CD147抑制前列腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激作用

徐海月，李澤顥，韓永琪，王立國，方 芳

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是一種惡性腫瘤，是全世界男性癌癥死亡的主要原因之一[1]。PCa多發(fā)生于55 歲以上男性患者，高脂飲食、炎癥、性激素失衡等是導(dǎo)致其發(fā)生的危險(xiǎn)因素，這些因素與氧化應(yīng)激密切相關(guān)?；钚匝踝杂苫?reactive oxygen species, ROS)是氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的一種最為重要的氧化性介質(zhì)。一定水平的 ROS 有助于機(jī)體抵御感染等引起的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用；而過量的ROS可能對(duì)細(xì)胞造成不同程度的氧化性損傷[2]。因此，調(diào)節(jié)腫瘤氧化應(yīng)激的分子對(duì)腫瘤的治療至關(guān)重要。

分化簇(CD)147(CD147)，是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在PCa等惡性腫瘤中表達(dá)增高[3-5]。研究[6]表明，在黑色素瘤細(xì)胞中刪除CD147的表達(dá)使細(xì)胞對(duì)過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激更為敏感。然而CD147對(duì)調(diào)節(jié)PCa細(xì)胞氧化應(yīng)激作用尚不清楚。該研究旨在探討CD147對(duì)PCa細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，為PCa的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料胰酶、胎牛血和RPMI-1640購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自北京博奧森公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒購自北京索萊寶公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量 PCR 試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；PCR引物由庫美公司合成；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；Nrf2和HO-1 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參抗體 β-actin抗體購自美國Gene Tex公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 低表達(dá)CD147的實(shí)驗(yàn)組LNCaP細(xì)胞(LNCaP/shCD147) 和陰性對(duì)照組LNCaP細(xì)胞(LNCaP/Scramble)由本實(shí)驗(yàn)室保存[7]。細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.2RT-qPCR鑒定CD147 mRNA表達(dá) 采用有機(jī)溶劑抽提法TRlzol法提取細(xì)胞總RNA， 定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以β-actin為內(nèi)參照， RT-qPCR檢測CD147 mRNA表達(dá)量，用基因相對(duì)定量法(2-△△Ct)計(jì)算結(jié)果。β-actin的上游引物序列為5′-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，下游引物序列為5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；CD147的上游引物序列為5′- CAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCG-3′，下游引物序列為5′- TGCGAGGAACTCACGAAGAA-3′。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測ROS 收集兩組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后吸除上清液，用無菌PBS溶液洗滌2次。細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測按照ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行。即每份樣本細(xì)胞中加入1 ml的DCFH-DA稀釋液(無血清DMEM培養(yǎng)液按照1 ∶1 000比例稀釋)，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞并重復(fù)3次，重懸細(xì)胞于0.5 ml PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。

1.2.4SOD、GSH-PX和MDA水平的檢測 收集細(xì)胞離心，將各組細(xì)胞沉淀用PBS重懸后超聲裂解，離心后取上清進(jìn)行蛋白含量測定，抗氧化酶(SOD，GSH-PX)活性及MDA含量的檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，分光光度計(jì)測吸光度。

1.2.5CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞配制成濃度為4×108個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，體積為每孔100 μl，接種于96孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基吸掉，分別加入終濃度為100、200、400、800 μmol/L的 H2O2稀釋液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別作用2、4 h后，每孔避光加入10 μl CCK-8溶液，待培養(yǎng)液顯色后用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度值，以細(xì)胞的存活率表示細(xì)胞的活力。

1.2.6Western blot 檢測細(xì)胞中p-AKT、AKT、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) 將兩組細(xì)胞用無菌PBS緩沖液清洗3次，再用RIPA細(xì)胞裂解液冰上靜置5 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清液蛋白定量后加入上樣緩沖液，煮沸5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中每個(gè)泳道加入20 μl(含40 μg)的總蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗p-AKT、AKT、Nrf2和HO-1抗體(1 ∶500)、β-actin和Histone H3抗體(1 ∶1 000)4 ℃過夜。次日TBST洗膜，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(1 ∶5 000)，室溫避光孵育45 min，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR鑒定H2O2刺激下細(xì)胞內(nèi)CD147的表達(dá)采用不同濃度的H2O2刺激LNCaP細(xì)胞后，CD147的表達(dá)逐漸增加(P<0.001)。見圖1。

圖1 H2O2刺激下CD147的表達(dá)情況與0 μmol/L組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 RT-qPCR鑒定細(xì)胞CD147的表達(dá)結(jié)果顯示，與LNCaP/Scramble組細(xì)胞CD147表達(dá)水平比較，LNCaP/shCD147組CD147的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.408，P<0.01)。

2.3 沉默CD147對(duì)細(xì)胞ROS含量影響流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果顯示陰性對(duì)照組LNCaP/Scramble細(xì)胞ROS含量為(3.60±0.84)，細(xì)胞模型組LNCaP/shCD147細(xì)胞內(nèi)ROS水平為(13.23±0.76)，與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞模型組ROS增高(F=33.825，P<0.01)。見圖2。

圖2 沉默CD147表達(dá)對(duì)ROS的生成影響

2.4 沉默CD147對(duì)SOD、GSH-PX活性和MDA含量影響LNCaP/Scramble組細(xì)胞抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性值和MDA的含量分別是(41.563±1.873)、(30.341±1.261)和(2.562±0.264)；LNCaP/shCD147細(xì)胞組細(xì)胞抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性值和MDA的含量分別是(250.755±12.502)、(173.112±14.591)和(3.678±0.398)。與LNCaP/Scramble組相比較，LNCaP/shCD147細(xì)胞SOD、GSH-PX的活性降低(F=74.376、48.999，P<0.01)，而細(xì)胞上清中MDA的含量升高(F=16.568，P<0.05)。

2.5 沉默CD147對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響CCK-8方法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示：與LNCaP/Scramble組比較，當(dāng)400 μmol/L H2O2作用細(xì)胞2 h時(shí)，LNCaP/shCD147細(xì)胞存活率下降(F=8.328，P<0.05)，并且隨著H2O2濃度的升高細(xì)胞存活比率越低(F=26.172，P<0.01)。當(dāng)200 μmol/L H2O2作用LNCaP/shCD147細(xì)胞4 h后，細(xì)胞存活率下降(F=14.763，P<0.05)，隨著 H2O2濃度的升高LNCaP/shCD147組細(xì)胞存活率逐漸下降(F=78.790、151.603，P<0.01)。見圖3。

圖3 沉默CD147對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞存活影響A:不同濃度H2O2作用2 h后細(xì)胞存活率變化;B：不同濃度H2O2作用4 h后細(xì)胞存活率變化；與LNCaP/scramble 組比較：**P<0.01

2.6 CD147通過PI3K/AKT途徑抑制氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組LNCaP/Scramble比較，LNCaP/shCD147細(xì)胞中Nrf2 和HO-1表達(dá)降低(F=38.495、73.597，P<0.01)。與LNCaP/shCD147細(xì)胞組比較，采用20 μmol/L PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002作用細(xì)胞24 h后，LNCaP/shCD147細(xì)胞中Nrf2 和HO-1表達(dá)進(jìn)一步降低(F=50.342、47.756，P<0.01)。見圖4。

圖4 沉默CD147促進(jìn)H2O2作用LNCaP細(xì)胞Nrf2和HO-1的表達(dá)A:各組Nrf2蛋白表達(dá)；B:各組HO-1蛋白表達(dá)；1：LNCaP/scramble組;2：LNCaP/shCD147組;3：LNCaP/scramble+LY294002組;4：LNCaP/shCD147+LY294002組；與LNCaP/scramble組比較：**P<0.01；與LNCaP/shCD147組比較：##P<0.01

3 討論

氧化應(yīng)激在PCa發(fā)生發(fā)展中起重要作用。與PCa旁的正常前列腺組織相比，PCa組織中產(chǎn)生更高水平的內(nèi)源性 ROS，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和新血管形成等[8]。然而，過量的ROS可引起氧化應(yīng)激，破壞、氧化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。因此，探討腫瘤細(xì)胞在ROS作用下的分子機(jī)制，有望為治療腫瘤提供新的線索。

首先通過RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)檢測到，選用不同濃度及不同時(shí)間點(diǎn)的H2O2作用LNCaP細(xì)胞后，CD147表達(dá)逐漸升高，這表明CD147可能參與了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激。接下來利用特異性siRNA干擾技術(shù)成功降低了CD147在PCa中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCa細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，導(dǎo)致細(xì)胞中過多的ROS積累，說明CD147可能具有抑制氧化應(yīng)激的作用。ROS包括超氧化物陰離子、H2O2、羥基自由基，可刺激細(xì)胞引起結(jié)構(gòu)破壞，包括脂質(zhì)過氧化以及DNA和蛋白質(zhì)氧化，破壞人體的氧化還原平衡并改變細(xì)胞的正常功能和形態(tài)[9]。在進(jìn)化過程中，哺乳細(xì)胞中產(chǎn)生強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)，例如SOD、GSH-PX和MDA等。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，通過將超氧化物歧化為普通分子氧來維持機(jī)體代謝平衡。GSH-PX是體內(nèi)重要的自由基捕獲酶之一，能減少脂質(zhì)過氧化物的形成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷的能力。MDA在受到氧化刺激時(shí)會(huì)顯著增加，能影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及關(guān)鍵酶活性并加劇膜的損傷，通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大活性氧的作用，可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度。CD147干擾之后，細(xì)胞上清液中MDA含量升高，SOD和GSH-PX的活性降低，說明CD147可能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的作用使腫瘤細(xì)胞處于平衡狀態(tài)。此外，利用H2O2作用細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型表明CD147表達(dá)降低后細(xì)胞存活下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明CD147具有對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)具有重要的抗氧化作用，通過作用抗氧化反應(yīng)序列元件(ARE)并調(diào)控下游Ⅱ相代謝酶和抗氧化蛋白/酶的信號(hào)通路在細(xì)胞防御保護(hù)中發(fā)揮重要作用。Ⅱ相代謝酶血紅素加氧酶-1(HO-1)是血紅素分解代謝過程中的限速酶，是一種參與抗氧化、抗凋亡和抗炎反應(yīng)的應(yīng)激蛋白[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD147表達(dá)下降后Nrf2和HO-1的水平減少。目前研究[11-12]表明，蛋白激酶 C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇 3 激酶(PI3K)、核因子κB(NF-κB)和腺苷活化蛋白激酶(AMPK)途徑等均參與了Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活及其依賴的基因表達(dá)調(diào)控過程。課題組前期研究表明，CD147能夠通過PI3K/AKT途徑抑制PCa細(xì)胞自噬，減少自噬性細(xì)胞死亡及促進(jìn)PCa細(xì)胞雄激素受體活性的作用[13]，因此推測CD147是否可以通過PI3K/AKT途徑參與調(diào)節(jié)PCa細(xì)胞的氧化應(yīng)激。使用PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002作用細(xì)胞，結(jié)果顯示LY294002能夠使LNCaP/shCD147細(xì)胞中Nrf2和HO-1表達(dá)進(jìn)一步降低。