新疆黑槌蟲草羽束梗孢菌的液體深層發(fā)酵控制

張慧濤，王志方，侯新強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，新疆 烏魯木齊 830091)

新疆黑槌蟲草生長在新疆北疆阿爾泰山山區(qū)，分布于海拔1 250～2 000 m半陰半陽坡，是全年均可采收的新疆特色蟲草物種，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和腎臟保護(hù)性等生物活性[1]，但人工模擬新疆黑槌蟲草天然生長環(huán)境難度較大，難以獲得黑槌蟲草。我所從天然新疆黑槌蟲草菌核組織中分離培養(yǎng)出性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的羽束梗孢菌株：CGMCC新槌12，并采用液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)新疆黑槌蟲草羽束梗孢菌菌絲體，然后再將發(fā)酵液制成菌粉和發(fā)酵濾液。發(fā)酵生產(chǎn)的羽束梗孢菌菌粉主要成分與天然黑槌蟲草基本相同，亦與青海產(chǎn)冬蟲夏草相當(dāng)[2]。毒理和藥理研究表明，菌粉和發(fā)酵液安全無毒，濾清液與天然蟲草的浸出液一樣，味苦而純正，適合口服。

黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵生產(chǎn)屬于菌種的純種培養(yǎng)過程,如果發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)有其他微生物存在，就視為染菌。導(dǎo)致染菌的原因很多，均會導(dǎo)致發(fā)酵失敗。黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵周期較長，在每級種子罐要生產(chǎn)7 d以上，逐級轉(zhuǎn)到最終發(fā)酵罐后則要發(fā)酵2周左右，如此長周期的發(fā)酵如果存在雜菌很容易造成發(fā)酵失敗。經(jīng)過多批次的發(fā)酵，我們總結(jié)了羽束梗孢菌的發(fā)酵控制技術(shù)，將黑槌蟲草發(fā)酵成功率從最初不到50 %提高到目前的90 %以上。筆者從發(fā)酵的配套裝備和發(fā)酵過程控制方面分析黑槌蟲草羽束梗孢菌的發(fā)酵控制。

1 發(fā)酵裝備的關(guān)鍵點和相關(guān)改進(jìn)

發(fā)酵罐在使用之前,需要認(rèn)真檢查,以消除設(shè)備隱患,還要重點注意以下幾個方面。

1.1 發(fā)酵罐機(jī)械密封

機(jī)械密封目前在發(fā)酵罐上得到廣泛應(yīng)用，利用機(jī)械密封動靜環(huán)的旋轉(zhuǎn)摩擦密封取代了以前攪拌軸填料函密封形式。由于動靜環(huán)的旋轉(zhuǎn)摩擦需要潤滑，通常采用無菌水潤滑動靜環(huán)接觸旋轉(zhuǎn)部位，但是黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵周期較長，在自然蒸發(fā)和發(fā)酵罐上攪拌電機(jī)散熱風(fēng)扇的風(fēng)力共同作用下，潤滑的水容易蒸干，如果值班人員沒有注意，動靜環(huán)旋轉(zhuǎn)摩擦?xí)r會發(fā)出異響和振動，導(dǎo)致密封失效而發(fā)生泄露，很容易造成發(fā)酵染菌。為此，我們在發(fā)酵罐的動靜環(huán)接觸旋轉(zhuǎn)部位用甘油代替了無菌水，在發(fā)酵罐進(jìn)行實消時將固體甘油抹在動靜環(huán)接觸旋轉(zhuǎn)部位邊上，利用發(fā)酵罐實消時的熱量將甘油融化，滲入動靜環(huán)，等到發(fā)酵罐實消結(jié)束后仍然有油膜留在動靜環(huán)接觸面上，從而實現(xiàn)良好潤滑。

經(jīng)過黑槌蟲草數(shù)批次的發(fā)酵，證明此方法簡單可靠，降低了值班人員的操作失誤，提高了發(fā)酵成功率。

1.2 管道

管道的連接一般有焊接、螺紋連接和法蘭連接三種，在我所發(fā)酵中試車間，法蘭連接是發(fā)酵管道連接的主要方式。法蘭之間一般均采用石棉墊片，但是黑槌蟲草的發(fā)酵產(chǎn)物由于可以作為食品或藥品使用，法蘭之間不能采用有毒的石棉墊片。因此凡是能夠與發(fā)酵液接觸的管道連接法蘭墊片都更換成了聚四氟乙烯墊片。這種材料無毒、耐高溫、耐腐蝕、有彈性、不吸水，除了價格高外十分適合發(fā)酵行業(yè)。但聚四氟乙烯墊片高溫時在法蘭緊固螺栓的作用下，會發(fā)生塑性變形，使法蘭緊固螺栓松動，導(dǎo)致法蘭連接不緊密而泄露。因此在法蘭經(jīng)過高溫蒸汽之后，必須要重新緊固連接螺栓。

發(fā)酵罐內(nèi)一般設(shè)置有視鏡來觀察發(fā)酵液的情況，在罐內(nèi)也配有相應(yīng)沖洗透鏡的的蒸汽管道，蒸汽如果冷凝在管道中，就失去了滅菌能力，為消除黑槌蟲草羽束梗孢菌的染菌隱患，應(yīng)去除這類蒸汽管道。

1.3 空氣凈化系統(tǒng)

目前國內(nèi)的膜過濾技術(shù)比較成熟，用聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的折疊微孔濾膜濾芯，過濾精度可達(dá)0.01μm，過濾效率高，高流速高通量，,疏水性強(qiáng)，可反復(fù)熱壓消毒，在工業(yè)領(lǐng)域大量使用，已經(jīng)替代了傳統(tǒng)的活性炭、棉花、超細(xì)玻璃纖維為過濾介質(zhì)的過濾器。

如果空氣過濾器的除菌質(zhì)量不好，將會使過濾后的空氣含有雜菌，如果雜菌數(shù)量很少，采用間斷取樣檢測不容易檢測出來，誤以為空氣質(zhì)量合格，容易造成發(fā)酵失敗。針對黑槌蟲草發(fā)酵，采用了連續(xù)空氣檢測方法，在最后一級的過濾器后掛了一個空氣測樣瓶，瓶中是滅菌后不接種的LB細(xì)菌培養(yǎng)基，連續(xù)通入過濾后的空氣。只要觀察到培養(yǎng)基保持清澈，就說明過濾器運(yùn)行正常。如果發(fā)酵罐發(fā)生染菌，我們也可以據(jù)此判斷染菌原因，采用正確的處理方式。在黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵中車間各級發(fā)酵罐的過濾器連續(xù)使用2個月，鏡檢空氣測樣瓶無菌。

在系統(tǒng)的總空氣過濾器前，應(yīng)設(shè)置前置空氣過濾器，對出自空壓機(jī)的空氣進(jìn)行脫油、脫水和部分除菌，以減輕總空氣過濾器的壓力。對于每一個發(fā)酵罐，應(yīng)配備獨立的可滅菌的空氣過濾器。

1.4 閥門

閥門在發(fā)酵設(shè)備中使用最多，采用的閥門也有各種型號，有條件的發(fā)酵車間使用專用的二通閥或隔膜閥[3]?？紤]到閥門使用成本和易于維護(hù)，在我所中試車間用的最多是截止閥，發(fā)酵閥門對密封的要求高，使用中開閉比較頻繁，對內(nèi)部密封副的磨損較大，普通的密封結(jié)構(gòu)不適用發(fā)酵，因此針對發(fā)酵特點對內(nèi)部密封副進(jìn)行了改進(jìn)，將原截止閥的硬密封密封副改成了軟密封，密封關(guān)閉件用聚四氟乙烯墊片。由于聚四氟乙烯材料較軟，墊片可以自行加工，通過更換聚四氟乙烯墊片來保證閥門的密封。避免由于密封副泄露而整體更換閥門，即降低了發(fā)酵染菌風(fēng)險也大幅降低了成本。

發(fā)酵閥門也要密切注意閥門外密封泄露，對于截止閥，從閥桿處發(fā)生的泄露是外密封泄漏。在發(fā)酵生產(chǎn)中，閥門的外密封泄漏比較隱蔽，閥門外密封檢查容易忽略，如果不加以注意，很容易造成發(fā)酵染菌。在黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵前對關(guān)鍵閥門逐個進(jìn)行密封性檢查，并用新型膨脹聚四氟乙烯密封填料替代了常規(guī)的石棉和膨脹石墨填料，該填料耐磨耐腐蝕，密封效果比常規(guī)的石棉和膨脹石墨填料要好。

2 發(fā)酵過程控制

2.1 滅菌時間的控制

發(fā)酵滅菌是利用高溫濕熱蒸汽進(jìn)行滅菌，利用高溫濕熱蒸汽的熱量使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的凝固變化，在很短的時間內(nèi)造成微生物的死亡。一般常溫微生物在60 ℃、10 min就可以死亡，而芽胞桿菌的芽孢能耐受較高溫度，100 ℃有時數(shù)小時才能殺死，因此一般衡量滅菌的徹底于否，是以能否殺滅芽胞桿菌為標(biāo)準(zhǔn)[4]。滅菌溫度越高，滅菌時間越長，滅菌的效果越好，但是又不能任意提高滅菌溫度和延長滅菌時間，否則培養(yǎng)基的有效成分遭到較大破壞[5](滅菌溫度和時間對養(yǎng)分破壞的比較見表1)，影響黑槌蟲草羽束梗孢菌的生長，得不到我們需要的合格菌絲體。

表1 滅菌溫度和時間對養(yǎng)分破壞的比較

由于黑槌蟲草培養(yǎng)基中有豆類粉末，不易滅菌，經(jīng)過實驗，我們確定黑槌蟲草發(fā)酵的滅菌溫度控制在115 ℃，時間控制在40 min，即可以保證滅菌質(zhì)量，又不會損失過多的營養(yǎng)成分。

2.2 發(fā)酵參數(shù)控制

黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵中控制的參數(shù)有溫度、罐壓、排氣流量、攪拌速度、pH、溶氧、泡沫等，由于羽束梗孢菌的生長對氧氣需求不大，在現(xiàn)有的通氣條件下，溶氧基本保持不變，因此為避免增加染菌風(fēng)險和保護(hù)電極，溶氧電極可以不用放置。羽束梗孢菌的生長對溫度變化要求不高，發(fā)酵時溫度的控制方式用開關(guān)控制即可。其他部分控制參數(shù)見表2。

表2 部分發(fā)酵罐的控制參數(shù)

發(fā)酵液的pH在黑槌蟲草發(fā)酵中用于監(jiān)測羽束梗孢菌的生長是否正常，如果發(fā)酵液pH值在發(fā)酵中基本保持不變，說明羽束梗孢菌生長正常，如果發(fā)酵液pH值出現(xiàn)向上或向下的趨勢，則此次發(fā)酵極有可能染菌。對黑槌蟲草的發(fā)酵而言，還可以通過發(fā)酵排氣的味道來判斷是否染菌和發(fā)酵情況，在正常情況下，排氣沒有任何異味，如果出現(xiàn)酸味等異味，則說明已經(jīng)染菌，而在發(fā)酵后期，當(dāng)出現(xiàn)微微的苦味時，則意味羽束梗孢菌生長到了末期，這時取樣，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液變成澄清透明的淡棕黃色，味苦無異味，鏡檢菌球直徑2～3 mm，大小均勻，發(fā)酵液殘?zhí)菣z測不超過0.5%，可終止發(fā)酵，菌絲體的得率可達(dá)2.5%。

發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫一直是造成染菌的重要原因[6]，由于培養(yǎng)基中的豆類成份和黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物均會產(chǎn)生泡沫，如果不能把泡沫壓制在罐中，一旦與外界空氣接觸，極易造成染菌導(dǎo)致發(fā)酵失敗，因此減少泡沫產(chǎn)生也是黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵的重點防控措施。黑槌蟲草發(fā)酵產(chǎn)生泡沫主要在兩個階段，第一階段是在發(fā)酵液滅菌時，發(fā)酵液沸騰產(chǎn)生泡沫，滅菌時一定要控制泡沫不能沖出罐外造成逃液。由于黑槌蟲草羽束梗孢菌的特殊性，培養(yǎng)基中不能加入工業(yè)消泡劑，而市場上的食品消泡劑又對羽束梗孢菌的品質(zhì)和生長造成影響，黑槌蟲草發(fā)酵采用食用豆油作為消泡劑，但是效果不如工業(yè)消泡劑，而且為了不影響羽束梗孢菌的生長也不能多加，這就對滅菌操作提出較高要求。這時應(yīng)該對培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理，提前在罐外對培養(yǎng)基煮沸，將培養(yǎng)基中的發(fā)泡物質(zhì)消耗一部分，再進(jìn)行罐內(nèi)發(fā)酵液滅菌時會顯著降低泡沫量。第二階段發(fā)酵液產(chǎn)生泡沫是在羽束梗孢菌發(fā)酵過程中，隨著培養(yǎng)基養(yǎng)分的消耗，羽束梗孢菌生長導(dǎo)致自身代謝產(chǎn)物增加，發(fā)酵過程中會出現(xiàn)泡沫。對于種子罐的泡沫一般采取調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，例如降低攪拌速度，降低進(jìn)氣流量和適當(dāng)提高種子罐的罐壓力來解決，如果種子罐泡沫控制困難時，應(yīng)及時轉(zhuǎn)入下一級種子罐，這樣逐級放大，一直到最后一級的發(fā)酵罐，而在最后一級的發(fā)酵罐中，除了采用調(diào)整發(fā)酵參數(shù)來控制泡沫外，還可以通過無菌管道加入經(jīng)滅菌的食用豆油來控制泡沫。

2.3 接種、移種和取樣控制

黑槌蟲草羽束梗孢菌的菌種接入采用火焰封閉接種口，然后快速導(dǎo)入菌種的方式，接種環(huán)節(jié)十分關(guān)鍵，接種過程中如果接種口火焰未能全部封閉接種口，或者火焰受到干擾，以及菌種沾在了接種口上，均增加了染菌的風(fēng)險。因此在接種前提前用紫外燈對環(huán)境殺菌，接種時關(guān)閉門窗，用酒精擦拭接種口，檢查火焰接種環(huán)，打開排氣閥排氣，罐內(nèi)殘余有微弱壓力是關(guān)閉排氣閥，注意關(guān)閉排氣閥的時間，過早關(guān)閉排氣閥會使罐內(nèi)殘余氣流過多，接種口打開時氣流沖出會吹滅火焰，過晚關(guān)閉排氣閥會使罐內(nèi)壓力跌零增加染菌風(fēng)險。接種口打開后立即稍開進(jìn)氣閥門，使發(fā)酵罐保持微弱正壓，接種時避免受到環(huán)境氣流干擾，快速倒入。

發(fā)酵生產(chǎn)是一個逐級放大的過程，當(dāng)種子罐中黑槌蟲草羽束梗孢菌生長到穩(wěn)定期，即可進(jìn)行移種操作。如果罐和罐之間有固定管道連接則相對容易，管道用150～200 kpa蒸汽滅菌30 min并保持正壓。如果發(fā)酵罐之間沒有設(shè)計管道連接，這時可以用硅膠管作為臨時的移種管道，移種硅膠管的管壁厚度應(yīng)在1 mm以上，各罐的附屬蒸汽管道粗細(xì)不同時，宜使用較粗蒸汽管道的蒸汽作為滅菌蒸汽，硅膠管內(nèi)部的流通蒸汽壓力保持150 kpa以上，滅菌時間30～40 min。

為了掌握羽束梗孢菌的生長情況，確定移種時間，發(fā)酵過程中要適時取樣，但同時也增加了染菌風(fēng)險，因此操作人員必須嚴(yán)格取樣操作。取樣管道滅菌時滅菌蒸汽必須連續(xù)流通，不容許出現(xiàn)死點。由于發(fā)酵生產(chǎn)中，有些閥門安裝時其標(biāo)注流向與發(fā)酵液流向是相反的，這時需在該閥門的底部加裝一個小的附加閥門使蒸汽流通。要加強(qiáng)對取樣閥的外密封結(jié)構(gòu)的檢查，防止發(fā)酵液從外密封結(jié)構(gòu)中泄漏，造成發(fā)酵染菌。

發(fā)酵滅菌時只有蒸汽流通才有滅菌的效果，對不流通的管道、閥門，必須采用上文方式改造使蒸汽流通。然后無菌空氣保持正壓，避免雜菌侵入。

總之，可能導(dǎo)致新疆黑槌蟲草羽束梗孢菌發(fā)酵失敗的原因很多，主要有設(shè)備泄露、空氣帶菌、滅菌不透，操作不當(dāng)?shù)龋l(fā)酵后期的染菌將使前期的工作前功盡棄，給生產(chǎn)造成很大損失，這就要求我們在發(fā)酵生產(chǎn)中，對發(fā)酵生產(chǎn)的每一個環(huán)節(jié)嚴(yán)加控制，既要做好常規(guī)檢查，也要做好專項防控，杜絕發(fā)酵染菌的隱患。