破骨細(xì)胞分化因子及其相關(guān)因子在慢性化膿性中耳炎肉芽組織中的表達(dá)

陳翠霞，錢迪，鄭偉昌，黃俊煊，周軍，湯國棟，潘珊珊

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科，廣東 深圳 518000)

慢性化膿性中耳炎發(fā)病與病毒、細(xì)菌、真菌等感染密切相關(guān)，主要臨床特點包括鼓膜穿孔、反復(fù)耳流膿和聽力降低，嚴(yán)重者會出現(xiàn)顱內(nèi)外并發(fā)癥[1]。中耳炎開始于黏膜，黏膜隨著病情不斷發(fā)展遭到破壞，肉芽組織增生，膿液中的酶和炎性細(xì)胞進(jìn)一步引起反應(yīng)性骨質(zhì)增生、硬化，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞，激發(fā)蝕骨，侵蝕中耳和內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引起不可逆的永久性聽力損傷和前庭功能障礙等嚴(yán)重的顱內(nèi)并發(fā)癥[2]。目前有關(guān)慢性化膿性中耳炎引起骨質(zhì)破壞的機制尚不完全明確，研究指出其可能與破骨細(xì)胞分化受到刺激有關(guān)[3]，多核成熟的破骨細(xì)胞附著于骨表面，形成參與骨質(zhì)破壞的吸收小室，而在破骨細(xì)胞的分化和活化中，骨髓微環(huán)境中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間的接觸發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究證實，破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL,又稱破骨細(xì)胞分化因子)是真正誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的重要因子[4]。RANKL由成骨細(xì)胞表達(dá)，被T淋巴細(xì)胞激活，是腫瘤壞死因子配體家族成員，其在巨噬細(xì)胞集落刺激因子的作用下可與破骨細(xì)胞產(chǎn)生的核因子-κB受體活化因子(RANK)發(fā)生特異性結(jié)合，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活化和分化以及破骨細(xì)胞在骨表面的骨吸收功能。上述作用則可通過骨保護(hù)素(OPG)與RANK的競爭性結(jié)合被完全抑制[5]。有研究指出，骨組織微環(huán)境中RANKL與OPG表達(dá)的相對水平可決定破骨細(xì)胞處于被抑制還是激活的狀態(tài)[6]。進(jìn)一步明確破骨細(xì)胞分化因子及其相關(guān)因子表達(dá)水平，將有助于后續(xù)探討如何通過調(diào)控RANKL-RNAK-OPG系統(tǒng)來有效清除病原體，預(yù)防和治療中耳炎。本文主要探討RANKL，RANK及OPG在慢性化膿性中耳炎肉芽組織中的表達(dá)情況，并通過與中耳膽脂瘤組肉芽組織和正常外耳道皮膚表達(dá)水平的比較來分析中耳炎的骨質(zhì)破壞機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年2月至2018年4月在本院接受治療的慢性化膿性中耳炎患者37例(慢性化膿性中耳炎組)、中耳膽脂瘤患者44例(中耳膽脂瘤組)、外傷性鼓膜穿孔患者20例(對照組)作為研究對象。患者均經(jīng)術(shù)前顳骨高分辨率CT和術(shù)后病理活檢證實。慢性化膿性中耳炎組男16例，女21例；年齡6～54歲，平均(32.52±10.19)歲，病程1～28年，平均(15.73±4.10)年；聽力損傷嚴(yán)重程度：輕度9例，中度18例，中重度8例，重度2例。中耳膽脂瘤組男19例，女25例；年齡5～52歲，平均(31.29±9.94)歲，病程1～30年，平均(16.28±5.06)年；聽力損傷嚴(yán)重程度：輕度11例，中度20例，中重度12例，重度1例。對照組男9例，女11例；年齡19～57歲，平均(34.73±13.52)歲，病程1～26年，平均(14.58±5.07)年；聽力損傷嚴(yán)重程度：輕度5例，中度11例，中重度4例。3組患者一般資料對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

由同一術(shù)者鉗取慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤患者的肉芽組織和外傷性鼓膜穿孔患者正常無感染患者的外耳道皮膚組織。用液氮冷凍標(biāo)本，置于—80℃冰箱中凍存待測。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法

將標(biāo)本置于10%的中性甲醛溶液中充分固定，常規(guī)石蠟包埋，制作成4μm厚切片。免疫組織化學(xué)試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作：常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)高壓修復(fù)抗原，使用3%過氧化氫甲醛阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS緩沖液清洗3次，滴加1滴非免疫性山羊血清封閉，室溫下封閉20min，滴加OPG、RANKL、RNAK多克隆兔IgG抗體，均由武漢博士德生物工程有限公司提供，工作濃度為1∶100，4℃下孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃下孵育30min，DAB顯色，顯色試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

由病理科醫(yī)師證實切片中抗原表達(dá)和定位，RANKL、RANK和OPG均以棕黃色顆粒出現(xiàn)為陽性表達(dá)，觀察3組患者RANKL、RANK和OPG表達(dá)的部位和細(xì)胞中的表達(dá)部位。高倍鏡(×400)下對每張切片進(jìn)行觀察，隨機選取切片中的10個視野，計數(shù)1000個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為陽性細(xì)胞表達(dá)率。

手術(shù)過程中對慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤患者的骨質(zhì)破壞程度進(jìn)行觀察和評價，具體標(biāo)準(zhǔn)為[7]：鼓室盾板和聽小骨輕微破壞為輕度；聽小骨和天蓋大部分被破壞為中度，迷路、聽小骨和外耳道后壁及面神經(jīng)管均受到破壞為重度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RANKL、RANK和OPG表達(dá)情況

RANKL陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)，部分細(xì)胞質(zhì)也可見著色，呈棕黃色；RANK在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特異性表達(dá)，呈棕黃色；OPG陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，部分也可見細(xì)胞核表達(dá)，呈棕黃色。RANKL、RANK和OPG在3組患者中均有表達(dá)。RANKL陽性表達(dá)細(xì)胞在慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤肉芽組織中主要為細(xì)胞質(zhì)不豐富的浸潤的炎性細(xì)胞，部分表達(dá)在成纖維細(xì)胞質(zhì)中，其在正常外耳道皮膚組織中則主要分布在皮下組織。RANK陽性細(xì)胞和OPG陽性細(xì)胞主要分布在慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤的肉芽組織中，其中RANK陽性細(xì)胞在骨質(zhì)吸收部位的破骨細(xì)胞中表達(dá)較強。見圖1～3。

圖1 RANKL在慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤肉芽組織(①～②陽性表達(dá)細(xì)胞主要為浸潤的炎性細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)為棕黃色)和正常外耳道上皮組織中的表達(dá)(③陽性細(xì)胞散在分布，較為常見)(×400)

圖2 RANK在慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤肉芽組織(①～②陽性表達(dá)細(xì)胞在多核破骨細(xì)胞中強表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)為棕黃色)和正常外耳道上皮組織中的表達(dá)(③陽性細(xì)胞較為少見)(×400)

圖3 OPG在慢性化膿性中耳炎、中耳膽脂瘤肉芽組織(①～②陽性表達(dá)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)為棕黃色)和正常外耳道上皮組織中的表達(dá)(③)(×400)

2.2 骨質(zhì)破壞情況

根據(jù)手術(shù)觀察，慢性化膿性中耳炎組中輕度骨質(zhì)破壞13例，中度18例，重度6例；中耳膽脂瘤組輕度骨質(zhì)破壞16例，中度20例，重度8例。兩組患者骨質(zhì)破壞嚴(yán)重程度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 慢性化膿性中耳炎與中耳膽脂瘤患者骨質(zhì)破壞情況比較[n(%)]

2.3 各組RANKL、RANK、OPG表達(dá)陽性細(xì)胞率及OPG/RANKL比較

慢性化膿性中耳炎組、中耳膽脂瘤組RANKL、RANK表達(dá)水平高于對照組， OPG/RANKL低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中耳膽脂瘤組RANKL、RANK表達(dá)水平高于慢性化膿性中耳炎組，OPG/RANKL低于慢性化膿性中耳炎組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3組患者OPG表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組RANKL、RANK、OPG表達(dá)陽性細(xì)胞率及OPG/RANKL比較

2.4 相關(guān)性分析

OPG/RANKL與慢性化膿性中耳炎組和中耳膽脂瘤組的骨質(zhì)破壞程度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.582,-0.621,P=0.025,0.011)。

3 討論

慢性化膿性中耳炎是中耳急性感染后未及時治療而發(fā)生的嚴(yán)重中耳炎癥，可影響患者的聽力，導(dǎo)致傳導(dǎo)性聾或混合性聾。研究指出，慢性化膿性中耳炎患者傳導(dǎo)性或混合性聾的嚴(yán)重程度與鼓岬和下鼓室黏膜病變、膽脂瘤、聽骨鏈破壞等因素密切相關(guān)，尤其是骨導(dǎo)聽力顯著受損者的聽骨鏈固定或壞死更為常見[8]。聽骨鏈?zhǔn)俏挥诠哪ず颓巴ゴ伴g的具有杠桿擴音功能的結(jié)構(gòu)，其可與鼓膜一起震動，將聲波傳入內(nèi)耳。中耳的傳導(dǎo)功能受勁度、質(zhì)量和摩擦阻力三大因素的影響，聽骨鏈?zhǔn)艿狡茐暮螅鋽U音的增益作用會隨勁度和質(zhì)量的增加而受到影響，傳音功能降低，同時損傷高頻和低頻氣導(dǎo)[9]。中耳肉芽、分泌物、膽脂瘤等病變均會破壞聽骨鏈，其具體的機制尚不明確。

骨的形態(tài)發(fā)育、破壞和重建包括成骨細(xì)胞生成骨基質(zhì)和破骨細(xì)胞吸收骨基質(zhì)的基礎(chǔ)生物過程，正常生理條件下二者狀態(tài)維持動態(tài)平衡，二者間作用的相對大小決定了骨是以重建為主還是破壞為主。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類酶、壓力效應(yīng)以及多種細(xì)胞因子之間的相互作用與骨質(zhì)吸收有關(guān)，這些機制會引起破骨細(xì)胞活性升高，進(jìn)而引起骨質(zhì)的吸收和破壞[10-11]。RANKL是由成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、激活的T淋巴細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生的一種可真正誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的因子。自1998年RANKL被發(fā)現(xiàn)以來，其在促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟和維持細(xì)胞功能方面?zhèn)涫荜P(guān)注，大量研究已經(jīng)證實，在破骨細(xì)胞的發(fā)生和分化中RANKL發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。RANKL在巨噬細(xì)胞集落刺激因子的存在下可特異性地與破骨細(xì)胞中的配體核因子-κB受體活化因子(RANK)結(jié)合活化破骨細(xì)胞[4,5,12]。OPG則是主要由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)表達(dá)的可與RANKL競爭性結(jié)合RANK的因子。骨組織微環(huán)境中OPG和RANKL表達(dá)量的相對水平是決定破骨細(xì)胞形成和活化的關(guān)鍵，二者的比例直接決定骨生成為主還是吸收為主[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，RANKL和OPG在膽脂瘤和正常皮膚中均有表達(dá)，前者主要表達(dá)于膽脂瘤中成纖維細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，后者則主要表達(dá)于炎性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，相比較正常外耳道皮膚，膽脂瘤中RANKL的表達(dá)水平和RANKL/OPG比值均明顯升高，因此RANKL和OPG均參與了膽脂瘤的骨質(zhì)破壞[14]。破骨細(xì)胞對膽脂瘤骨質(zhì)破壞作用極為明顯，多核、有褶皺緣的成熟破骨細(xì)胞在骨吸收區(qū)表面聚集、黏附，形成吸收小室，進(jìn)而產(chǎn)生骨質(zhì)破壞作用。RANKL和RANK在中耳膽脂瘤周圍組織表達(dá)水平顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異，二者表達(dá)的增高和骨質(zhì)破壞密切相關(guān)[15]。本文對慢性化膿性中耳炎患者肉芽組織的RANKL、RANK和OPG表達(dá)情況進(jìn)行觀察，與正常外耳道皮膚和中耳膽脂瘤肉芽組織進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，RANKL陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)，部分細(xì)胞質(zhì)也可見著色，呈棕黃色；RANK在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特異性表達(dá)，呈棕黃色；OPG陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，部分也可見細(xì)胞核表達(dá)，呈棕黃色。RANKL、RANK和OPG在化膿性中耳炎肉芽、中耳膽脂瘤肉芽和正常外耳道皮膚均有表達(dá)。本文結(jié)果顯示，慢性化膿性中耳炎組、中耳膽脂瘤組RANKL、RANK表達(dá)水平高于對照組，OPG/RANKL低于對照組 (P<0.05)；中耳膽脂瘤組RANKL、RANK表達(dá)水平高于慢性化膿性中耳炎組，OPG/RANKL低于慢性化膿性中耳炎組 (P<0.05)，3組患者OPG表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤肉芽組織中破骨細(xì)胞的主要活化途徑—RANKL/RANK/NF-κB通路處于過度活化狀態(tài)，其中中耳膽脂瘤相比慢性化膿性中耳炎這一信號通路的活化程度更高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，OPG/RANKL與慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞程度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。提示慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤肉芽組織中OPG/RANKL比值的降低是引起骨質(zhì)破壞的重要機制，降低的幅度與骨質(zhì)破壞的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

綜上所述，RANKL、RANK、OPG在正常外耳道皮膚及慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤患者肉芽組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平與骨質(zhì)破壞程度有關(guān)，RANKL、RANK表達(dá)水平的升高和OPG表達(dá)水平的降低在慢性化膿性中耳炎和中耳膽脂瘤的骨質(zhì)破壞機制中發(fā)揮了重要作用，而OPG與RANKL的比值作為一個評價骨質(zhì)破壞的指標(biāo)應(yīng)用于臨床，有一定參考價值。