢(mèng)麗，楚堯娟，左莉華，趙夢(mèng)帆，劉霽云，李 冰，孫 志，張曉堅(jiān)，杜書章

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床質(zhì)譜工程研究中心，河南 鄭州450000；3.中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276000）

血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是一種主要損傷四肢遠(yuǎn)端中小動(dòng)靜及淺靜脈的炎癥性血管疾病，其特征是高度單核細(xì)胞血栓形成的節(jié)段性血管閉塞［1-2］，臨床癥狀表現(xiàn)為四肢組織供血不足，具有慢性、進(jìn)行性、持續(xù)性和階段性的特點(diǎn)，治療預(yù)后良好，但壞死性病變的發(fā)病率很高［3-4］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)TAO發(fā)病原因及機(jī)制的闡述尚未明確，目前研究認(rèn)為其與煙草、免疫和高凝狀態(tài)等因素密切相關(guān)。許多研究表明，香煙中存在的氧化物質(zhì)損害血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而增加了血栓的形成，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［5］，血栓和炎癥是TAO發(fā)展的2個(gè)主要事件［6］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，TAO的發(fā)生因心、脾、腎虧虛，復(fù)感寒濕之邪，使經(jīng)絡(luò)瘀阻，陽氣不能溫達(dá)四末，肢端失于供養(yǎng)，郁邪化熱，而致“脫疽”［7］。凝滯脈絡(luò)或熱毒熾盛，閉塞不通，血運(yùn)不暢，陽氣不達(dá)，氣血兩虛，失于溫通濡養(yǎng)所致脈絡(luò)痹阻，氣血流通不暢為其主要病機(jī)，與血栓形成和炎癥反應(yīng)相對(duì)應(yīng)［8］。因此，用來治療TAO的中藥制劑主要在于其活血化瘀、清熱祛濕等功效。

脈絡(luò)舒通丸（Mailuo Shutong pills，MLST），由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣和全蝎等12味藥材炮制而成，黃芪和金銀花為君藥，發(fā)揮解毒消腫的功能；而黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍和甘草為臣藥，發(fā)揮清熱祛濕的作用；水蛭、蜈蚣和全蝎為佐藥，達(dá)到驅(qū)除瘀血的作用［9］。多味藥材合用，臨床療效確切，常用于濕熱瘀阻脈絡(luò)所致的血栓性淺靜脈炎，非急性期深靜脈血栓形成所致的下肢肢體腫脹、疼痛、膚色暗紅或伴有條索狀物，具有清熱解毒、化瘀通絡(luò)、祛濕消腫的功效［10］，與治療TAO的中藥功效相吻合。目前有關(guān)MLST治療TAO的研究多偏重于臨床療效的觀察，發(fā)現(xiàn)MLST與其他抗凝血藥物聯(lián)用后患者腳和小腿部位酸痛感減輕，步行不適感消失［11］，但單獨(dú)使用治療TAO的治療效果和作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過制備TAO大鼠模型，觀察MLST對(duì)TAO的治療作用及炎癥因子和凝血因子的變化，為TAO的治療開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和主要儀器

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重230～270 g〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001〕，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23～27℃，相對(duì)濕度為45%～55%，每12 h明暗交替，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)規(guī)定。

MLST，國藥準(zhǔn)字Z20090636，批號(hào)：18200141，每克含黃芪甲苷≥0.30 mg，每克含綠原酸≥3.2 mg，魯南厚普制藥有限公司；通塞脈片（Tongsaimai tablet，TSM），國藥準(zhǔn)字Z32020535，批號(hào)：170402，江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司。月桂酸鈉（純度98%，批號(hào)：R007037），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；大鼠內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）、血栓素2（thromboxane-2，TXB-2）和 6-酮-前列腺素（6-keto-prostaglandin，6-K-PGF1α）ELISA試劑盒（批號(hào)：E06979r，E08047r和E14411r），武漢華美生物工程有限公司；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號(hào)：EK301B/3-24），杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；兔抗大鼠NF-κB單克隆抗體（一抗）和CY3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），武漢塞維爾生物科技有限公司。

AL104型電子天平（德國梅特勒-托利多儀器有限公司）；D3024R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）；RT-3100C全自動(dòng)洗板機(jī)（雷杜生命科技有限公司）；GEL-70電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津萊玻特瑞儀器有限公司）；MX-F型渦旋混合器（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Epoch型酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國博騰儀器有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組和給藥

60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為：TAO模型組、模型+TSM 2.6 g·kg-1，模型+MLST 3.8，7.6和15.2 g·kg-1及假手術(shù)組，每組10只。以造模當(dāng)天為實(shí)驗(yàn)第0天（D0），根據(jù)文獻(xiàn)［12］向大鼠右后肢股動(dòng)脈注入0.2 mL月桂酸鈉（7 g·L-1）制備TAO模型，假手術(shù)組注入0.2 mL生理鹽水，手術(shù)完畢后ip給予青霉素400 kU，預(yù)防感染。注射月桂酸鈉后，1 min內(nèi)肢體皮膚顏色出現(xiàn)蒼白（與自身對(duì)側(cè)肢體相比）表明月桂酸鈉注射成功，次日（D1）注射側(cè)肢體出現(xiàn)缺血性改變（表現(xiàn)為肢體青紫顏色加深，趾尖發(fā)黑，有跛行或拖曳現(xiàn)象）表明模型制備成功。D1開始ig給藥，將MLST和TSM研磨為粉末與羧甲纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液混溶（粉末∶CMC-Na=1∶1.5）用于ig給藥，TAO模型組、假手術(shù)組給予同體積的CMC-Na溶液。每天同一時(shí)間ig給藥1次，持續(xù)14 d。

1.3 體重和患肢形態(tài)變化評(píng)級(jí)

記錄大鼠D1和D14體重，D14參照Shinichiro Ashida等［13］采用的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患肢形態(tài)變化進(jìn)行評(píng)級(jí)。0級(jí)：整體外觀無變化；Ⅰ級(jí)：病變局限于趾甲部；Ⅱ級(jí)：病變局限于趾部；Ⅲ級(jí)：病變局限于足爪部；Ⅳ級(jí)：病變超過踝關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)以下；Ⅴ級(jí)：病變發(fā)展到膝關(guān)節(jié)以上。

1.4 血常規(guī)檢測(cè)

按1.2分組處理大鼠，于D15用100 g·L-1水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉，用一次性血液采集針和真空負(fù)壓管腹主動(dòng)脈取全血。乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediamine tetraacetic acid dipotassium，EDTAK2）抗凝采血管收集血液2 mL，檢測(cè)其白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)目及紅細(xì)胞比容。

1.5 凝固法檢測(cè)凝血纖溶相關(guān)指標(biāo)測(cè)

同1.4操作，用檸檬酸鈉抗凝采血管收集腹主動(dòng)脈血液2 mL，3000×g離心15 min，取上層血漿，檢測(cè)大鼠血漿的凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）和纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）水平。

1.6 ELlSA法測(cè)定血漿炎癥因子和凝血因子水平

同1.4操作，用肝素鈉抗凝管收集大鼠腹主動(dòng)脈血液，30 min內(nèi)于4℃ 3000×g離心15 min，取上清置-80℃保存，用于ELISA檢測(cè)。按ELISA試劑盒說明書測(cè)定血漿中ET-1，IL-1β，TXB-2和6-KPGF1α水平。

1.7 HE染色觀察股動(dòng)脈和股靜脈組織病理變化

各組大鼠取血后迅速剝離股動(dòng)脈和股靜脈，在穿刺點(diǎn)下方剪取2～3 cm，用生理鹽水沖洗后，10%甲醛溶液浸泡。取固定好的大鼠動(dòng)、靜脈組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片等操作步驟后，于倒置顯微鏡下觀察組織病理變化并拍照。

1.8 免疫熒光法檢測(cè)股動(dòng)脈組織NF- κB表達(dá)水平

取1.7制備的大鼠動(dòng)脈組織切片脫蠟，置盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）的修復(fù)盒中進(jìn)行抗原修復(fù)。用組化筆在組織周圍畫圈，圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑保持5 min，沖洗后孵育30 min。加抗NF-κB抗體（一抗，1∶100稀釋）4℃孵育過夜；漂洗3次，加CY3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗，1∶500稀釋）避光室溫孵育50 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片，鏡檢拍照，使用Image J計(jì)算熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MLST對(duì)TAO模型大鼠體重和患肢形態(tài)變化的影響

D1各組大鼠體重?zé)o差異。D14，與假手術(shù)組相比，TAO模型組體重下降（P＜0.05）；與TAO模型組相比，模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組及模型+TSM 2.6 g·kg-1組體重均增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖1）。TAO模型組大鼠患肢逐漸紫暗發(fā)黑，最后變硬，干枯發(fā)黃，木乃伊化，病變部位也從趾端逐漸蔓延至膝關(guān)節(jié)以上，伴有患肢、跛行和曳行現(xiàn)象，2周內(nèi)部分大鼠患肢壞疽脫落。假手術(shù)組未出現(xiàn)病變。與模型組相比，模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組與模型+TSM組患肢病變減輕（P＜0.05），各組大鼠患肢病變?cè)u(píng)級(jí)見表1。

Fig.1 Effect of Mailuo Shutong pills(MLST)on body mass of thromboangiitis obliterans(TAO)model rats.The TAO model was prepared by injecting 0.2 mL sodium laurate 7 g·L-1into the distal end of rats，and 0.2 mL normal saline was injected into the sham group.After injection，paleness in the skin color of the limbs within 1 min indicated the successful injection of sodium laurate，and ischemic changes in the limbs appared the next day(D1)indicated the successful preparation of the model.The administration started on D1，the model+TSM group was ig given TSM 2.6 g·kg-1and the model+MLST group was ig given MLST 3.8，7.6 and 15.2 g·kg-1，respectively,once a day，for 14 d.The sham group was ig given CMC-Na solution.The body mass of rats was recorded on D1 and D14 after drug treatment.x ± s，n=10. ＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with TAO model group.

Tab.1 Effect of MLST on grading of TAO model rats

2.2 MLST對(duì)TAO模型大鼠血常規(guī)的影響

與假手術(shù)組相比，TAO模型組大鼠白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)目及紅細(xì)胞比容顯著上升（P＜0.01）；與TAO模型組相比，模型+MLST 7.6 g·kg-1組上述指標(biāo)勻降低（P＜0.01），模型+TSM 2.6 g·kg-1組上述指標(biāo)亦均降低（P＜0.05）（表2）。

Tab.2 Effect of MLST on blood routine indicators of TAO model rats

2.3 MLST對(duì)TAO模型大鼠凝血纖溶相關(guān)指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，TAO模型組PT，APTT和TT縮短（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)IB水平升高（P＜0.05）；與TAO模型組相比，模型+TSM 2.6 g·kg-1及模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組PT，APTT和TT延長（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)IB水平下降（P＜0.05）（表3）。

Tab.3 Effect of MLST on coagulation and fibrinolysis indicators of TAO model rats

2.4 MLST對(duì)TAO模型大鼠血漿炎癥因子和凝血因子水平的影響

與假手術(shù)組相比，TAO模型組大鼠血漿ET-1，TXB2和IL-1β水平升高（P＜0.01），6-K-PGF1α水平明顯降低（P＜0.01）；與TAO模型組相比，模型+MLST 3.8，7.6和15.2 g·kg-1組及模型+TSM 2.6 g·kg-1組ET-1，TXB-2和IL-1β降低（P＜0.05，P＜0.01），6-K-PGF1α升高（P＜0.01）（表4）。

Tab.4 Effect of MLST on plasma inflammatory factors and thrombotic factors in TAO model rats

2.5 MLST對(duì)TAO模型大鼠股動(dòng)脈和股靜脈組織病理變化的影響

股動(dòng)脈：假手術(shù)組股動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，中膜細(xì)胞排列有序，外膜和外膜結(jié)締組織無炎癥細(xì)胞浸潤；TAO模型組，中膜、外膜以及外膜結(jié)締組織內(nèi)膜均被炎癥細(xì)胞浸潤，內(nèi)膜細(xì)胞脫落嚴(yán)重，管腔極度狹窄，細(xì)胞排列紊亂；模型+MLST 3.8，7.6和15.2 g·kg-1組和模型+TSM 2.6 g·kg-1組股動(dòng)脈病變均有不同程度降低（圖2A）。股靜脈：假手術(shù)組膜內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤；TAO模型組內(nèi)膜、中膜和外膜均有炎癥細(xì)胞浸潤，內(nèi)膜細(xì)胞有脫落；模型+MLST 3.8，7.6和15.2 g·kg-1組和模型+TSM 2.6 g·kg-1組內(nèi)膜細(xì)胞無脫落，中膜和外膜炎性細(xì)胞浸潤減少，病變程度均有所減輕（圖2B）。

Fig.2 Effect of MLST on pathological changes of arteriovenous tissue of femoral artery（A）and femoral vein（B）of TAO model rats by HE staining.See Fig.1 for the rat treatment and Tab.2 for detection time.The gray arrow shows the Intima，the red arrow represents the media，and the blue arrow represents the adventitia.

2.6 MLST對(duì)TAO模型大鼠股動(dòng)脈組織NF- κB表達(dá)的影響

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，與假手術(shù)組相比，TAO模型組大鼠股動(dòng)脈組織NF-κB表達(dá)升高（P＜0.01）；與TAO模型組相比，模型+TSM 2.6 g·kg-1組及模型+MLST 3.8，7.6和15.2 g·kg-1組股動(dòng)脈組織NF-κB表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of MLST on expression of NF- κB in femoral artery of TAO model rats by immunofluorescence assay.See Fig.1 for the rat treatment and Tab.2 for detection time.FI：fluorescence intensity.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with TAO model group.

3 討論

本研究采用月桂酸鈉注射法成功制備了大鼠TAO模型，并探討了MLST對(duì)TAO的治療作用。結(jié)果顯示，TAO模型大鼠股動(dòng)脈和股靜脈組織形態(tài)均發(fā)生明顯病理變化，炎癥細(xì)胞顯著增多；模型+MLST組大鼠股動(dòng)脈和股靜脈炎癥細(xì)胞浸潤出現(xiàn)了不同程度的降低，其中模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組股動(dòng)脈和股靜脈的內(nèi)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯改善。本研究將動(dòng)脈和靜脈分別取樣觀察，發(fā)現(xiàn)靜脈的病理特征與動(dòng)脈類似，均被炎癥細(xì)胞浸潤，表明該模型對(duì)動(dòng)、靜脈均造成損傷。目前MLST僅用于淺靜脈炎的治療。本研究結(jié)果顯示，MLST給藥后大鼠動(dòng)脈和靜脈的損傷均有改善。但這可能是多種因素共同作用的結(jié)果，還需進(jìn)一步研究。

內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜構(gòu)成了血管的天然屏障，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用［14］。造模時(shí)月桂酸鈉注入造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮細(xì)胞在損傷狀態(tài)下，向血液循環(huán)系統(tǒng)釋放多種細(xì)胞因子，如ET-1和IL-1β等。ET-1是血管內(nèi)皮功能受損的標(biāo)志物，可引起細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)控平滑肌增殖，最終導(dǎo)致炎癥損傷加重［15］。IL-1β除作用于內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致其損傷外，還可與表面受體結(jié)合，通過酶反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生損傷物質(zhì)，導(dǎo)致其損傷或壞死［16］。當(dāng)全身循環(huán)炎癥反應(yīng)加重時(shí)，全身的免疫系統(tǒng)被激活，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等亦增多，這與本研究模型組檢測(cè)結(jié)果相符。與模型組相比，模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組血漿中ET-1和IL-1β表達(dá)降低，股動(dòng)脈組織NF-κB表達(dá)下降，表明MLST減輕血管內(nèi)皮損傷程度，同時(shí)抑制NF-κB信號(hào)激活，使血管內(nèi)炎癥因子釋放減少，也減輕了IL-1β所介導(dǎo)的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用；模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)目下降，提示MLST能減輕全身炎癥反應(yīng)，具有抗炎作用。

TXB2和6-KPGF1α分別是血栓素A2和前列腺素I2的穩(wěn)定水解產(chǎn)物。血栓素A2可促進(jìn)血小板聚集和黏附，引起血管收縮，血小板聚集，使血液黏稠度增加，引發(fā)血栓形成；前列腺素I2可以保護(hù)血管，抑制血小板的聚集，調(diào)節(jié)微血管血流［17-18］。在正常狀態(tài)下，體內(nèi)兩者之間達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡，TAO狀態(tài)下血栓素A2增多，前列腺素I2降低，體內(nèi)凝血-抗凝血平衡被打破，凝血功能亢進(jìn)，凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，血液處于高凝狀態(tài)，血小板聚集，最終導(dǎo)致血栓的形成。與模型組相比，模型+MLST 3.8和7.6 g·kg-1組TXB2表達(dá)降低和6-KPGF1α表達(dá)升高，PT，APTT和TT延長，表明MLST可能通過選擇性地抑制血小板中TXA2的產(chǎn)生，同時(shí)保留前列腺素I2的合成來調(diào)節(jié)體內(nèi)的凝血-抗凝血平衡，改善凝血狀態(tài)，使血液黏度降低，抑制血小板的聚集，最終抑制血栓形成。

綜上所述，MLST對(duì)TAO模型大鼠的治療作用主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：①抑制炎癥因子，改善血管內(nèi)損傷狀態(tài)；②抑制血小板聚集，降低血液黏度，改善凝血和微循環(huán)。這可能與其調(diào)控血漿IL-1β，ET-1，TXB2和6-K-PGF1α等炎癥因子和凝血因子相關(guān)。