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    單增李斯特菌對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活

    2022-02-23 09:32:12李文艷陳瀅瀅董子怡劉婕肖鋒張宇航
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層焦亡流產(chǎn)

    李文艷,陳瀅瀅,董子怡,劉婕,肖鋒,張宇航

    (1.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北省炎性自身免疫性疾病發(fā)病機制及防治重點實驗室,河北 保定 071000)

    單增李斯特菌(Lisetriamonocytogenes, LM)是一種食源性人獸共患病原菌,在自然界廣泛存在,妊娠動物和孕婦嚴(yán)重感染后可引發(fā)流產(chǎn),嚴(yán)重影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類生殖健康[1-2],但其作用機制尚不清楚.研究顯示,LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)與母胎界面炎性體的激活有關(guān)[3].胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞是母胎界面的一種重要細(xì)胞,在成功妊娠過程中發(fā)揮著重要作用[4],并且細(xì)胞中有多種炎性體表達(dá)[5],LM是否可激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體以及LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)是否和LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體有關(guān)鮮見報道.因此,本實驗用野生型LM和溶血素O(listeriolysin O,LLO)缺陷型LM (ΔhlyLM)感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞,分析LM對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活和LLO在其中的作用以及炎性體激活對滋養(yǎng)層細(xì)胞死亡率的影響,初步明確LM對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活及其與LM誘導(dǎo)流產(chǎn)的關(guān)系,為探討LM引起流產(chǎn)的機理和臨床防治提供科學(xué)依據(jù).

    1 材料和方法

    1.1 菌株和細(xì)胞株

    小鼠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系SM9-1和菌株L.monocytogenesEGD (serovar 1/2a)分別由美國堪薩斯大學(xué)Joan Hunt教授和日本京都大學(xué)Masao Mitsuyama博士惠贈.

    1.2 主要試劑

    胎牛血清和培養(yǎng)基RPMI-1640購自Gibco BRL公司;重組小鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase 1) 抑制劑zYVAD-FMK 和LPS購自Sigma公司.美洲倉鼠抗小鼠IL-1β抗體,生物素標(biāo)記的兔抗小鼠IL-1β抗體購自eBioscience公司;辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的IL-1β二抗購自Thermo公司;兔抗鼠半胱氨酸的caspase 1 p10和羊抗兔IgG-AP購自Santa Cruz公司;CytoTox96?非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Promega公司;鼠源BrdU抗體、驢抗鼠Alexa Fluor594和DAPI購自Abcam公司.

    1.3 LM對滋養(yǎng)層細(xì)胞感染的免疫熒光檢測

    將生長良好的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1鋪于放有cover slip的24孔板中,次日用對數(shù)生長期的LM感染細(xì)胞1 h,50 μg/mL慶大霉素處理1 h以殺死胞外菌,40 g/L PFA固定30 min,通透液通透15 min,封閉液封閉后,分別與一抗和熒光二抗Alexa Fluor 488在濕盒中孵育,DAPI進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染色,封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察.

    1.4 LM對滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活

    將生長狀態(tài)良好的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板,隨機分組,次日,LM感染組分別加入含相應(yīng)數(shù)量LM的V-15培養(yǎng)基,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,吸出菌懸液,加入含慶大霉素的培養(yǎng)基殺菌1 h,棄去培養(yǎng)基,加入新的V-15培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h.LPS處理組用LPS(0.5 μg/mL)處理細(xì)胞6 h,LM和LPS共處理組中LPS與LM同時處理6 h,LPS和ATP共處理組加入LPS預(yù)處理4 h后再加入ATP(5 mmol/L)刺激1 h,收集培養(yǎng)基,離心后取上清液待用,細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液在4 ℃搖床過夜裂解,次日離心取上清液待用.

    1.5 ELISA檢測IL-1β蛋白水平

    取收集的細(xì)胞培養(yǎng)基,用IL-1β捕獲抗體包被96孔板過夜,封閉液37 ℃封閉2 h,每孔加入50 g/L脫脂牛奶稀釋的待測樣品100 μL,然后依次加入檢測抗體、酶標(biāo)抗體,分別孵育2 h,顯色后,采用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長的吸光度(A450),計算IL-1β的濃度.

    1.6 Western-blot檢測caspase 1水平

    取制備的細(xì)胞裂解液,100 g/L SDS-PAGE電泳后,在恒流180 mA條件下采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,然后分別用羊抗鼠caspase 1和羊抗兔IgG-AP抗體進(jìn)行孵育,底物NBT和BCIP顯色,掃描儀掃描雜交譜帶.

    1.7 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測細(xì)胞死亡

    將生長良好的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板,隨機分為 4 組:空白對照組、LM感染組、LM與zYVAD-FMK共處理組、zYVAD-FMK處理組.空白對照組和LM感染組按照1.4中的方法處理細(xì)胞,LM與zYVAD-FMK共處理組中加入zYVAD-FMK(10 μmol/L)12 h后用LM刺激,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至所需時間后,按照非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書計算細(xì)胞毒性百分比,分析小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞的死亡率.

    1.8 統(tǒng)計方法

    通過SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.數(shù)據(jù)間均數(shù)差異分析采用t檢驗方法.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LM對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞的感染和最適感染比的確定

    LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1后,經(jīng)慶大霉素處理,用LM熒光抗體對LM進(jìn)行染色(綠色熒光),DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色(藍(lán)色熒光),激光共聚焦顯微鏡觀察LM的分布,結(jié)果顯示,視野中可觀察到LM的存在,并且LM主要分布在細(xì)胞核周圍(圖1a),說明LM能夠感染進(jìn)入小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞,因為慶大霉素能夠殺死細(xì)胞外的細(xì)菌,只有感染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌能夠存活.

    為分析LM感染能否促進(jìn)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β的表達(dá)并確定最適感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI),用不同MOI的LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞,ELISA檢測培養(yǎng)基中IL-1β水平.結(jié)果顯示,感染6 h后,每個感染組與對照組相比,培養(yǎng)基中IL-1β水平明顯升高,并且當(dāng)MOI =50時培養(yǎng)基中IL-1β的水平達(dá)到最高(圖1b).

    *與對照組相比差異顯著(P<0.05).圖1 LM感染滋養(yǎng)層細(xì)胞后的熒光染色(a)和IL-1β的分泌(b)Fig.1 Fluorescence staining (a) and IL-1β secretion (b) of trophoblastic cells infected by LM

    2.2 LM對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活

    用LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1(MOI=50)6 h后,與空白對照組相比,LM感染組培養(yǎng)基中IL-1β水平明顯升高,并且LPS與LM共處理組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β水平與單獨LM處理組相比略有升高,但差異不顯著(圖2a),說明LM既可以促進(jìn)IL-1β前體的產(chǎn)生又可以促進(jìn)IL-1β的成熟.Western blot結(jié)果顯示,LM感染組與對照組相比,caspase 1 p10片段水平明顯增加(圖2b),進(jìn)一步表明LM可以激活滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體,促進(jìn)IL-1β前體的成熟和釋放.

    ** 與對照組相比差異極顯著(P<0.01).圖2 LM感染對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β(a)和caspase 1(b)活化的影響Fig.2 Effects of LM infection on the activation of IL-1β (a) and caspase 1 (b) in mouse trophoblastic cells

    2.3 LM對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞caspase 1依賴焦亡的誘導(dǎo)

    用LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞,CytoTox96? 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放量,評估細(xì)胞焦亡率.結(jié)果顯示,LM感染6 h后,小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞的LDH釋放量明顯高于對照組,說明細(xì)胞已開始發(fā)生焦亡,感染12 h后,LDH釋放量升高更加明顯,說明有較多的細(xì)胞發(fā)生焦亡,但是加入caspase 1抑制劑zYVAD-FMK的LM感染組,無論是感染6 h還是12 h后,LDH的釋放量明顯低于沒有加zYVAD-FMK的LM感染組,說明LM可通過激活滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡(圖3).

    ** 與對照組相比差異極顯著(P<0.01).

    2.4 LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體與LLO的關(guān)系

    分別用野生型LM和ΔhlyLM感染滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1,檢測培養(yǎng)基中IL-1β水平和細(xì)胞裂解液中caspase 1 p10水平,結(jié)果顯示,野生型LM刺激后小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β水平明顯高于對照組和ΔhlyLM感染組(圖4a),同時與對照組和ΔhlyLM感染組相比,LM組caspase 1 p10的產(chǎn)生明顯增多(圖4b),說明LLO在LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體中發(fā)揮著重要作用.

    圖4 LLO對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β(a)和caspase 1(b)活化的影響Fig.4 Effects of LLO on the activation of IL-1β (a) and caspase 1 (b) in mouse trophoblastic cells

    3 討論

    LM感染可致妊娠動物和孕婦流產(chǎn),嚴(yán)重影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)和人類生殖健康[1-2],但其致流產(chǎn)的機制尚不清楚.體內(nèi)實驗已經(jīng)證實,LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)與母胎界面炎性體的激活有關(guān)[3],本研究在本實驗室已有體內(nèi)實驗的基礎(chǔ)上[3],在體外通過分析LM對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活及其誘導(dǎo)的死亡探討LM誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)的機制.

    在妊娠過程中,胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞不僅是成功妊娠的物質(zhì)基礎(chǔ),還是母胎界面特殊的天然免疫細(xì)胞[6],其中有多種炎性體表達(dá).炎性體是免疫細(xì)胞內(nèi)的一類模式識別受體,通過識別病原相關(guān)分子模式和危險信號分子招募和活化caspase 1,激活I(lǐng)L-1β和IL-18前體的成熟[7-8],在LM感染過程中,炎性體適度的激活對妊娠具有保護(hù)作用[9-10],但過度的激活可導(dǎo)致免疫失衡和組織損傷,誘導(dǎo)妊娠失敗[3,5].本文的實驗結(jié)果顯示,LM感染可激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體,誘導(dǎo)IL-1β的成熟分泌,異常的IL-1β水平則會改變母胎界面的免疫平衡,導(dǎo)致妊娠失敗[11-12],這可能是LM誘導(dǎo)流產(chǎn)的一個重要因素.

    妊娠過程中,胎盤細(xì)胞的正常死亡對妊娠的維持具有重要作用,但是胎盤細(xì)胞死亡率過高或過低均會導(dǎo)致妊娠失敗[13].研究顯示,LM誘導(dǎo)的MAPK脫磷酸化使細(xì)胞中抗凋亡因子血紅素加氧酶-1表達(dá)下降引發(fā)的胎盤細(xì)胞凋亡與LM引發(fā)的流產(chǎn)有關(guān)[14].caspase 1依賴的焦亡是細(xì)胞死亡的另一種方式,關(guān)于LM感染后滋養(yǎng)層細(xì)胞是否會發(fā)生焦亡還未見報道,本文的結(jié)果顯示,LM可誘導(dǎo)caspase 1依賴的滋養(yǎng)層細(xì)胞焦亡,這可能是LM誘導(dǎo)流產(chǎn)的又一重要因素.

    LLO是LM的一個重要的毒力因子,在LM感染宿主細(xì)胞過程中通過其成孔毒性發(fā)揮著重要的作用,另外本文的體內(nèi)實驗已經(jīng)證實,在LM誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)的過程中,LLO可通過激活巨噬細(xì)胞炎性體發(fā)揮重要作用[3],但LLO是否可激活母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體還未見報道.本文的結(jié)果顯示,ΔhlyLM感染的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的IL-1β和caspase 1 p10水平明顯低于野生型LM感染組,說明LLO在LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的過程中發(fā)揮著重要的作用.

    綜上,LM誘導(dǎo)的流產(chǎn)可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體激活誘導(dǎo)的IL-1β分泌水平增加和細(xì)胞焦亡有關(guān),在此過程中LM的毒力因子LLO發(fā)揮著重要的作用.

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