雨生紅球藻藻種改良趨勢及育種研究進展

徐曉瑩，黃華，陳坤，徐惠章，史文凱，張金浩，王鶴

（煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264000）

雨生紅球藻Haematococcus pluvialis 屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬，是自然界中蝦青素含量最高的生物[1,2]，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)和家畜、禽養(yǎng)殖、醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。利用雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素已成為高值經(jīng)濟微藻技術(shù)研發(fā)的熱點。但雨生紅球藻培育條件要求高，易被其他微藻、雜菌污染，生長緩慢，培養(yǎng)周期長。因此，篩選生長速率快、蝦青素含量高的雨生紅球藻株是亟待解決的問題。本文主要概述了雨生紅球藻育種研究現(xiàn)狀，并展望其應(yīng)用前景。

1 雨生紅球藻的藻種改良趨勢

與大部分微藻不同，雨生紅球藻具有游動細(xì)胞和不動細(xì)胞等多形態(tài)交互變化的生活史特征，并受培養(yǎng)基組成和環(huán)境條件的影響。從游動細(xì)胞向不動細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程通常伴隨著蝦青素的不斷積累，因此,近年來有關(guān)雨生紅球藻的研究主要集中在蝦青素的誘導(dǎo)因素及其相關(guān)代謝與調(diào)控機制[3-8]。雨生紅球藻生長緩慢，培養(yǎng)條件要求高，細(xì)胞難以進行高密度培養(yǎng)。目前商業(yè)化生產(chǎn)的雨生紅球藻，基本上都是采用傳統(tǒng)光自養(yǎng)方式，即在開放式跑道池或各類光生物反應(yīng)器中進行。光自養(yǎng)方式產(chǎn)率低，對室外光照條件要求高，收獲物的培養(yǎng)密度也不高，一般僅為1～3 g·L-1[9,10]。這直接造成了雨生紅球藻藻粉的供應(yīng)遠(yuǎn)不能滿足下游蝦青素生產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)的需求。

除了光自養(yǎng)的生長方式外，也嘗試通過異養(yǎng)或混養(yǎng)的方式培養(yǎng)雨生紅球藻，迄今已證明，乙酸鈉是雨生紅球藻最有效的有機碳源[11-13]。Hata 等[14]通過分批補料添加乙酸鈉的方式使雨生紅球藻細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到7 g·L-1；Wan 等[15]報道，雨生紅球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)密度可達(dá)26 g·L-1，生物量產(chǎn)率達(dá)64.1 mg·L-1·h-1。這表明雨生紅球藻的異養(yǎng)或混養(yǎng)培養(yǎng)方式可有效提高雨生紅球藻的生物量產(chǎn)出，降低生產(chǎn)成本。

異養(yǎng)雨生紅球藻的生長優(yōu)勢強于自養(yǎng)方式，可獲得高密度培養(yǎng)物，但是，雨生紅球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)仍存在明顯的缺陷。首先，生長速率較低。乙酸對細(xì)胞生長起抑制作用，在傳統(tǒng)微生物發(fā)酵中乙酸一般是作為一種不利的副產(chǎn)物，以乙酸為底物的發(fā)酵過程一般效率較低。Hata 等[14]和Wan 等[15]的研究中都采用pH 調(diào)控的方式進行補料，控制體系濃度與添加量。他們都發(fā)現(xiàn)乙酸并不利于雨生紅球藻游動營養(yǎng)細(xì)胞的繁殖，這導(dǎo)致細(xì)胞的生長速率低，為獲得高密度培養(yǎng)物往往需要長時間培養(yǎng)。

其次，異養(yǎng)過程也不利于蝦青素積累。有研究證明：異養(yǎng)生長的蝦青素積累效率遠(yuǎn)低于光自養(yǎng)誘導(dǎo)條件[16]。為提高細(xì)胞積累蝦青素的效率，Hata 等[14]通過強光誘導(dǎo)后，單蝦青素產(chǎn)率為4.4 mg·L-1·d-1，并不高于自養(yǎng)過程的6.3 mg·L-1·d-1。Wan 等[15]則通過細(xì)胞稀釋、光自養(yǎng)培養(yǎng)以及光誘導(dǎo)蝦青素積累的三步過程，實現(xiàn)了6.4 mg·L-1·d-1的蝦青素產(chǎn)率，持平于自養(yǎng)過程。但是，這種方式并未跳過傳統(tǒng)二步法的雨生紅球藻蝦青素生產(chǎn)過程。因此，雨生紅球藻異養(yǎng)生長能力仍然有待改善，獲得具有更高異養(yǎng)細(xì)胞生長速率、能夠利用糖類等更多碳源底物的高效誘導(dǎo)積累蝦青素優(yōu)良藻株，可能是未來藻種異養(yǎng)性狀改良較有發(fā)展?jié)摿Φ难芯糠较颉?/p>

2 雨生紅球藻的育種研究現(xiàn)狀

為進一步促進雨生紅球藻的商業(yè)化應(yīng)用，提高產(chǎn)品價值和產(chǎn)業(yè)效益，選擇適應(yīng)能力強、生長繁殖快的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雨生紅球藻是努力方向。

2.1 選擇育種

選擇育種是利用現(xiàn)有種類通過馴化與自然選擇而育成新品種。這種育種方法簡單易行、安全性好。張寶玉等[17]通過自然選育的方式，比較分析了四個品系的雨生紅球藻在不同溫度下的生長速率、生物量、蝦青素含量和產(chǎn)量，選育出適合在較高和較低溫度下大規(guī)模培養(yǎng)的雨生紅球藻品系。但該育種方式下藻株發(fā)生變異的機率較小，育種周期長，選育的藻株普遍存在遺傳性狀不穩(wěn)定的缺點。

2.2 誘變育種

誘變育種操作簡單、成本低、效率高，使用較為廣泛。通過物理或化學(xué)誘變選育雨生紅球藻的報道較多。Tjahjono 等[18]用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理雨生紅球藻，并利用瓊脂板分離方法篩選出具有氟啶酮抗性的兩個突變株、具有達(dá)草滅抗性的四個突變株以及具有尼古丁抗性的多個突變株。Tripathi等[19]分別采用不同照射時間的紫外線和不同濃度的甲基磺酸乙酯（EMS）處理雨生紅球藻，發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞的生長速率和蝦青素含量隨著誘變劑量的增加而增加，但藻細(xì)胞存活率下降；將處理后存活的藻細(xì)胞進一步用除草劑進行篩選，并未得到單一的突變株。蔣霞敏等[20]主要研究了不同劑量紫外線照射后雨生紅球藻細(xì)胞生長、色素含量等指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示：經(jīng)紫外線輻射后，藻細(xì)胞葉綠素和類胡蘿卜素含量增加；經(jīng)紫外輻射4～5 min 后，藻細(xì)胞蝦青素含量顯著提高。肖媛等[21]研究了波長范圍為280～320 nm 的紫外線（UV-B）輻射對雨生紅球藻細(xì)胞的一系列生理生化過程的影響。結(jié)果表明：UV-B輻射可降低雨生紅球藻光合活性，抑制生物量的增加，改變類胡蘿卜素和蝦青素的含量并影響細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量，降低抗氧化酶活性。丁雅婷等[22]探索了等離子體、喹禾靈等不同誘變方式及不同篩選條件對雨生紅球藻的影響，最終篩選出生物量和蝦青素含量均有所提高的三株優(yōu)良性狀突變藻株。誘變育種對遺傳物質(zhì)DNA 的操作針對性不強，且在操作時對人體及環(huán)境有一定的危害性，但現(xiàn)代分子遺傳學(xué)和基因工程等相關(guān)科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展為定向誘變奠定了基礎(chǔ)。

2.3 基因工程育種

基因工程育種是在分子水平上對基因進行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使目標(biāo)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作?；蚬こ逃N目標(biāo)明確、針對性強，但安全性還有待進一步驗證。鄭凱靜等[23]利用RT-PCR 技術(shù)從一株雨生紅球藻總RNA 中擴增出β-胡蘿卜素羥化酶基因的cDNA 序列，并經(jīng)過多序列比對分析表明，雨生紅球藻與萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii 的親緣關(guān)系較近，與其他高等植物以及細(xì)菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。王娜[24]等從雨生紅球藻中克隆出IPP 異構(gòu)酶基因（ipiHp1），并利用根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens 侵染法和基因槍轉(zhuǎn)化法，將目的基因?qū)胗晟t球藻中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)化子的生物量與野生型相似，農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子A3 蝦青素含量比野生型顯著提高，而基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子蝦青素含量與野生型并無顯著性差異。龔文芳等[25]利用杜氏鹽藻Dunaliella salina lycB 基因構(gòu)建雨生紅球藻RNAi載體，并將其導(dǎo)入雨生紅球藻細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能干擾雨生紅球藻番茄紅素環(huán)化酶，進而影響其β-胡蘿卜素合成代謝。侯善茹等[26]以植物表達(dá)載體構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化方法，成功并穩(wěn)定地表達(dá)了報告基因GFP 和YFP，拓寬了pBI121 載體的應(yīng)用范圍，為雨生紅球藻的轉(zhuǎn)化開辟了新的遺傳轉(zhuǎn)化途徑?？傮w而言，目前雨生紅球藻轉(zhuǎn)化仍然主要依賴于基因槍方法，但可用的表達(dá)載體以及篩選標(biāo)記少、外源基因不能表達(dá)等問題仍有待進一步解決。

2.4 細(xì)胞融合與雜交育種

細(xì)胞融合是將酶解去壁的2 種不同細(xì)胞的原生質(zhì)體融合在一起，經(jīng)生長分化，誘導(dǎo)形成新品種。細(xì)胞融合可以打破物種界限，實現(xiàn)遠(yuǎn)源基因重組，縮短育種周期，提高育種水平。Tjahjono 等[18]將雨生紅球藻的一系列抗抑制物突變體進行原生質(zhì)融合后得到雜交株，其蝦青素的含量是野生型的3 倍。Abomohra 等[27]研究了雨生紅球藻與一株金藻門的藻株Ochromonas danica 的細(xì)胞融合，并通過脂肪酸分析證明了融合子不同于兩種親本藻株。小球藻Chlorella vulgaris 和雨生紅球藻同屬綠藻門，親緣關(guān)系較近，因此曾有研究者提出將雨生紅球藻同小球藻進行原生質(zhì)體的融合，希望能獲得快速生長和抗逆性強的雜交品種[28]。但該研究雖然獲得了雜交的株系，但并未開展異養(yǎng)株的篩選工作，僅對雜交克隆的脂肪酸組成等雜交表型進行了分析。為提高雨生紅球藻糖異養(yǎng)生長能力，研究人員利用PEG 介導(dǎo)融合技術(shù)將雨生紅球藻與小球藻原生質(zhì)體進行融合。試驗中觀察到典型的融合現(xiàn)象，獲得了雨生紅球藻形態(tài)的融合子克隆，其生長速率比野生型雨生紅球藻顯著提高，但在后續(xù)傳代過程中表型分化現(xiàn)象時有出現(xiàn)，說明異源基因組間的重組效率不高[29]。雖然關(guān)于雨生紅球藻細(xì)胞融合的研究較少，但細(xì)胞融合可以突破有性雜交過程中的隔離機制，拓寬育種領(lǐng)域，為遠(yuǎn)源物種間遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑，應(yīng)用前景廣闊。

3 總結(jié)與展望

雨生紅球藻的育種研究進展較為緩慢，早期大多采用傳統(tǒng)的選擇育種和誘變育種方法，育種時間長，工作量大。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，細(xì)胞融合和基因工程等新的育種技術(shù)不斷應(yīng)用于雨生紅球藻的育種工作中，為培育穩(wěn)定遺傳的良種藻株提供了快速高效的途徑。將傳統(tǒng)的育種技術(shù)與現(xiàn)代育種技術(shù)相結(jié)合，取長補短，是未來微藻良種培育的關(guān)鍵。將原生質(zhì)體融合技術(shù)同基因組誘變技術(shù)相結(jié)合，建立更高效的藻種間基因組雜交篩選技術(shù)，為雨生紅球藻藻種改良建立更穩(wěn)定的改造體系與平臺。