養(yǎng)精膠囊通過LncRNA H19調(diào)控StAR促進睪酮合成的實驗研究※

王丹丹 金保方 邢棟 劉媛媛 蔡濱 鄧偉民 崔毓桂 孫大林▲

睪酮（Testosterone，T）是由睪丸和腎上腺產(chǎn)生的雄激素，對肌肉、骨骼、毛發(fā)以及性功能都有影響。睪酮水平降低會產(chǎn)生乏力、注意力不集中、抑郁、性欲低下和勃起功能障礙等癥狀。外源性補充睪酮是目前臨床常用的治療方法，但其不良反應多，且會降低男性精子生成和生育能力[1]。其中，游離睪酮（Free testosterone，F(xiàn)T）代表雄激素的活性形式[2]。

長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，LncRNAs）是一類不具備蛋白翻譯功能、長度超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本。LncRNA H19位于人類第11號染色體，全長2.3 kb。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，H19可以促進類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）表達和睪酮的生成。StAR是類固醇激素生成的關(guān)鍵酶，可以將膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜[5]，隨后經(jīng)過線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中相關(guān)酶的催化進而轉(zhuǎn)化為睪酮。

養(yǎng)精膠囊是用于睪酮低下引起性功能障礙及男性不育的醫(yī)院制劑。筆者團隊前期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)精膠囊能夠提高StAR啟動子活性從而增加睪酮合成，但關(guān)于其上游的調(diào)控機制仍不明確。由于H19在睪酮合成中具有重要作用，養(yǎng)精膠囊可能是通過LncRNA H19調(diào)控StAR進而發(fā)揮作用，但目前尚無相關(guān)報道。本研究旨在進一步探索養(yǎng)精膠囊對LncRNA H19表達的影響，探討其促進睪酮合成的機制，具有重要意義。

1 資料及方法

1.1 細胞株與細胞培養(yǎng)小鼠間質(zhì)細胞（Leydig細胞）系MLTC-1，購于上海中國科學院細胞庫，用RPMI-1640培養(yǎng)基（凱基生物，KGM31800-500），加入10%胎牛血清（ScienCell，0500）配成完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

1.2 實驗藥物養(yǎng)精膠囊（由淫羊藿、熟地黃、紫河車、沙苑子、黃精、牡蠣、當歸、黃芪、王不留行、水蛭、荔枝核按1：1：1：1：2：2：1：2：2：1：1組成）來自南京軍區(qū)總醫(yī)院制劑科〔院臨（2004）第01002號〕，其水提物提取方法見參考文獻[7]。實驗時用RPMI-1640培養(yǎng)基按比例稀釋為低、中、高3種濃度梯度，分別相當于生藥量0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL。

1.3 主要試劑0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，2186976）；磷酸鹽緩沖液（Servicebio，G4202-500ML）；RNA快速提取試劑盒（ES Science，RN001）；焦碳酸二乙酯水（Beytime，R0021）；PrimeScript? RT Master Mix（Takara，RR036A）；TB Green? Premix Ex Taq?（Takara，RR420A）；RIPA裂解液（Thermo，#89900）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物（Thermo，VB298680）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beytime，P0010）；Laemmli樣品緩沖液（Bio-rad，#161037）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beytime，P0012A）；PageRuler? Prestained Protein Ladder,10 to 180 kDa（Thermo，26616）；StAR Polyclonal antibody（Proteintech，12225-1-AP）；β-actin抗體（Proteintech，20536-1-AP）；山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標記（Abcam，ab7090）；通用型抗體稀釋液（新賽美，WB500D）；超敏化學發(fā)光檢測試劑盒（US EVERBRIGHT INC，S6009）；小鼠睪酮ELISA試劑盒（上海紀寧，A00550）；小鼠游離睪酮ELISA試劑盒（上海紀寧，JN17549-S）。

1.4 實驗儀器超凈臺；培養(yǎng)箱；臺式冷凍離心機（Eppendorf AG，5404）；核酸蛋白測定儀（Eppendorf AG，6132）；PCR儀（applied biosystems，9902）；StepOnePlus實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（applied biosystems）；酶標儀（Thermo，1510）；垂直電泳系統(tǒng)（Bio-rad，PowerPac? Basic）；曝光機（Tanon，5200）。

1.5 藥物干預及分組6孔板內(nèi)接種2×105個/孔細胞數(shù)，待細胞生長至對數(shù)期，分別加入2 mL的培養(yǎng)基以及終濃度為0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL的養(yǎng)精膠囊水提物，并將其分別作為對照組和養(yǎng)精膠囊低、中、高劑量組。

1.6 觀察指標

1.6.1 細胞上清T和FT濃度 上藥處理24 h后，胰酶消化細胞2 min，完全培養(yǎng)基中和，再1000 g離心20 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測，按照ELISA試劑盒說明書操作，最后用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，計算細胞上清中T和FT濃度。

1.6.2 mRNA相對表達量 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。用試劑盒提取細胞總RNA，之后用核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后以cDNA為模板進行擴增。所用引物由南京銳真生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，詳見表1。根據(jù)試劑盒說明書進行加樣操作，反應采用標準兩步法，以2-△△CT法計算mRNA的相對表達量[8]。

表1 H19、StAR、β-actin引物序列

1.6.3 StAR蛋白水平 采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）進行檢測。胰酶消化細胞離心去上清后，加入RIPA Buffer裂解細胞，選擇BCA法測定細胞蛋白濃度，確定上樣量30 μg，加入2×上樣緩沖液，煮蛋白制樣；制備10% SDS-PAGE凝膠，上樣后電泳（壓縮膠80 V、分離膠120 V），隨后用PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入StAR抗體（1:1000）、β-actin抗體（1:2000）后于4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜后加入HRP標記的兔二抗（1:5000）室溫孵育1 h，最后加顯影液曝光。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0.2進行統(tǒng)計分析。各組計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示。符合正態(tài)分布的兩組定量數(shù)據(jù)，采用雙尾t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

研究結(jié)果均為至少進行三次獨立重復實驗所得。

2.1 養(yǎng)精膠囊處理MLTC-1后細胞上清T和FT水平的變化ELISA檢測結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊高劑量組可提高MLTC-1細胞上清睪酮濃度（見圖1A）和游離睪酮濃度（見圖1B），與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 養(yǎng)精膠囊對MLTC-1細胞上清T和FT水平的影響

2.2 養(yǎng)精膠囊處理MLTC-1細胞后StAR mRNA和蛋白水平的變化qRT-PCR檢測結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊各劑量組均能明顯提高StAR的轉(zhuǎn)錄水平，增加StAR mRNA的表達（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），見圖2A。Western Blot檢測結(jié)果表明，隨著養(yǎng)精膠囊劑量的增加，StAR蛋白的表達增加，且低、高劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2B。

圖2 養(yǎng)精膠囊對MLTC-1細胞中StAR mRNA和蛋白的影響

2.3 養(yǎng)精膠囊處理MLTC-1細胞后LncRNA H19 mRNA水平的變化qRT-PCR檢測結(jié)果表明，隨著養(yǎng)精膠囊劑量的增加，H19 mRNA的表達上調(diào)，且養(yǎng)精膠囊中、高劑量組能夠顯著提高H19的轉(zhuǎn)錄水平，增加H19 mRNA的表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 養(yǎng)精膠囊對MLTC-1細胞中LncRNA H19 mRNA的影響

3 討論

睪酮大部分由睪丸Leydig細胞分泌，并受下丘腦-垂體-性腺軸的負反饋調(diào)節(jié)。Leydig細胞位于生精小管之間的間質(zhì)內(nèi)，在垂體分泌的黃體生成素刺激下產(chǎn)生睪酮，進而維持男性第二性征并調(diào)節(jié)男性生殖功能。總睪酮包括游離睪酮和與蛋白質(zhì)結(jié)合的睪酮，后者可與性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）高親和力結(jié)合，與白蛋白、皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白及類黏蛋白（orosomucoid，ORM）低親和力結(jié)合。其中，與白蛋白低親和力結(jié)合的睪酮容易發(fā)生解離，與游離睪酮共同構(gòu)成生物可利用睪酮，在雄激素依賴性靶組織中具有生物活性。未與任何血漿蛋白結(jié)合的循環(huán)睪酮部分稱為游離睪酮。由于SHBG水平隨著年齡的增長而增加，因此與年齡相關(guān)的游離睪酮水平下降幅度大于總睪酮水平下降幅度。研究[9]顯示，游離睪酮與遲發(fā)性性腺功能減退癥的相關(guān)性強于總睪酮。然而，游離睪酮目前的測定方法缺乏標準化，通過SHBG、白蛋白和總睪酮計算游離睪酮是相對準確的[10]。采用ELISA測定游離睪酮，雖缺乏一定的準確性，但亦能在一定程度上說明問題[11]。

LncRNA H19是目前已報道的少數(shù)印跡基因之一，在進化上高度保守。胚胎發(fā)育期，H19在內(nèi)胚層和中胚層組織中高度表達，出生后主要在骨骼肌、心肌、乳腺、卵巢、子宮和睪丸中表達。H19在腫瘤進展、能量代謝和機體生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[12]。近年來，多項研究報道了H19在類固醇激素合成方面的作用，發(fā)現(xiàn)H19內(nèi)含4個microRNA Let-7的結(jié)合位點，可以像“分子海綿”一樣通過結(jié)合“吸附”Let-7，抑制其功能[13]，進而解除翻譯抑制和mRNA激活，從而促進靶基因StAR的表達和孕酮的生成[14]。Chen等[4]通過敲除雌性小鼠卵巢組織內(nèi)H19基因，導致類固醇合成酶CYP17和睪酮的合成均顯著下調(diào)，證實了H19在調(diào)控睪酮合成方面具有重要作用。

養(yǎng)精膠囊是基于中醫(yī)“腎藏精，主生殖”理論，結(jié)合肝腎同源、精血互生的思路而設(shè)，具有益腎養(yǎng)精、補血活血的功效。養(yǎng)精膠囊由淫羊藿、熟地黃、紫河車、沙苑子、黃精、牡蠣、當歸、黃芪、王不留行、水蛭、荔枝核組成。其中，淫羊藿性溫，味辛、甘，可補腎溫陽、強筋散濕；熟地黃性溫，味甘，可益精填髓、滋陰補血，兩者均入肝腎經(jīng)，陰陽雙補，互生互化，共為君藥。紫河車補腎填精、益氣養(yǎng)血；黃精健脾補腎、氣陰雙補；沙苑子益腎養(yǎng)肝、固精明目；牡蠣潛陽補陰，重鎮(zhèn)安神；黃芪、當歸補氣養(yǎng)血，以充化腎精，有養(yǎng)血生精之功，共為臣藥。王不留行、水蛭和荔枝核共用以疏肝行氣、活血化瘀，為佐藥。全方有益腎養(yǎng)血活血之效，臨床可用于治療睪酮低下引起的男性不育癥和勃起功能障礙。

前期臨床研究[15-17]表明，養(yǎng)精膠囊可以顯著提高人體的血清睪酮水平，改善少、弱精子癥和無精子癥患者的精子數(shù)量和質(zhì)量。動物實驗[18,19]表明，養(yǎng)精膠囊可促進老年鼠睪酮的分泌，提高睪丸的臟器指數(shù)，以及精囊的分泌功能，增加精液量。體外細胞實驗[6,7,20]結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊水提液可以通過提高Leydig細胞中StAR的啟動子活性，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表達，提高細胞上清睪酮含量?；谇捌诘难芯炕A(chǔ)以及H19調(diào)控類固醇合成酶和睪酮生成的作用，筆者團隊進一步研究養(yǎng)精膠囊對H19表達的影響，進而探索其促進睪酮合成的機制，具有一定的延續(xù)性和創(chuàng)新性。本研究表明，養(yǎng)精膠囊水提物可以顯著提高Leydig細胞上清中睪酮和游離睪酮的濃度，同時還可以明顯促進LncRNA H19 mRNA以及StAR mRNA和蛋白的表達?；贖19在睪酮合成中的作用[4]，筆者團隊初步認為養(yǎng)精膠囊是通過H19調(diào)控StAR來促進睪酮合成的，后期還需通過H19的干擾實驗進一步證實。

本結(jié)果表明，補腎填精類中藥復方養(yǎng)精膠囊可以通過調(diào)控LncRNA H19以促進Leydig細胞合成睪酮，這對于闡明補腎填精法多通路改善男性生殖功能的機制，揭示“腎藏精”的科學實質(zhì)，指導臨床治療睪酮降低引起的生殖疾病，提高男性的生殖健康具有重要意義。