老瓜頭不同極性段的殺蟲活性

王 梅, 王亞文, 賀 英, 李 剛, 景 瑞, 閻雄飛

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)院, 陜西 榆林 719000)

老瓜頭(CynanchumkomaroviiAl. Lljinsk)又名牛心樸子、牛心樸子草、華北白前、對(duì)葉子草等，是蘿藦科(Asclepiadaceae)鵝絨藤屬(Cynanchum)一種生長(zhǎng)于我國(guó)西北荒漠和半荒漠地區(qū)的重要有毒沙生植物之一，主要分布在內(nèi)蒙古自治區(qū)、寧夏回族自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、陜西、甘肅和青海等地的荒漠和半荒漠地區(qū)，是草場(chǎng)退化和土地沙化的重要標(biāo)志性植物之一[1]。老瓜頭作為一種有毒植物，由于具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、繁殖快等特性，在干旱少雨等惡劣天氣情況下，大面積成片繁殖生長(zhǎng)，擠占優(yōu)良牧草的生態(tài)位，抑制牧草的正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)啬撩穹拍梁筒輬?chǎng)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展[2]。因此，對(duì)老瓜頭毒草資源進(jìn)行科學(xué)合理的開發(fā)和利用，對(duì)保護(hù)牧草資源、恢復(fù)草場(chǎng)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力和防止沙漠化具有重要的意義。

植物源農(nóng)藥的提取物大部分是多成分共同作用，且作用的方式多種多樣，在自然環(huán)境下非常容易降解；對(duì)于靶標(biāo)害蟲來說，不容易對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，且對(duì)天敵等非靶標(biāo)生物相對(duì)安全[3]。此外，利用植物根、莖、葉等材料加工的農(nóng)藥具毒性相對(duì)低、殘留相對(duì)少的優(yōu)點(diǎn)，植物源農(nóng)藥將有毒植物器官中具有殺蟲、殺菌、除草等具有生物活性物質(zhì)(生物堿、萜類、黃酮類、菊酯類、精油類等)等提取出來，并將這些物質(zhì)通過選擇直接或間接加工成新的農(nóng)藥[4～8]。加之我國(guó)植物源農(nóng)藥資源豐富，因此，兼具有取材方便，成本低廉等優(yōu)勢(shì)，越來越受到人們的重視和關(guān)注。

二十一世紀(jì)以來，隨著分析化學(xué)和植物化學(xué)等科學(xué)技術(shù)的日新月異，老瓜頭具有抑菌[9～12]、除草[13～14]、殺蟲除螨[15～21]等多種生物活性逐漸被科研工作者發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。老瓜頭生物活性成分分離鑒定和作用機(jī)理的分析闡明，老瓜頭作為重要的植物源農(nóng)藥資源而成為研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境安全的日益重視，綠色植保逐漸融入人們的理念。鑒于此，開發(fā)和利用沙區(qū)有毒植物老瓜頭作為植物源農(nóng)藥，不僅可以解決該植物的資源合理利用問題，還為開發(fā)和研究老瓜頭為主的新植物源農(nóng)藥提供新的資料，進(jìn)而給我國(guó)西北荒漠地區(qū)帶來較高的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥物：2017年4月于陜西省榆林市佳縣朱家坬鎮(zhèn)采摘老瓜頭全株若干，帶回榆林學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。將老瓜頭全草置于50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重。進(jìn)行充分干燥后，使用40目粉碎機(jī)粉碎，將老瓜頭粉末放入密封袋中備用。陽性對(duì)照藥物為銀黃顆粒，購自成都神鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

供試?yán)ハx：粘蟲(Mythimnaseparata)、棗飛象(Scythropusyasumatsui)、山楂葉螨(Tetranychuscinnbarinus)和小地老虎(Agrotisypsilon)均由榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院提供。棗飛象供試蟲態(tài)為成蟲，山楂葉螨為成螨，粘蟲、小地老虎均為3齡幼蟲。試驗(yàn)中選取大小、形態(tài)一致的昆蟲備用。

儀器與試劑：JK-450數(shù)控超聲波清洗儀；GZX-9070數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；SHZ-D(III)循環(huán)水多用真空泵；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；分析純乙醇、石油醚、正丁醇，天津福晨化學(xué)試劑廠；分析純丙酮、乙酸乙酯，上海邦成化工有限公司；200～300目柱層析色譜硅膠，奧普斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 老瓜頭提取物的制備 每次取老瓜頭樣品1 000 g，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、純凈水，在超聲波清洗儀中浸提3次，每次30 min，合并浸提液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸浸提液，至浸提液成為膏狀后，回收溶劑；得到老瓜頭不同溶劑的提取物。裝入試劑瓶中，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 老瓜頭殺蟲活性 研究所用的實(shí)驗(yàn)的提取物濃度均為400 mg/mL，打孔器直徑d=0.80 cm，養(yǎng)蟲瓶高度h=10 cm，直徑d=8 cm。采用小葉碟法[22]測(cè)定不同提取物對(duì)粘蟲和小地老虎3齡幼蟲以及棗飛象成蟲的胃毒活性。具體方法：將新鮮的玉米葉片用圓形打孔器打成葉碟，置于配制好的400 mg/mL藥液中浸漬3～5 s，自然晾干后，放入養(yǎng)蟲瓶中，再接入饑餓4 h的粘蟲和小地老虎；將新鮮的棗樹葉片用圓形打孔器打成葉碟，置于配制好的藥液中浸漬3～5 s，自然晾干后，接入饑餓4 h的棗飛象成蟲。

采用微量點(diǎn)滴法[23]測(cè)定試材對(duì)粘蟲、棗飛象和小地老虎的觸殺作用，以微量點(diǎn)滴儀點(diǎn)滴藥液至粘蟲和小地老虎3齡幼蟲前胸背板及棗飛象成蟲腹面，以點(diǎn)滴等量丙酮為對(duì)照。采用玻片浸漬法[23]測(cè)定試材對(duì)山楂葉螨的觸殺作用。以吐溫-80水溶液稀釋老瓜頭不同提取物至供試質(zhì)量濃度，將粘好的山楂葉螨玻片在藥液中浸漬3～5 s取出，用吸水紙吸去多余藥液，以吐溫-80水溶液作為空白對(duì)照。

上述殺蟲活性反應(yīng)中，各處理均重復(fù)3次，其中粘蟲、棗飛象和小地老虎每重復(fù)30頭試蟲，山楂葉螨每重復(fù)50頭試蟲。處理后，均放置于養(yǎng)蟲室，溫度26±1℃，相對(duì)濕度為65±15%，光和暗周期為12 h∶12 h飼養(yǎng)，分別于處理后24 h和48 h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算校正死亡率。

分別對(duì)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物進(jìn)行同等劑量下的殺蟲活性比較，確定正丁醇提取物的殺蟲活性最高，對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行柱層析分離，以100頭粘蟲3齡幼蟲為供試?yán)ハx進(jìn)行活性追蹤試驗(yàn)。具體步驟：取25 g正丁醇提取物，用少量正丁醇溶解后吸附在一定硅膠上進(jìn)行硅膠柱層析，用正丁醇/乙酸乙酯(體積比100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇依次洗脫。測(cè)定各洗脫組分的殺蟲活性，每種昆蟲的供試數(shù)量為80頭，進(jìn)一步選取高活性組分段進(jìn)行二次硅膠柱層析，依次使用用正丁醇/丙酮(體積比同上)、丙酮和甲醇洗脫。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)棗飛象成蟲殺蟲活性

溶劑提取物對(duì)棗飛象成蟲殺蟲活性測(cè)定結(jié)果見(表1)，不難看出400 mg/mL水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，正丁醇提取物對(duì)粘蟲的殺蟲活性最高，顯著高于其它3種溶劑提取物(P<0.05)。正丁醇提取物胃毒處理?xiàng)楋w象24 h和48 h后，校正死亡率分別為68.4%和73.4%，觸殺處理24 h和48 h，棗飛象校正死亡率分別為55.2%和64.8%，正丁醇提取物對(duì)棗飛象的胃毒活性優(yōu)于觸殺活性。水提取物對(duì)棗飛象的殺蟲活性最差。棗飛象胃毒處理24 h和48 h，校正死亡率分別為8.3%和12.6%；觸殺處理24 h和48 h，校正死亡率分別為14.3%和15.1%。老瓜頭石油醚提取物與乙酸乙酯提取物對(duì)棗飛象的胃毒和觸殺效果較差，胃毒校正死亡率為30%～45%，觸殺校正死亡率為25%～40%，石油醚和乙酸乙酯提取物對(duì)棗飛象殺蟲活性無顯著差異。

2.2 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)粘蟲幼蟲殺蟲活性

由表2可知，老瓜頭水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物濃度為400 mg/mL時(shí)，正丁醇提取物處理粘蟲24 h和48 h，觸殺校正死亡率分別為58.7%和63.9%，而胃毒校正死亡率分別為68.7%和72.3%。正丁醇提取物對(duì)粘蟲的殺蟲活性最好，顯著高于其它3種溶劑提取物(P<0.05)，且正丁醇提取物對(duì)粘蟲的胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。水提物處理粘蟲24 h和48 h，觸殺校正死亡率分別為13.1%和15.8%，而胃毒校正死亡率分別為25.1%和32.2%。老瓜頭水提取物對(duì)粘蟲的觸殺和胃毒效果最差。老瓜頭石油醚提取物與乙酸乙酯提取物對(duì)粘蟲的胃毒和觸殺效果較差，觸殺校正死亡率為22%～32%，胃毒校正死亡率為34%～48%，石油醚和乙酸乙酯提取物對(duì)粘蟲殺蟲活性無顯著差異。

表1 老瓜頭不同極性提取物對(duì)棗飛象成蟲的殺蟲活性

表2 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的毒殺活性

2.3 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)小地老虎殺蟲活性

老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)小地老虎幼蟲殺蟲活性測(cè)定結(jié)果見(表3)，由表可知400 mg/mL水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，正丁醇提取物正丁醇的殺蟲活性最好，顯著高于其它3種溶劑提取物(P<0.05)。正丁醇提取物對(duì)小地老虎的胃毒活性顯著優(yōu)于觸殺活性。胃毒處理24 h和48 h，小地老虎的校正死亡率為64.1%和68.2%，而觸殺處理24 h和48 h，小地老虎的校正死亡率為37.9%和42.4%。其次為老瓜頭石油醚提取物處理24 h和48 h，對(duì)小地老虎的觸殺效果分別為24.2%和29.4%，而胃毒校正死亡率分別為48.7%和55.6%；老瓜頭水提取物與乙酸乙酯提取物對(duì)小地老虎的胃毒和觸殺效果最差，48 h觸殺校正死亡率為13%～19%，48 h胃毒校正死亡率為26%～39%，水和乙酸乙酯提取物對(duì)小地老虎殺蟲活性無顯著差異。

表3 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)小地老虎3齡幼蟲的毒殺活性

2.4 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)山楂葉螨殺蟲活性

老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)山楂葉螨觸殺活性測(cè)定結(jié)果見(表4)，由表可知400 mg/mL老瓜頭水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，乙酸乙酯和正丁醇的觸殺活性較好，乙酸乙酯處理24 h和48 h，校正死亡率分別為53.4%和58.2%，正丁醇處理24 h和48 h，校正死亡率分別為55.7%和60.7%，即老瓜頭乙酸乙酯和正丁醇提取物對(duì)山楂葉螨觸殺活性無顯著差異。老瓜頭水提取物對(duì)山楂葉螨的觸殺活性最差，處理24 h和48 h，校正死亡率分別為26.3%和31.1%；而老瓜頭石油醚提取物處理24 h和48 h，校正死亡率分別為44.2%和50.5%。

表4 老瓜頭不同溶劑提取物對(duì)山楂葉螨的觸殺活性

2.5 老瓜頭正丁醇提取物柱層析不同組分對(duì)粘蟲的殺蟲活性測(cè)定

經(jīng)薄層層析分離老瓜頭正丁醇提取物，得到11個(gè)組分，按照洗脫順序分別標(biāo)記為X1～X11。對(duì)這11個(gè)組分進(jìn)行生測(cè)，測(cè)定其對(duì)粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性，結(jié)果如表5，表明正丁醇提取物的活性成分主要集中在X4中。測(cè)定X4組分對(duì)棗飛象、粘蟲、小地老虎和山楂葉螨的殺蟲活性，由表6可知，老瓜頭正丁醇段提取物X4組分對(duì)棗飛象、粘蟲、小地老虎和山楂葉螨的24 h和48 h的觸殺校正死亡率為70%～80%，而對(duì)棗飛象、粘蟲和小地老虎24 h和48 h的胃毒校正死亡率為大于90%。研究結(jié)果表明X4組分對(duì)棗飛象、粘蟲和小地老虎的胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。因此，今后以老瓜頭正丁醇提取物X4組分為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行其類似化合物的合成，為研發(fā)植物源殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

表5 老瓜頭正丁醇提取物薄層層析不同組分對(duì)粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性

表6 老瓜頭正丁醇段提取物X4組分的殺蟲活性

3 討論與結(jié)論

老瓜頭是一種廣泛的分布于陜北地區(qū)的一種毒草資源。研究將的老瓜頭通過不同溶劑萃取獲得不同溶劑提取物，并測(cè)定其對(duì)棗飛象、粘蟲、小地老虎和山楂葉螨的殺蟲活性。老瓜頭正丁醇提取物對(duì)棗飛象、粘蟲和小地老虎的殺蟲活性最好，且其胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。這和張維庫[15]對(duì)粘蟲的研究結(jié)果并不一致。主要原因?yàn)楣P者研究的提取物含有的物質(zhì)可能不是生物堿。老瓜頭水提取物的殺蟲活性最差，胃毒和觸殺處理48 h，供試?yán)ハx的校正死亡率小于35%。這和美國(guó)白蛾[18]等的研究結(jié)果不一致，主要原因?yàn)樗疄闃O性溶劑，提取出的老瓜頭活性物質(zhì)和其它三種溶劑并不相同，也可能是不同處理方法造成的。

通過對(duì)山楂葉螨殺蟲活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，老瓜頭正丁醇和乙酸乙酯提取物對(duì)山楂葉螨的觸殺活性最好，觸殺處理48 h，校正死亡率分別為60.7%和58.2%，石油醚提取物次之，校正死亡率為50.5%，老瓜頭水相提取物最差，校正死亡率為31.1%。研究結(jié)果表明，老瓜頭水相的殺蟲活性最差，這于劉晨[17]等對(duì)地紅蝽的研究結(jié)果一致，主要原因?yàn)槔瞎项^內(nèi)吸性溶劑存在于正丁醇和乙酸乙酯中。

筆者研究對(duì)老瓜頭正丁醇提取物進(jìn)行柱層析分離，獲得11個(gè)不同組分，對(duì)粘蟲3齡幼蟲進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，X4組分的殺蟲活性最好，即老瓜頭殺蟲活性物質(zhì)主要集中在X4組分中，且X4組分的胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。剡根姣等[19]研究發(fā)現(xiàn)，老瓜頭乙醇提取物對(duì)小菜蛾具有較好的拒食作用，觀察發(fā)現(xiàn)老瓜頭乙醇提取物對(duì)小菜蛾的口器感受器具有破壞性，楊曼[18]研究發(fā)現(xiàn)，老瓜頭水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮5種溶劑粗提物中甲醇提取物和乙醇提取物對(duì)美國(guó)白蛾的胃毒活性強(qiáng)烈，筆者研究結(jié)果與之一致，可能是由于老瓜頭生物堿中的殺蟲活性物質(zhì)溶于醇類有機(jī)溶劑。

老瓜頭作為植物藥用資源有很大的研發(fā)空間與價(jià)值，開發(fā)和利用沙區(qū)有毒植物老瓜頭作為植物源農(nóng)藥，可以解決該植物的資源合理利用問題。研究初步明確了老瓜頭正丁醇提取物的殺蟲活性較好，對(duì)鱗翅目和鞘翅目的胃毒和觸殺效果均較好，且對(duì)山楂葉螨的觸殺效果也較好，即老瓜頭是一種潛在的與可開發(fā)的資源。研究為植物源殺蟲劑的研發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。