金魚望天眼性狀受環(huán)境和遺傳影響的初步研究

李榮妮，孫硯勝，田 仲，王賽賽，張 欣

(1.北京市水產(chǎn)科學研究所暨國家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，北京 100068；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室，北京 100097；3.漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097)

金魚()被譽為我國的“國魚”，不僅是世界上最早被人工飼養(yǎng)的觀賞魚類，也是研究種內(nèi)演化的絕佳實驗材料。望天眼金魚，也稱‘朝天眼、望天龍、朝天龍、頂天眼’，眼睛一直望天，眼圈周圍有色澤，眼球似龍睛部分突出眼眶之外，在水中游動時，瞳孔明亮，比龍睛更威武，是金魚中名貴品種。中國金魚圖鑒中介紹：朝天龍，北人稱“望天龍”、眼球向上生長、瞳孔周圍環(huán)繞著金色眼圈，其魚之妙在于眼睛朝天；你無論從哪個角度看它似乎都在審視著你，這在中國古代有仰望天子之寓意，系清宮中最受寵愛的品種。目前報道的魚眼睛隨生長發(fā)育會發(fā)生變化而翻轉(zhuǎn)的最典型的為比目魚,其在變態(tài)發(fā)育過程中，隨著從浮游到底棲，一只眼睛從頭部一側(cè)移到另一側(cè)。而金魚不屬于變態(tài)發(fā)育動物，望天眼金魚品系是在生長發(fā)育過程中，眼睛逐漸完成向上翻轉(zhuǎn)，從外觀和生長發(fā)育來看，其眼睛翻轉(zhuǎn)和比目魚眼睛移動是完全不同的。而關(guān)于金魚望天眼突變體的具體產(chǎn)生和選育過程，目前尚無確切的文獻報道。

本研究針對金魚望天眼性狀是否受環(huán)境(水深和容器透光性)影響和其性狀是否能穩(wěn)定遺傳，而開展初步實驗，以期為提高望天眼金魚正品率和培育新品種提供基礎(chǔ)生產(chǎn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

金魚親本取自北京市水產(chǎn)科學研究所小湯山水產(chǎn)良種繁育基地，為2冬齡蛋種紅望天眼金魚和1冬齡蛋種五花金魚。所用蛋種紅望天眼金魚：無背鰭，全身橙紅色，眼球成功向上翻轉(zhuǎn)90度；蛋種五花金魚：無背鰭，紅藍黑黃白色組合花色各異，眼睛上翻程度不一，介于望天和龍睛中間體，具體可見圖1。

1.2 試驗設(shè)備和養(yǎng)殖管理

整個試驗在北京市水產(chǎn)科學研究所小湯山水產(chǎn)良種繁育基地室內(nèi)進行，根據(jù)基地現(xiàn)有條件，水深和容器透光性對望天眼影響試驗，采用全透光玻璃水族箱和完全不透光塑缸當做試驗養(yǎng)殖容器，玻璃水族箱規(guī)格為長130 cm×寬 60 cm×高45 cm，支撐懸空離地面，以保證四面缸壁和底面均透光；完全不透光塑缸規(guī)格為長120 cm×寬 120 cm×高70 cm。雜交遺傳試驗，均在玻璃水族箱(長130 cm×寬 60 cm×高45 cm)內(nèi)進行。

試驗養(yǎng)殖期間，統(tǒng)一使用充氣裝置結(jié)合XY-380生化棉過濾器。孵化出幼魚15 d內(nèi)投喂活豐年蝦蟲卵，15～60 d內(nèi)混合紅蟲和粉料加水捏成4 cm左右餅狀投喂，60 d后投喂2.0 mm浮性顆粒飼料。室內(nèi)靜水養(yǎng)殖，經(jīng)歷春夏秋冬四季自然溫度，自然光照，養(yǎng)殖用水為晾曬超過48 h的地下水。整個試驗養(yǎng)殖期間，視魚狀態(tài)靈活喂食，以保證魚健康為主。每天用吸便器吸出糞便等臟物，約1個月清洗一次生化棉。使用DR900水質(zhì)檢測儀檢測水質(zhì)狀況，控制水質(zhì)pH 值8.4～7.0 、溶氧9.70～7.70 mg/L、亞硝酸鹽小于0.02 mg/L、氨氮小于0.15 mg/L的范圍內(nèi)，視水質(zhì)狀況靈活換水。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 水深和容器透光性對望天眼影響試驗

(1)前期試驗魚準備：挑選3條紅望天眼金魚(眼睛成功上翻90度)一雄兩雌和一條五花雄魚(眼睛翻轉(zhuǎn)小于45度)，當做親魚，進行人工控制混交濕法受精，自然孵化。幼魚出膜后，移入玻璃水族箱內(nèi)進行幼苗培育，保持水深30 cm，飼養(yǎng)30天，期間不斷剔除畸形、殘疾、有背丁和單尾的個體，最終剩余790條。用這790條1月齡仔魚當做試驗魚進行試驗。

(2)設(shè)計雙因素分組試驗：考慮水深和容器透光度兩個因素，水深設(shè)計15 cm和30 cm兩個水平，容器透光度設(shè)計全透光和完全不透光兩個水平，一共分為2×2四個試驗組，每組四個重復。

據(jù)此設(shè)計方案，考察試驗室具體情況，采用8個透光玻璃水族箱和8個完全不透光塑缸當做養(yǎng)殖容器。試驗魚790條根據(jù)養(yǎng)殖水體積等密度隨機分為4組，每組4個平行重復，具體見表1。第一組標記為A組，玻璃水族箱水深15 cm，每個水族箱約23條仔魚，4個平行標記為A1、A2、A3和A4；第二組標記為B組，玻璃水族箱水深30 cm，每個水族箱約47條仔魚，4個平行標記為B1、B2、B3和B4；第三組標記為C組，不透光塑缸水深15 cm，每個缸約43條仔魚，4個平行標記為C1、C2、C3和C4；第四組標記為D組，不透光塑缸水深30 cm，每個缸約85條仔魚，4個平行標記為D1、D2、D3和D4。

根據(jù)實際生產(chǎn)觀察經(jīng)驗，本次所用的兩種望天眼金魚親本品系孵化出8個月(240 d)后眼睛不再發(fā)生變化，即之后眼睛終身保持當時狀態(tài)，未翻轉(zhuǎn)成功的也不再繼續(xù)翻轉(zhuǎn)，本試驗為確保統(tǒng)計的是金魚眼睛最終形態(tài)，試驗飼養(yǎng)金魚到290 d為止，觀察最終金魚眼睛成功翻轉(zhuǎn)情況，并進行統(tǒng)計分析。

其中需特別說明，C和D組采用70 cm高的完全不透光深塑缸，用來模擬流傳中‘深甕畜養(yǎng)金魚’環(huán)境條件；A和B組采用45 cm高的完全透光玻璃缸，作為對照組；其中設(shè)置15 cm和30 cm兩個不同水位彼此對照。由于水位和容器底面積不同，每組所需養(yǎng)殖水體積不同，為減少試驗誤差，本試驗采取等密度原則來決定每個容器所投放的金魚數(shù)量。

表1 各組水深和容器透光性

1.3.2 望天眼雜交遺傳試驗

根據(jù)基地現(xiàn)有金魚情況選取親魚，分為三組：蛋種望天眼金魚(眼睛成功上翻90度)7雌2雄，標記為a組；蛋種偏龍睛五花金魚(眼睛翻轉(zhuǎn)小于45度)1雌2雄，標記為b組；蛋種偏望天五花金魚(眼睛翻轉(zhuǎn)大于45度，且小于90度)1雌1雄，標記為c組；各組親魚外形具體見圖1。

圖1 翻眼程度不同的親魚組

使用上述親本，并結(jié)合實際生產(chǎn)保存的親魚情況，分為6個雜交組，雜交組合見表2，進行人工控制濕法受精，自然孵化。幼魚出膜后，分別移入玻璃水族箱內(nèi)，每個雜交組合后代單獨進行培育，保持水深30 cm，飼養(yǎng)60 d，期間不斷剔除畸形、殘疾、有背丁和單尾的個體，保留體型周正健康度較好的個體，繼續(xù)飼養(yǎng)直到290 d左右，統(tǒng)計每組雜交組合后代的望天率。

表2 不同雜交組合設(shè)計

1.4 觀察統(tǒng)計方法

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，進行金魚眼睛望天率統(tǒng)計，其計算公式如下：

望天率(Celestial eye rate in goldfish,CER)=100%×成功上翻90度的望天眼金魚數(shù)量/總金魚數(shù)量

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)以原始數(shù)據(jù)表示，經(jīng)過分析處理后以平均值±標準誤(mean±SE)表示，試驗所得數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件統(tǒng)計。首先采用SPSS 17.0軟件General Linear Model中的UNIANOVA對試驗結(jié)果進行‘水深、透光性、水深和透光性互作’三個因素對望天率影響的主體間效應分析，之后采用ONEWAY ANOVA 分別對水深、透光性效應進行單因素分析，顯著水平為0.05。并使用SAS9.13軟件，調(diào)用GLM程序，對不同雜交組合后代望天率進行最小二乘多重比較分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 水深和容器透光性對望天眼影響

水深和容器透光性雙因素試驗，分為四組，每組四個重復，養(yǎng)殖290 d后，統(tǒng)計每組每個重復所得望天率如表3。

表3 不同組所得望天率

對以上數(shù)據(jù)進行誤差方差等同性的 Levene 檢驗，結(jié)果=0.639<0.05，說明所有組中因變量的誤差方差均相等假設(shè)成立，可執(zhí)行下一步UNIANOVA分析‘水深、透光性、水深和透光性互作’三個因素對望天率影響的主體間效應，結(jié)果如表4，顯示水深效應<0.01、透光性效應>0.05、水深和透光性互作效應>0.05，可以說明水深對望天率影響差異極顯著，透光性、水深和透光性互作效應對望天率影響不顯著。

表4 不同水深和透光性對望天率影響

為直觀說明水深、透光性對望天率影響，對水深、透光性分別進行了ONEWAY ANOVA分析，結(jié)果如圖2。30 cm水深望天率極顯著高于15 cm的望天率，而容器透光性則對望天率影響不顯著。

圖2 不同水深和容器透光性對望天率影響

2.2 望天眼雜交遺傳試驗結(jié)果

由于基地中實際親魚雄魚和雌魚數(shù)量不同，每條雌魚懷卵量和雄魚精子量不同，并且發(fā)情時間不統(tǒng)一，結(jié)合試驗設(shè)計和實際生產(chǎn)中親魚情況，執(zhí)行了每組不均等雜交試驗。各組雜交后代養(yǎng)殖到290天后，統(tǒng)計出各雜交組望天率如表5，對不同雜交組合后代望天率進行最小二乘分析，多重比較結(jié)果如圖3。

由圖3可以看出，第4組雜交組合即望天眼純繁組的后代中望天率顯著高于第1、2和5組，雖然其與第3、6組比較差異不顯著，但兩者值比較接近0.05，分別為0.071和0.063，即接近于差異顯著。其余各組望天率兩兩比較差異均不顯著。說明望天眼純繁組F1望天率總體顯著比雜交組要高，但從圖3中可見標準誤較大，這說明組內(nèi)差異也較大，說明每個雜交組內(nèi)親本個體間所得后代望天率差異大，實際生產(chǎn)中剛好可從這些差異較大的個體中選出遺傳望天率較高的個體，作為下一次繁殖的親本；同時淘汰遺傳望天率較低的個體。因此可以根據(jù)表5對每個雜交組合的親本進行分析選擇。

由表5各親本后代所得望天率，可以分析出親本中所得望天率較高和較低的個體。其中a1望天眼雌魚在純繁組所得望天率97.78%，其與偏龍睛金魚雜交所得望天率為75%，在各自雜交組合中均屬最高，可見其遺傳相對比較穩(wěn)定，有一定母體遺傳效應存在，可選作為種魚用；a3望天眼雌魚在純繁組所得望天率57.89%，與偏龍睛金魚雜交所得望天率為20.67%，在各自雜交組合中均屬最低，不可選作為種魚用，也體現(xiàn)了一定母體遺傳效應。另外，結(jié)合圖3中第1組a♀×b后代望天率(42.40±8.20)%，第2組b♀×a后代望天率(31.82±18.34)%，第3組a♀×c后代望天率(43.90±18.34)%，也可以初步推測望天眼性狀一定程度上受母體遺傳效應影響。

表5 不同雜交組合所得望天率

圖3中第4組a♀×a望天組純繁后代望天率(85.64±8.20)%，第5組b♀×b偏龍睛組純繁望天率最低，僅為(8.70±18.34)%；第6組c♀×c偏望天組純繁后代望天率(42.23±18.34)%，比例介于中間。結(jié)果表明親本翻眼程度越大，其后代望天比例越高，并且可以看出只要親本眼睛有翻轉(zhuǎn)，無論翻轉(zhuǎn)程度如何，其后代中均會出現(xiàn)一定比例的望天眼，可見望天眼性狀受遺傳影響較大。

3 討論

3.1 環(huán)境對望天眼金魚影響

望天眼類，是金魚品種中較為名貴的種類之一。有報道稱在望天眼金魚發(fā)育過程中，伴隨著視網(wǎng)膜逐漸不同程度退化，導致望天眼金魚視線狹窄弱光，游動進食緩慢，望天眼金魚可以作為研究人類視網(wǎng)膜退化疾病的模型。實際養(yǎng)殖中觀察到望天眼金魚早期其眼睛從外形上看和正常魚沒有區(qū)別，隨生長發(fā)育望天眼性狀才逐漸表現(xiàn)出來，有報道望天眼‘背上無鰭，眼球向上生長，它的眼球生長方式，是向上又向前翻轉(zhuǎn)，并不是直接向上，大約孵化后一個月眼球才出現(xiàn)變化’，這與本次試驗中觀察結(jié)果完全一致。另有報道指出望天眼金魚三月齡眼球突出，四月齡完成翻轉(zhuǎn)向上90度。而本次試驗金魚約二月齡眼球就已經(jīng)突出，四月齡部分個體翻轉(zhuǎn)成功，與報道的不同，可能是品系和養(yǎng)殖環(huán)境不同所致。

望天眼金魚是龍睛金魚的變異品種，兩者眼睛均與正常眼金魚視線不同。有推測龍睛金魚眼睛凸出最有可能是眼內(nèi)壓過高導致。望天眼金魚眼睛凸出可能也與眼內(nèi)壓過高有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示30 cm水深比15 cm水深的望天率顯著要高，說明外界環(huán)境(水深)對望天眼有一定影響，這種差異可能與水壓有關(guān)，深水位水壓大，可能在一定程度上有助于金魚最終成功翻眼。有文獻建議‘望天眼喜好老水綠水，飼養(yǎng)望天眼的池盆，水要比其它魚深些’，本試驗也佐證了這一養(yǎng)殖建議。結(jié)合本次試驗結(jié)果，建議在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，可以通過加深水位來提高望天眼正品率。

望天眼金魚的產(chǎn)生，目前有兩種觀點：(1)完全外界環(huán)境影響下形成望天眼。在金魚的相關(guān)著作中有提到望天眼‘據(jù)傳是由于清朝宮廷采用深缸飼養(yǎng)而促成的’，并認為其培育成形離不開飼養(yǎng)條件和環(huán)境的變化。現(xiàn)在很多金魚愛好者中，也在流傳‘深甕中畜養(yǎng)金魚，天長日久，因目視甕口光線而使眼球向上翻，逐漸形成望天眼’。這種觀點估計是根據(jù)其奇特的眼睛特征而進行的一種推測。(2)基因突變加上持續(xù)人工選育產(chǎn)生望天眼。在金魚相關(guān)的著作中提到‘望天魚只是金魚突變產(chǎn)生的無數(shù)變異中的一種，人們一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便捉住它眼球上翻的奇特之處，不斷地選擇培育而成’。金魚望天性狀是隨生長發(fā)育而逐漸表現(xiàn)出來，且視線逐漸變?nèi)酰虼丝紤]容器透光性可能對其眼睛生長發(fā)育是否影響，同時可以對以上兩種觀點進行一定程度的驗證。本次試驗設(shè)置不同透光性容器養(yǎng)殖環(huán)境，采用不透光且較深容器模擬第一種觀點中的深缸養(yǎng)殖環(huán)境，并使用完全透光且壁較低的玻璃水族箱養(yǎng)殖作為對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)容器透光性對其眼睛生長發(fā)育影響并不顯著，一定程度上說明了第一種觀點中“深缸飼養(yǎng)，日久因目視缸口光線而眼球向上促成望天”的流傳是不正確的。在本次雜交試驗中，發(fā)現(xiàn)望天眼性狀較為穩(wěn)定，此結(jié)果與第二種觀點一致。有研究表明金魚染色體倍性并不穩(wěn)定，與相似物種比較，金魚部分基因或基因簇表現(xiàn)出冗余拷貝現(xiàn)象。根據(jù)脊椎動物多倍體祖先二倍體化(2R)學說，這表現(xiàn)出其有可能并沒有完成基因組加倍事件。這為金魚提供了比一般魚類更加充分的突變機會，且金魚是以觀賞性品種存在，在劇烈的人工選擇作用下，其瓶頸效應與奠基者效應加劇，大大縮短了其性狀發(fā)生突變到穩(wěn)定的時間。關(guān)于望天眼金魚品系的出現(xiàn)，有報道‘望天眼金魚于1870年出世，1903年由廣東傳入日本；推測望天眼金魚的產(chǎn)生很有可能是金魚中個別個體突變后，一開始只表現(xiàn)出極少數(shù)望天眼，人們發(fā)現(xiàn)其奇特外形具有觀賞性，而選擇對其保留，在高度人工選擇繁育下，從后代不斷挑選出望天個體，保留再繁育，如此一代代繁育挑選，縮短了其性狀發(fā)生突變到穩(wěn)定的時間，較快地形成了性狀穩(wěn)定的望天眼品系。

3.2 遺傳對望天眼金魚影響

望天眼金魚是龍睛金魚的變異品種，而望天眼金魚和龍睛金魚品種分別出現(xiàn)在不同的時期，又是兩種獨立的品種。兩者同樣是眼睛視線有問題，望天眼金魚發(fā)育過程，伴隨著視網(wǎng)膜逐漸不同程度退化，導致視線狹窄弱光；而龍睛金魚眼睛則近視嚴重。龍睛的遺傳規(guī)律已經(jīng)基本清楚。程云生等報道‘正常眼對龍眼為顯性’，這個報道里估計僅進行了一代雜交，僅能看出顯隱性；王春元等報道龍睛相對正常眼為隱性，符合單基因遺傳規(guī)律；KON等報道黑龍睛金魚眼睛突變是由于lrp2aL基因的第45個內(nèi)含子中有一個13-kbp逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入，而導致終止密碼子提前終止了lrp2aL基因的編碼。而望天眼的遺傳規(guī)律和突變機理目前尚不明確。程云生等報道‘朝天眼對正常眼的遺傳為隱性’，這個報道里估計僅進行了一代雜交，所以僅能看出顯隱性；郭棟進行朝天眼與正常眼蘭壽雜交，F(xiàn)1均為正常眼， F2龍睛比例25%，且F2中僅出現(xiàn)極少數(shù)的望天，僅可以看出望天眼對正常眼為隱性，且不符合單基因遺傳規(guī)律。根據(jù)實際生產(chǎn)經(jīng)驗觀察，雜交生產(chǎn)中會出現(xiàn)很多介于望天和龍睛中間體的個體，即翻眼小于90度的群體，估計上面郭棟報道中所得比例為25%的F2龍睛中，也有部分介于望天和龍睛中間體的個體，只是當時作者把這些個體也當做龍睛來統(tǒng)計而已，F(xiàn)2中翻眼成功的個體極少，顯示望天眼可能受多基因調(diào)控。在實際雜交生產(chǎn)中會出現(xiàn)很多介于望天和龍睛中間體的個體，即翻眼小于90度的群體，這種現(xiàn)象很常見，但尚未見文字報道，一般在望天金魚生產(chǎn)選育中會直接淘汰這些個體。本次試驗采用這些介于望天和龍睛中間體的個體和望天眼進行雜交試驗，以觀察其后代遺傳表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些介于望天和龍睛中間體的群體，其純繁后代均可出現(xiàn)部分翻眼成功的望天眼個體；且親本翻眼程度越大，其后代望天比例越高；可見望天眼性狀受遺傳影響較大，推測受多基因共同調(diào)控。KON等報道了白化望天眼金魚相對龍睛其lrp2aL基因編碼的蛋白氨基酸鏈更短。因此，lrp2aL基因可以作為研究調(diào)控望天眼發(fā)育的候選基因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)望天眼性狀一定程度上受母體遺傳效應影響，且個體差異較大，其遺傳規(guī)律與金魚背鰭性狀有些類似。周祺通過對文種與蛋種金魚雜交，發(fā)現(xiàn)金魚背鰭性狀表現(xiàn)出了明顯的母性遺傳特征，且個體差異明顯，并推測金魚背鰭缺失的現(xiàn)象與環(huán)境因素之間的關(guān)系密不可分。針對望天眼性狀一定程度上受母體遺傳效應影響的遺傳規(guī)律，在實際生產(chǎn)選育應用中，母本的選擇對望天眼金魚育種顯得更為重要，這對實際生產(chǎn)選育有積極的借鑒作用。這次雜交試驗在群體中a1雌望天眼金魚個體的后代中望天率最高，可選擇留下作為望天眼選育的母本重點養(yǎng)護，但僅有這么一條親本，對于種質(zhì)保護和擴繁來說都有難度，因此可嘗試通過雌核發(fā)育技術(shù)對這個親本進行擴繁，以保留母體性狀。本次試驗采用介于望天和龍睛中間體的個體和望天眼進行雜交試驗，發(fā)現(xiàn)這些介于望天和龍睛中間體的群體，其純繁后代均可出現(xiàn)部分望天眼個體，且親本翻眼程度越大，其后代望天比例越高。因此，在實際生產(chǎn)中若想培育望天類新品系或?qū)ν煨缕废蹈牧?，在理想親本實在沒有情況下，可以在介于望天和龍睛中間體的個體中，挑選優(yōu)質(zhì)且翻眼程度較大的個體當做親本。

4 結(jié)論

通過不同水深和不同容器透光性養(yǎng)殖試驗，結(jié)果表明金魚望天眼翻眼成功率受水深影響差異極顯著，不同容器透光性對其影響差異不顯著，表明金魚望天眼翻眼成功率一定程度上受環(huán)境影響，建議在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，加深水位以提高望天眼正品率。通過將介于望天和龍睛中間體的個體和望天眼進行雜交試驗，觀察到親本翻眼程度越大，其后代望天比例越高，可見望天眼性狀受遺傳影響較大；并且也觀察到望天眼性狀一定程度上受母體遺傳效應影響。