枇杷葉中熊果酸的提取工藝及含量測定研究

張小斌，雷艷妮，陳書存

(1.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院、中國中醫(yī)科學(xué)院商洛中藥材GAP科研工程中心,陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000；3.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000)

專業(yè)領(lǐng)域?qū)⑺N薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)的干燥葉定義為枇杷葉，枇杷葉在我國的主要產(chǎn)地大多分布在福建與湖北，其性質(zhì)屬寒，味道苦澀，在過去的中國藥典中記錄的枇杷葉功效非常多，臨床上枇杷葉的使用范圍非常廣泛[1]。枇杷葉可以去火清肺，對于止咳化痰也有一定的作用，可以緩解人體許多脾胃慢性病[2]。枇杷葉的成分較為復(fù)雜，包括揮發(fā)油與酸性物質(zhì)，當(dāng)前階段的科學(xué)研究證明使枇杷葉含有如此高的藥用價值的元素主要是三萜化合物[3]?？茖W(xué)領(lǐng)域分離枇杷葉的構(gòu)成成分，得出的烏蘇烷型等化合物都是三萜酸類化合物，在所有化合物中，熊果酸的含量占比值最大，研究價值最高[4]。研究者鞠建華等人以枇杷葉為研究對象，展開了一系列的基礎(chǔ)研究與深入研究，結(jié)果表明枇杷葉只所有具有止咳化痰等功效，與其含有的三萜酸類化合物有密切的關(guān)系，而熊果酸可以作為一個化合物代表，判斷枇杷葉的藥用價值可以從其含有的熊果酸的量大小入手[5]。在生物學(xué)層面，熊果酸也具有很高的使用價值，其具有抗癌功效，可以減少很多致癌物質(zhì)對人體的損害，抑制人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的分裂[6],很有可能成為一種高效低成本的抗癌藥物。最近幾年，我國專業(yè)領(lǐng)域展開的很多研究都證明了熊果酸是枇杷葉呈現(xiàn)較高藥物價值的主要成分，其對于調(diào)節(jié)人體的肝功能與胃功能都有很大作用，可以增強人體免疫力，未來熊果酸的應(yīng)用范圍很有可能得到擴展，在功能性食品方向上開拓市場[7]。使用較為精密的儀器與先進(jìn)的技術(shù)測定枇杷葉中熊果酸的含量，給予一定的標(biāo)準(zhǔn)衡量枇杷葉的質(zhì)量高低，推動醫(yī)藥領(lǐng)域生產(chǎn)出更多質(zhì)量得到保證的枇杷葉藥材。深入研究提取手段，爭取在保證提取質(zhì)量的前提下減少成本投入與過程中的資源浪費，可以開拓枇杷葉的市場，讓枇杷葉的應(yīng)用范圍更加廣泛。因為枇杷葉的功效涵蓋范圍較大，毒性非常小，因此近些年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域給予枇杷葉的重視程度越來越高。筆者以探索出更高效的熊果酸提取方法并精準(zhǔn)測定出熊果酸含量為目標(biāo)，為充分利用并開發(fā)枇杷葉資源提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗儀器與材料試劑

1.1 實驗儀器

KS-150D型超聲清洗器(濟南松浦自動化設(shè)備有限公司)；1/10萬天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司制造)；FA2004N電子天平(上海精科天平)；101-1型干燥箱(中華人民共和國上海市實驗儀器總廠)；高效液相色譜儀(日本島津制作所)； BCD-207C電冰箱(無錫小天鵝)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(雙列四孔，常州國華電器有限公司)；4.5 um微孔濾膜；1 mL一次性醫(yī)用注射器(帶針頭)。

1.2 材料試劑

枇杷葉購于陜西香菊大藥房，經(jīng)商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院制藥工程系鑒定為薔薇科植物枇杷屬枇杷葉。對照樣品中的熊果酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110742-200314，供含量測定用)，甲醇、95%乙醇、乙醚、石油醚均為分析純；甲醇、磷酸、乙腈均為色譜純。

2 實驗方法

2.1 工藝流程

枇杷葉挑揀、清洗、干燥→枇杷葉干品→粉碎過20目篩→枇杷葉粉末→稱量→石油醚預(yù)處理→烘干→加提取溶劑→不同方法提取→過濾→制備供試品溶液→含量測定→實驗結(jié)果→結(jié)果分析→結(jié)論

2.2 枇杷葉的處理

將枇杷葉正面的雜質(zhì)和背面棕褐色的絨毛清洗干凈，以免干擾實驗。常見的枇杷葉干燥方法有真空干燥、熱風(fēng)干燥與冷凍干燥等。實驗證明：不同干燥方法對枇杷葉中熊果酸含量均無顯著影響[8]。鑒于商洛地區(qū)四、五月份溫度、風(fēng)力適宜，選擇自然干燥。枇杷葉完全干燥后，用粉碎機粉碎，過二十目篩后將樣品粉末置于錐形瓶中，加入石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL，15 min后傾去石油醚，烘干。將石油醚處理過的樣品粉末置于真空干燥箱中備用。

2.3 制備對照品溶液

用儀器稱量2 mg熊果酸，將稱取后的熊果酸放于容量瓶中，容量瓶量程選為10 mL，向容量瓶中添加甲醇，稀釋溶液至溶液凹液面最低處達(dá)到刻度線，搖晃均勻，配成熊果酸濃度為0.2 mg/mL的溶液，過濾后注入進(jìn)樣瓶中備用。

2.4 樣品溶液的制備

量取0.5 g枇杷葉粉末，量取前粉末應(yīng)過20目篩，置于100 mL具塞錐形瓶中，用石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL傾去石油醚，烘干，加甲醇45 mL，冷浸30 min后，超聲提取40 min，提取2次，合并濾液，最后將合并均勻的溶液倒入容量瓶中，容量瓶量程為100 mL，添加甲醇定容。取適量于0.45 um微孔濾膜過濾后備用。

2.5 色譜條件

色譜條件LichrospherCl8(250 mm×4.6 mm，5 um)色譜柱；流速:0.8 mL/min；柱溫:室溫；檢測波長:215 nm。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 流動相的考察 精密吸取對照品溶液20 ul，樣品溶液20 ul，分別以①乙腈-甲醇-水-磷酸(80∶10∶10∶0.05)；②甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)為流動相，重復(fù)進(jìn)樣2次，記錄色譜圖，考察不同流動相對熊果酸分離效果的影響。

2.6.2 提取溶劑的考察 選取甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)為流動相，分別以甲醇、95%乙醇、乙醚為提取溶劑，超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min，其他條件不變，每種方法重復(fù)操作3次，制備溶液后各進(jìn)樣2次。將測定的熊果酸峰面積進(jìn)行記錄，根據(jù)測量結(jié)果計算出其平均值。

2.6.3 考察溶劑用量 提取溶劑選為甲醇溶液，提取過程所用時間約為40 min，進(jìn)行兩次提取，設(shè)置溶劑用量為15 mL、30 mL、45 mL、60 mL，每種方法重復(fù)操作3次，制備溶液后各進(jìn)樣2次。將測得的熊果酸峰面積進(jìn)行記錄，并且根據(jù)測量結(jié)果計算出其平均值。

2.6.4 提取時間的考察 以甲醇45 mL為提取溶劑，提取次數(shù)2次，提取時間設(shè)置為20 min、30 min、40 min、50 min，每種方法重復(fù)操作3次，制備溶液后各進(jìn)樣2次。將測得的熊果酸峰面積進(jìn)行記錄，并且根據(jù)測量結(jié)果計算出其平均值。

2.6.5 提取次數(shù)的考察 以甲醇45 mL為提取溶劑，提取過程所用時間約為40 min，分別進(jìn)行一次、兩次、三次、四次提取，每種方法重復(fù)操作3次，制備溶液后各進(jìn)樣2次。將測得的熊果酸峰面積進(jìn)行記錄，并且根據(jù)測量結(jié)果計算出其平均值。

2.7 樣品含量計算方法

使用精密儀器，從對照品溶液中吸取出20 mL，從樣品溶液中吸取出20 mL，裝進(jìn)樣本瓶中，分別測定二者的熊果酸峰面積并記錄下來，將記錄數(shù)據(jù)代入進(jìn)下式來計算熊果酸含量多少。

式中：AX為樣品的峰面積；

CR為對照品溶液的濃度；

AR為對照品的峰面積；

S 為樣品體積；

W 為稱樣量。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的考察結(jié)果

色譜條件的考察結(jié)果見色譜圖1、圖2、圖3。

圖1 枇杷葉樣品典型色譜

圖2 對照品溶液典型色譜

圖3 枇杷葉樣品典型色譜

色譜圖1是在流動相系統(tǒng)①乙腈-甲醇-水-磷酸(80∶10∶10∶0.05)下熊果酸樣品色譜圖，熊果酸保留時間為34 min左右，時間較長；色譜圖2是以②甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)為流動相的熊果酸對照品色譜圖，熊果酸保留時間為18 min左右，圖形基線較為穩(wěn)定，未出現(xiàn)峰形拖尾情況；色譜圖3為流動相②條件下枇杷葉樣品典型的色譜圖，熊果酸峰與其它峰可以完全分離，基線平穩(wěn)，峰形形狀對稱，未出現(xiàn)拖尾情況，并且流動相系統(tǒng)②中各組分價格更為低廉，考慮經(jīng)濟、操作等因素，流動相系統(tǒng)選擇②。

甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)流動相中，添加劑為磷酸，作用是制造弱酸性環(huán)境，利于熊果酸的分離，同時起到改善峰形的效果[9]。

3.2 提取溶劑的考察結(jié)果

不同提取溶劑和不同提取時間，熊果酸的含量結(jié)果見表1。

表1 不同提取溶劑、不同提取時間下熊果酸的含量比較

由表1可知：相同提取時間下乙醚對熊果酸的提取率較甲醇與95%乙醇而言相對較低，而甲醇和95%乙醇提取率相當(dāng)，熊果酸含量(%)相差不大，進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)選擇甲醇作為提取液的實驗組雜質(zhì)峰較少[25]，基本不會干擾到熊果酸含量的測定，基線較為穩(wěn)定，具有很高的分離度，因此選擇甲醇作為本實驗的提取溶劑較為合適。

3.3 溶劑用量的考察結(jié)果

溶劑不同用量的考察結(jié)果見表2、圖4。

表2 溶劑不同用量下熊果酸含量比較

由表2、圖4可知，一定范圍內(nèi)，熊果酸的含量(%)隨著溶劑量的提高而增加，當(dāng)溶劑量達(dá)到45ml時，增加不再明顯，此時熊果酸的含量(%)達(dá)到0.798%。這是因為溶劑用量影響熊果酸的方面大體如下：條件相同的情況下，熊果酸溶解度基本不變，這個時候增加溶劑量，那么相對應(yīng)的可溶解的熊果酸量也會增加，熊果酸的化學(xué)性質(zhì)呈現(xiàn)出弱極性的特征，常溫常壓下不會與水相融，只能溶于甲醇，因此甲醇含量越高的溶劑越適于充分提取熊果酸。

3.4 提取時間的考察結(jié)果

提取時間的考察結(jié)果見表3、圖5。

圖4 溶劑用量對熊果酸的含量的影響

表3 不同提取時間下熊果酸含量比較

由表3、圖5可知：熊果酸的含量(%)在提取時間20～30 min顯著增加，30～40 min內(nèi)，增加緩慢，40～50 min內(nèi)幾乎不再增加。這是因為隨著時間的增加，熊果酸在甲醇中的濃度不斷增加，初始時增加顯著，之后逐漸變緩，40 min后，達(dá)到動態(tài)平衡，熊果酸在固液相間趨于平衡。因此我們選擇40 min為最佳提取時間。

圖5 提取時間對熊果酸的含量的影響

3.5 提取次數(shù)的考察結(jié)果

提取次數(shù)的考察結(jié)果見表4、圖6。

由表4、圖6可知，進(jìn)行過兩次提取過程后，熊果酸含量的增加趨勢變得愈發(fā)減緩，因此合適的提取次數(shù)應(yīng)該為2。提取次數(shù)越多，熊果酸含量同最終的提取溶劑量越接近，并且最終約等于相等，這是一個動態(tài)平衡的過程，代表著提取加速度的逐漸減少?？紤]到時間、資源等問題選擇提取次數(shù)為2次，此時熊果酸含量達(dá)到0.796%。

表4 不同提取次數(shù)下熊果酸含量比較

圖6 提取次數(shù)對熊果酸的含量的影響

4 結(jié)論與討論

(1)傳統(tǒng)提取方法中選用的乙醇回流法、索式提取法操作復(fù)雜、花費時間長、提取率較低，利用空化效應(yīng)以及超聲波帶來的震動，讓有效成分同溶劑可以更快的相互融合，提高熊果酸的提取效率，減少提取過程投入的時間，還可以減少溫度過高對實驗結(jié)果造成的負(fù)面影響[10]。因此在枇杷葉有效成分熊果酸的提取方法中，選用超聲提取法進(jìn)行提取。

(2)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11～13]，高效液相色譜法相對其他方法而言操作靈敏、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以將這種方法作為控制枇杷葉藥材質(zhì)量的一個重要方法。

(3)該實驗通過對提取溶劑、溶劑用量、提取時間、提取次數(shù)及流動相的考察可以得出結(jié)論:超聲波提取法提取枇把葉中熊果酸的最佳工藝為：溶劑選擇甲醇溶液，溶劑所需量為45 mL，提取時間為40 min，提取次數(shù)為2次。枇杷葉中的熊果酸含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，得出的色譜條件優(yōu)化為：LichrospherCl8(250 mm x4.6 mm,5 um)色譜柱；甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)為流動相；流速:0.8 mL/min；柱溫:室溫；檢測波長:215 nm。在此優(yōu)化條件下枇杷葉中熊果酸提取率最高，含量達(dá)0.798%。這種實驗方法具有簡單的操作過程，需要投入的時間成本較低，重現(xiàn)性好，提取率高，為充分利用枇杷葉植物資源提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，也可以有效控制枇杷葉藥材的質(zhì)量，值得推廣應(yīng)用。