殺鮭氣單胞菌可視化重組酶聚合酶擴增檢測技術(shù)的建立

谷慶花，李銘遠，司鑫鑫，高 嵩

(江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，江蘇連云港 222005)

殺鮭氣單胞菌()是已知最古老的魚類癤病的病原體，屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，是一種不能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界中。該菌可引起鮭鱒魚類如大西洋鮭()、褐鱒()、虹鱒()等發(fā)生癤病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。目前對該病的治療主要依賴于抗生素，但抗生素的長期使用已導(dǎo)致耐藥性、藥物濫用等諸多問題的出現(xiàn)。因此，建立一種快速、方便的殺鮭氣單胞菌現(xiàn)場檢測方法，在感染早期對該病原菌進行檢測以便及時采取相應(yīng)措施，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

針對殺鮭氣單胞菌的傳統(tǒng)檢測方法為分離鑒定法，該方法既繁瑣又耗時，且由于殺鮭氣單胞菌及其亞種的復(fù)雜性，很難達到檢測的重復(fù)性和特異性要求。近年來，許多分子生物學(xué)技術(shù)，如常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)等，已被應(yīng)用于殺鮭氣單胞菌的快速檢測，這些方法的應(yīng)用使準確檢測病原體所需時間從幾天減少到幾個小時。然而，由于這些方法需要依賴昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，且存在引物設(shè)計復(fù)雜、耗時長等缺點，導(dǎo)致在現(xiàn)場快檢時仍有一定局限。

近幾年來，重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術(shù)被引入到水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的檢測中。該方法是一種能夠在35～45 ℃的恒溫下實現(xiàn)擴增的技術(shù)，利用重組酶UvsX與引物結(jié)合并尋找與引物互補的同源序列后，解鎖局部雙鏈DNA，不需對模板高溫變性，隨后單鏈結(jié)合蛋白gp32進一步打開雙鏈，最后通過Bsu聚合酶來擴增目標序列，30 min內(nèi)就可獲得大量的擴增產(chǎn)物。該擴增方法不依賴昂貴的儀器，操作簡單，接近人體溫度就可以進行目的基因的擴增。RPA擴增結(jié)束后可結(jié)合側(cè)向流試紙條(lateral flow strips,LFS)對產(chǎn)物進行終點目視讀出。RPA-LFS的聯(lián)用是一種對設(shè)備依賴性小、非常適合現(xiàn)場快檢的技術(shù)。本研究建立了一種基于RPA-LFS的殺鮭氣單胞菌檢測方法，為殺鮭氣單胞菌感染的現(xiàn)場快速診斷提供了一種可行的技術(shù)選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

溫和氣單胞菌(ATCC 43979)、豚鼠氣單胞菌(ATCC 15468)、維氏氣單胞菌(ATCC 35624)、哈維氏弧菌(ATCC 14126)、 燦爛弧菌(ATCC 33125)和熒光假單胞菌(ATCC 13525)購自美國American Type Culture Collection(ATCC)菌種保藏中心，并用于本研究。殺鮭氣單胞菌(ATCC 33658)、嗜水氣單胞菌(ATCC 13040)、溶藻弧菌(ATCC 17749)、副溶血弧菌(ATCC 17802)、遲緩愛德華氏菌(CICC 10630)、小腸耶爾森氏菌(ATCC 23715)由本實驗室保存。以上菌株均經(jīng)過了16S rRNA測序確認。

1.2 主要試劑及儀器

RPA試劑包括TwistAmp Basic Kit和TwistAmp nfo Kit，購自英國TwistDx Inc公司；核酸檢測試紙條(LFS)及配套緩沖液購自杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司；手持式第三代組織研磨器購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物及探針的設(shè)計與合成

根據(jù)殺鮭氣單胞菌遺傳性質(zhì)保守的鐵載受體(ferric siderophore receptor,fstA)基因(GenBank accession no.X87995.1)的序列，利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計特異性引物，參數(shù)設(shè)置參考RPA試劑說明書對引物的設(shè)計要求。使用Primer Premier 5軟件在引物定義的區(qū)域內(nèi)設(shè)計探針。根據(jù)TwistAmp nfo Kit說明書要求，探針和反向引物的5′端分別修飾FITC和生物素基團；探針序列中部的一個堿基使用四氫呋喃(THF)基團取代，且探針3′端添加可以阻斷聚合酶延伸的SpC3基團。引物和探針[通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司]序列見表1。

1.4 RPA實驗流程及電泳檢測

RPA實驗根據(jù)TwistAmp Basic Kit說明書進行。在50 μL反應(yīng)體系中，添加1 μL模板，正向、反向引物(10 μmol/L)各2.4 μL，以及試劑盒提供的其他反應(yīng)成分。通過添加2.5 μL乙酸鎂(280 mmol/L)啟動反應(yīng)，并在37 ℃孵育30 min。該反應(yīng)的模板來自細菌培養(yǎng)液，10CFU/mL的殺鮭氣單胞菌培養(yǎng)液經(jīng)100 ℃煮沸10 min后直接用作模板。該反應(yīng)的擴增產(chǎn)物經(jīng)吸附柱純化后，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.5 RPA-LFS實驗流程

在RPA-LFS實驗中，RPA擴增部分按照TwistAmp nfo Kit說明書進行。在50 μL反應(yīng)體系中添加正向、反向引物(10 μmol/L)各2.1 μL，探針(10 μmol/L)0.6 μL，1 μL模板，以及試劑盒提供的其他反應(yīng)成分。通過添加2.5 μL乙酸鎂(280 mmol/L)啟動反應(yīng)，并在30～45 ℃孵育10～30 min。反應(yīng)模板來自細菌培養(yǎng)液，首先將各細菌培養(yǎng)液用去離子無菌水稀釋至所需的濃度(濃度單位：CFU/mL)，然后經(jīng)100 ℃煮沸10 min后直接用作模板。RPA擴增完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物滴加到核酸檢測試紙條(LFS)的樣品墊上，然后將試紙條的側(cè)向流起始端浸入100 μL側(cè)向流緩沖液(主要成分為PBS和Tween-20)中。在試紙條上，沿著側(cè)向流的方向有樣品墊、金標墊(附有帶FITC抗體的納米金顆粒)、檢測線(標記了鏈霉親和素)、質(zhì)控線(標記了FITC抗體的二抗)和吸收墊。在側(cè)向流試紙條上，擴增產(chǎn)物會結(jié)合納米金顆粒并聚集在檢測線上產(chǎn)生陽性信號，而未與擴增產(chǎn)物結(jié)合的納米金顆粒會聚集在質(zhì)控線上指示側(cè)向流的完成。在5 min內(nèi)側(cè)向流實驗即可完成。

1.6 人工污染樣本的準備

從本地市場購買健康活鯉，經(jīng)國標培養(yǎng)法(GB/T 15805.6-2008)確認無殺鮭氣單胞菌污染。使用手持式第三代組織研磨器將腸、腎、脾和肌肉組織分別勻漿。將1 g勻漿重懸于10 mL PBS中，并按實驗需要摻入不同量的殺鮭氣單胞菌。將重懸液加熱至100 ℃孵育10 min后，以5 000離心5 min使組織殘留物沉降，取1 μL上清液直接用作人工污染樣本模板。

2 結(jié)果

2.1 殺鮭氣單胞菌fstA基因片段的RPA擴增

將殺鮭氣單胞菌的培養(yǎng)液經(jīng)熱處理后制備成模板，進行fstA基因片段的RPA擴增。結(jié)果顯示獲得單一條帶，擴增片段長度為255 bp，與預(yù)期大小一致(圖1)，表明該對引物可用于RPA擴增殺鮭氣單胞菌的fstA基因片段。

圖1 殺鮭氣單胞菌fstA基因片段的RPA擴增Fig.1 RPA amplification of fstA gene fragment of A.salmonicidaM：DNA分子質(zhì)量標準；1：以殺鮭氣單胞菌為模板的RPA擴增產(chǎn)物；2：無模板對照

2.2 RPA-LFS反應(yīng)條件優(yōu)化

為確定RPA-LFS方法的最佳反應(yīng)條件，對RPA擴增反應(yīng)溫度和時間進行了篩選。結(jié)果表明：RPA-LFS在30～40 ℃溫度范圍內(nèi)均產(chǎn)生了陽性信號，且信號強度隨著溫度升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當溫度在37 ℃時信號強度最大，檢測線的顯色最明顯(圖2A)。由此確定RPA擴增的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃。然后測試10～30 min之間不同反應(yīng)時間對結(jié)果的影響，結(jié)果顯示反應(yīng)時間為25 min時檢測線的信號最明顯(圖2B)，由此確定RPA擴增的最佳反應(yīng)時間為25 min。

圖2 RPA-LFS反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.2 Reaction condition of the RPA-LFS method

2.3 RPA-LFS檢測方法的特異性

RPA-LFS方法的反應(yīng)溫度和時間確定后，應(yīng)用該方法檢測殺鮭氣單胞菌及其他11種水產(chǎn)常見致病菌模板，結(jié)果表明除殺鮭氣單胞菌模板外，其他致病菌模板的RPA-LFS檢測結(jié)果均為陰性(圖3)，說明本研究建立的殺鮭氣單胞菌RPA-LFS檢測方法具有良好的特異性。

圖3 RPA-LFS檢測方法的特異性Fig.3 Specificity of the RPA-LFS method

2.4 RPA-LFS檢測方法的靈敏度

使用1×10～5×10CFU的殺鮭氣單胞菌樣本確定RPA-LFS檢測方法的靈敏度和最低檢測限。在此檢測范圍內(nèi)，RPA-LFS方法均產(chǎn)生了明顯的陽性信號，表明該方法檢測殺鮭氣單胞菌的靈敏度可達到單次反應(yīng)1 CFU的最低檢測限(圖4)。

圖4 RPA-LFS檢測靈敏度(純培養(yǎng)物)Fig.4 Limit of detection of the RPA-LFS method for pure culture

以上所測為細菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度。為了解在實際檢測中，樣本中其他成分(如魚的組織成分)是否會影響該檢測靈敏度，人工制備了鯉魚組織(包括腸、腎、脾和肌肉)的殺鮭氣單胞菌污染樣本并對檢測靈敏度進行了驗證。單個反應(yīng)所檢測的鯉魚組織污染樣本中殺鮭氣單胞菌含量的范圍是1×10～1×10CFU。結(jié)果顯示，盡管個別信號強度有所減弱，但不同組織污染樣本的檢測靈敏度仍然能達到單次反應(yīng)1 CFU，未受組織成分的影響(圖5)。因此，本研究建立的殺鮭氣單胞菌RPA-LFS檢測方法的靈敏度為單次反應(yīng)1 CFU。

圖5 RPA-LFS檢測靈敏度(鯉魚組織污染樣本)Fig.5 Limit of detection of the RPA-LFS method for spiked samples

3 討論

殺鮭氣單胞菌廣泛分布在自然界中，是條件致病菌，一旦爆發(fā)感染就會給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，該菌引發(fā)的疾病每年可造成加拿大水產(chǎn)養(yǎng)殖損失超過4億美元。因此，如何快速準確地檢測該病原菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域顯得十分重要。

目前針對殺鮭氣單胞菌的檢測方法已被陸續(xù)開發(fā)出來。早在1993年，童裳亮等利用ELISA技術(shù)建立了快速檢測水樣中殺鮭氣單胞菌的方法；BEAZ-HIDALGO等評估一種新的PCR方案，旨在檢測魚組織中的殺鮭氣單胞菌；SAVAN等根據(jù)基因設(shè)計了特異性引物并應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)來檢測大西洋鱈魚非典型癤病的病原殺鮭氣單胞菌。但這些方法存在時間跨度長、需要專業(yè)的儀器設(shè)備和操作人員，且不能滿足偏遠地區(qū)或資源貧乏地區(qū)的檢測要求。

RPA-LFS是一種近年來發(fā)展起來的對設(shè)備依賴性小、簡單、快速的檢測技術(shù)，特別適合資源貧乏地區(qū)的現(xiàn)場快速檢測。例如DONG等建立的基于RPA-LFS方法，適用于海水養(yǎng)殖業(yè)的溶藻弧菌致病菌株的現(xiàn)場檢測；彭遙等建立的側(cè)流層析-重組酶聚合酶擴增技術(shù)在臨床及現(xiàn)場檢測土拉弗朗西斯菌中具有應(yīng)用前景。本研究建立了一種基于RPA-LFS的殺鮭氣單胞菌可視化快速檢測技術(shù)，基于殺鮭氣單胞菌的毒力基因fstA保守區(qū)設(shè)計引物和探針，并對反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示37 ℃、25 min為最佳反應(yīng)條件。該方法特異性好，與其他魚類致病菌無交叉反應(yīng)。該方法靈敏度高，最低檢測限可達單次反應(yīng)1 CFU。而目前其他檢測方法，包括基于PCR、qPCR和LAMP的檢測方法等，最低檢測限在單次反應(yīng)10至100 CFU之間。盡管本研究確定靈敏度時將細菌添加到組織勻漿液中，與從細菌感染的組織中提取細菌DNA的效率有所差異，但本研究僅使用熱處理釋放DNA，而未經(jīng)DNA提取純化步驟，說明在粗模板狀態(tài)下該方法的靈敏度是令人滿意的。另外，應(yīng)用該方法檢測鯉魚組織污染樣本中殺鮭氣單胞菌時，粗模板的檢測靈敏度未受到明顯影響，也印證了RPA擴增可耐受一定擴增抑制劑的特征。此外，用于RPA擴增的反應(yīng)組分為干粉形式，便于運輸和儲存，這種特性使將RPA-LFS方法組裝成一個“移動手提箱實驗室”成為可能，便于在現(xiàn)場使用。

綜上所述，本研究建立的基于RPA-LFS的殺鮭氣單胞菌可視化快速檢測技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、結(jié)果可通過肉眼觀察、不依賴昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點，適用于養(yǎng)殖業(yè)中殺鮭氣單胞菌的現(xiàn)場檢測。