初診多發(fā)性骨髓瘤患者T細(xì)胞亞群和骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)與意義

馬銀娟，楊柯，楊夏影，擺姣鳳，白海，吳濤，付麗華，姜俊峰，潘耀柱

0 引言

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是繼非霍奇金淋巴瘤后第二常見(jiàn)的血液漿細(xì)胞惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與免疫功能密切相關(guān)[1]?；诩膊‘愘|(zhì)性及耐藥性，盡管新型免疫療法如蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、CAR-T細(xì)胞治療以及CD38單克隆抗體Daratumumab等療法延長(zhǎng)了患者生存期，目前MM仍無(wú)法治愈，深入探索MM免疫系統(tǒng)特征將有助于新型免疫治療的發(fā)展。

程序性死亡受體-1（programmed death-1,PD-1）/程序性死亡配體-1/2（programmed death-Ligand 1/2,PD-L1/2）通路是目前抗腫瘤新免疫療法研究熱點(diǎn)之一。作為負(fù)性共刺激分子，PD-1主要表達(dá)于激活和（或）衰竭的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK和抗原提呈細(xì)胞[2]，PD-L1在各種實(shí)體瘤及免疫細(xì)胞亞群表達(dá)[3]，PD-L2主要在激活的樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞表達(dá)[4]。在MM骨髓微環(huán)境中PD-1與PD-L1/2結(jié)合可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、遷移和增殖[1-2,5]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療黑色素瘤等實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)已獲得了良好的反應(yīng)，其在血液系統(tǒng)疾病的研究較晚，近期在晚期MM患者的應(yīng)用取得了一定的臨床療效，免疫檢查點(diǎn)抑制劑作為治療MM的新手段逐漸被人們認(rèn)識(shí)。

目前各研究小組對(duì)MM患者免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)水平及臨床特征的研究尚無(wú)統(tǒng)一定論。本研究通過(guò)觀察MM患者骨髓CD4+和CD8+T細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1/2的表達(dá)水平，分析3種負(fù)性共刺激分子表達(dá)特點(diǎn)與臨床特征的關(guān)系，以期為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療MM提供一定的試驗(yàn)依據(jù)及方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2020年12月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院收治的22例初診多發(fā)性骨髓瘤（newly diagnosed multiple myeloma,NDMM）患者及同期18例健康對(duì)照者臨床資料；符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》（2017年）[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者為NDMM組；排除臨床資料不完整的MM患者、使用Daratumumab單抗化療的MM患者、冒煙型骨髓瘤患者和孤立性漿細(xì)胞瘤患者；排除孕期或哺乳期、合并有自身免疫性疾病、其他腫瘤及傳染性疾病的患者。本研究已通過(guò)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

收集NDMM和對(duì)照組骨髓標(biāo)本，利用流式細(xì)胞術(shù)分選有核細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中PD-1、PD-L1/2的表達(dá)水平，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析患者PD-1、PD-L1/2的表達(dá)量與臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)性?；颊叩囊话闩R床數(shù)據(jù)包括性別、年齡、免疫分型、Durie-Salmon（DS）分期亞型、國(guó)際分期體系（ISS分期）和mSMART 3.0危險(xiǎn)分層。

1.3 主要試劑及儀器

所用熒光單克隆抗體：FITC標(biāo)記的CD38單抗、APC標(biāo)記的CD138單抗、PE標(biāo)記的CD273（PD-L2）單抗、CD274（PD-L1）單抗、CD279單抗（PD-1）均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；所用熒光單克隆抗體：FITC標(biāo)記的CD4單抗、PerCPcy5.5標(biāo)記的CD8單抗均購(gòu)自美國(guó)Bioscience或Bio-Legend公司；流式細(xì)胞儀為德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司的MACSQuantifyTM。

1.4 標(biāo)本采集與處理

收集MM患者及對(duì)照組骨髓標(biāo)本1 ml，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。流式?xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群和骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)水平。

將1 ml骨髓加入緩沖液離心洗滌后棄上清液；取已加入CD4和CD8單抗的3支流式管中和已加入CD38和CD138單抗的3支流式管，兩組分別加入PD-1、PD-L1及PD-L2單抗；在6支流式管中加入制備好的骨髓100 μl并混勻，避光孵育10 min；溶血、洗滌及離心后加入500 μl緩沖液上機(jī)檢測(cè)。采用FSC/SSC雙參數(shù)設(shè)門(mén)，獲取1×104個(gè)以上有核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，分析CD4+、CD8+T細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞占有核細(xì)胞比例及其PD-1、PD-L1與PD-L2的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0與GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料若呈正態(tài)分布以（x±s）表示，若呈偏態(tài)分布以M（P25-P75）表示；計(jì)量資料組間對(duì)比若符合正態(tài)分布且方差齊則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用近似t檢驗(yàn)；計(jì)量資料組間對(duì)比若不符合正態(tài)分布則采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

22例NDMM患者中，男12例（54.55%），女10例（45.45%），平均年齡（62±11）歲，其中≥65歲患者10例（45.45%），＜65歲12例（54.55%）。免疫分型：IgG型10例（45.45%）、IgA型4例（18.18%）、κ型4例（18.18%）、λ型4例（18.19%）。DS分期：Ⅰ期2例（9.10%）、Ⅱ期2例（9.10%）、Ⅲ期18例（81.80%）；DS亞型：A型9例（40.91%）、B型13例（59.09%）。ISS分期：Ⅰ期3 例（13.63%）、Ⅱ期7例（31.82%）、Ⅲ期12例（54.55%）。根據(jù)美國(guó)梅奧醫(yī)院（Mayo Clinic）2018年發(fā)布的多發(fā)性骨髓瘤mSMART 3.0危險(xiǎn)分層分為標(biāo)危組15例（68.18%）、高危組7例（31.82%）。

2.2 NDMM和對(duì)照組CD4+、CD8+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值

NDMM組CD8+T細(xì)胞水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）；NDMM組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）；NDMM組CD4+T細(xì)胞水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.572），見(jiàn)表1。

表1 NDMM和對(duì)照組T細(xì)胞亞群水平及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值水平Table 1 Proportion of T cell subsets and CD4+/CD8+ ratio in NDMM and control groups

2.3 NDMM和對(duì)照組CD4+、CD8+T細(xì)胞中PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)

NDMM組CD4+T細(xì)胞中PD-1和PD-L2的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001；P=0.001）；NDMM組中CD4+T細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.326）；NDMM組中CD8+T細(xì)胞PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)與對(duì)照組間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.423；P=0.211；P=0.348），見(jiàn)圖1、表2。

表2 NDMM與對(duì)照組CD4+T和CD8+T細(xì)胞中PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)Table 2 Expression of PD-1,PD-L1 and PD-L2 in CD4+T and CD8+T cells in NDMM and control groups

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群和骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)Figure 1 Expression of PD-1,PD-L1 and PD-L2 in T cell subsets and myeloma cells detected by flow cytometry

2.4 NDMM骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)

NDMM組骨髓瘤細(xì)胞中PD-1的表達(dá)水平為（37.28±20.97）%，PD-L1的表達(dá)水平為（95.33±6.56）%，PD-L2的表達(dá)水平為44.7（33.20～48.12）%。

2.5 CD4+T、CD8+T細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1及PD-L2表達(dá)與NDMM患者臨床特征的關(guān)系

PD-1、PD-L1及PD-L2水平與NDMM患者性別、年齡、免疫分型、DS分期和亞型、ISS分期及mSMART3.0分層差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3～5。

3 討論

MM的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞特異性抗原被淋巴細(xì)胞識(shí)別并攻擊時(shí)，一方面活化T細(xì)胞使其表達(dá)PD-1并產(chǎn)生γ鏈細(xì)胞因子，與白介素-21及干擾素-γ共同誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞表達(dá)PD-L1，另一方面活化B細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞使其分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF），與白介素-4誘導(dǎo)PD-L2的表達(dá)[7-8]，PD-1與PD-L1/2的結(jié)合使T細(xì)胞衰老并功能衰竭，導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞遷移和增殖[1-2]。這種抑制并未破壞T細(xì)胞的功能，阻斷PD-1/PD-L1/2通路可激活和恢復(fù)T細(xì)胞功能并對(duì)抗腫瘤進(jìn)展[1]。

MM多處于免疫功能失調(diào)狀態(tài)[9]。目前有關(guān)MM免疫功能的研究有限且說(shuō)法不一，但幾乎所有結(jié)果都提示存在CD4+/CD8+比值失調(diào)[9-11]。國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究致力于MM外周血水平的免疫功能，多表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞減少[12]，部分表現(xiàn)為CD8+T細(xì)胞升高[12-13]；骨髓水平免疫亞群的研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)有關(guān)MM骨髓免疫狀態(tài)的研究非常有限，相當(dāng)部分研究小組認(rèn)為主要為CD4+T細(xì)胞減少[10-12]；也有人觀察到以CD8+T細(xì)胞升高為主[14]。本研究觀察到NDMM骨髓CD4+/CD8+T細(xì)胞比值降低，分析細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為CD8+T細(xì)胞增多，CD4+T細(xì)胞無(wú)差異。前者可能與骨髓CD8+T細(xì)胞抑制造血干細(xì)胞動(dòng)員的功能減退以及CD8+T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞抗原作用下活化形成發(fā)揮特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）有關(guān)，但這種活化的CTL無(wú)法分泌穿孔素、白介素-2和干擾素-γ等細(xì)胞因子發(fā)揮細(xì)胞毒作用，多表現(xiàn)為衰老及功能受限[13]；CD4+T細(xì)胞無(wú)差異可能與腫瘤微環(huán)境中對(duì)其免疫抑制作用相對(duì)較小有關(guān)。

PD-1/PD-L1/2通路在MM免疫功能失調(diào)中發(fā)揮重要作用抑。首先，本研究觀察到T淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞上PD-1的高表達(dá)（PD-1highCD4+T），CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異，當(dāng)PD-1highCD4+T細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)分子配體結(jié)合會(huì)抑制CD4+T細(xì)胞功能；其次，本研究還觀察到骨髓瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1（PD-L1highTumer），CD4+與CD8+T細(xì)胞PD-L1表達(dá)與對(duì)照組差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來(lái)看有升高趨勢(shì)，且不論在骨髓瘤細(xì)胞還是T淋巴細(xì)胞PD-L1表達(dá)率多高于84.00%，當(dāng)PDL1highTumer細(xì)胞分別與PD-1highCD4+T細(xì)胞以及增多的CD8+T細(xì)胞相互作用也會(huì)抑制CD4+與CD8+T細(xì)胞功能；隨后，本研究又觀察了PD-L2在T淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞PD-L2的表達(dá)升高（PD-L2highCD4+T），CD8+T細(xì)胞表達(dá)較CD4+T細(xì)胞少約10%，PD-L2highCD4+T細(xì)胞與PDL1highTumer細(xì)胞相互作用抑制CD4+T細(xì)胞功能；以上細(xì)胞之間負(fù)性共刺激分子的相互作用使T淋巴細(xì)胞（尤其是CD4+T細(xì)胞）功能失調(diào)、功能缺陷甚至失活，最終使骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)MM耐藥及進(jìn)展。

表4 CD8+T細(xì)胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)與NDMM患者臨床特征的關(guān)系Table 4 Correlation of PD-1,PD-L1 and PD-L2 expression in CD8+T cells with clinical features of NDMM patients

表5 骨髓瘤細(xì)胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的表達(dá)與NDMM患者臨床特征的關(guān)系Table 5 Correlation of PD-1,PD-L1 and PD-L2 expression in myeloma cells with clinical features of NDMM patients

本研究進(jìn)一步研究了MM患者機(jī)體免疫功能缺陷與臨床特征的關(guān)系。通過(guò)分別對(duì)CD4+、CD8+T細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)與性別、年齡、DS分期及亞型、免疫表型、ISS分期及mSMART3.0危險(xiǎn)分層進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)以上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Crescenzi等結(jié)果一致[15-16]。有研究認(rèn)為PD-L1水平與個(gè)體免疫系統(tǒng)的狀況相關(guān)[16]。現(xiàn)有的研究無(wú)法解釋這種現(xiàn)象，考慮到本研究涉及的臨床特征較少，期待后期大樣本、多中心以及多種臨床特征的研究能給我們帶來(lái)答案。

綜上，MM患者多伴有免疫功能失調(diào)，可能與表達(dá)PD-1及PD-L1/2的T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)，阻斷此通路或可對(duì)抗骨髓瘤細(xì)胞增殖潛力及耐藥性。期待進(jìn)一步的研究可以具體闡明T細(xì)胞亞群及功能（包括增殖和細(xì)胞毒性），提供細(xì)胞免疫抑制的整體概況，也希望后續(xù)基于MM治療方案的多中心大樣本的PD-1/PD-L1/2通路研究能給我們帶來(lái)新思路。