慢性炎性疼痛對小鼠腸道菌群的影響

王小敏，徐 鵬，王俁棋，曾建業(yè)，周思宸，邢承志，胡翔宇，吳亞男，張昳若，范紅結(jié)

疼痛是臨床最常見的癥狀之一，炎性疼痛又是最重要的疼痛類型[1]。炎性疼痛是由創(chuàng)傷、感染等各種因素造成的炎癥所誘發(fā)的疼痛，是最常見的臨床疼痛類型，正成為全球健康問題之一。此外，疼痛敏感和消極情緒之間存在著相互促進作用，現(xiàn)有的治療方法并不能消除慢性疼痛患者的消極情緒和抱怨[2]。腸道定居著數(shù)量龐大的微生物群，是人體最復雜的“微生態(tài)系統(tǒng)”，影響著人體健康[3]。然而，至今很少有研究探討腸道菌群在慢性炎性疼痛中的作用。弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)常被用于構(gòu)建慢性炎性疼痛模型。該研究基于CFA構(gòu)建C57BL/6J小鼠慢性炎性疼痛模型，從小鼠結(jié)腸內(nèi)糞便樣本菌群的角度間接探討慢性炎性疼痛對小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組12只雌性11周齡SPF級別的C57BL/6J小鼠均購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，隨機分為對照組(Mock組)和疼痛組(CFA組)，6只/組，適應性喂養(yǎng)1周。隨后，疼痛組小鼠右后足底皮下注射50 μl的CFA(購自默克美國Sigma公司)，相應的左足作為對照；對照組小鼠右足相應部位注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.2 臨床觀察每天對小鼠的精神狀態(tài)、攝食量、飲水量、皮毛光澤度、行動活躍程度和是否出現(xiàn)跛行等進行觀察和記錄，連續(xù)觀察2周。

1.3 行為測定采用馮·弗雷方法量化小鼠對觸覺刺激的敏感性。測定之前，小鼠在高架尼龍網(wǎng)地板上適應性喂養(yǎng)30 min。在安靜的環(huán)境下，一根標準von Frey纖維被應用于一只小鼠右后足底的測試，3 s/次，重復測量3次，每次間隔至少30 s，以消除前一次刺激帶來的影響。通過評分來評估右后足對觸覺刺激的敏感性：① 無反應；② 快速收爪，但無畏縮或舔爪行為；③ 強烈的收爪，并伴有畏縮或/和舔爪行為。

1.4 樣品采集和處理實驗2周后，全部C57BL/6J小鼠經(jīng)CO2吸入麻醉后頸椎脫臼實施安樂死，解剖取結(jié)腸內(nèi)糞便約1 g，置于1.5 ml滅菌EP管中，組內(nèi)兩只小鼠的結(jié)腸內(nèi)糞便進行混樣，并置于-80 ℃冰箱保存。所有樣品干冰保存送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行16S rRNA的測序、OTU(Operational Taxonomic Unit)聚類分析、Alpha和Beta多樣性分析、菌群差異和關(guān)聯(lián)分析等。

1.5 數(shù)據(jù)分析采用Illumina MiSeq平臺對小鼠結(jié)腸內(nèi)糞便群落進行16S rRNA的測序，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過去噪過濾后，對每個樣本測序量進行統(tǒng)計分析；按照Vsearch軟件的分析流程進行OTU聚類，隨后通過與數(shù)據(jù)庫的比對，對OTU進行物種注釋；通過OTU在不同樣本中的分布，利用QIIME2軟件評估每個樣本中微生物的Alpha多樣性水平；在OTU層面，計算各樣本的距離矩陣，并通過多種非監(jiān)督的排序、聚類手段，結(jié)合相應統(tǒng)計學檢驗方法，衡量不同樣本(組)間的Beta多樣性差異及差異顯著性；結(jié)合分類學組成分析、UPGMA算法、LEfSe分析等方法，進一步衡量不同樣本(組)間的物種豐度組成差異，尋找標志物種等。

2 結(jié)果

2.1 慢性炎性疼痛模型小鼠精神狀態(tài)良好，飲食飲水正常，Mock組外觀無異常，步態(tài)平穩(wěn)；CFA組小鼠外觀無異常，患病足紅腫，活動時均有不同程度的拖足現(xiàn)象。與正常組相比，CFA組機械痛閾值顯著降低(P<0.01)，這也表明慢性炎性疼痛造模成功，CFA可明顯誘導小鼠的機械痛敏反應。

2.2 微生物OTU比較分析測序結(jié)果獲得后，按97%的相似度對所有序列進行OTU聚類，隨后用VENN圖統(tǒng)計分析兩組樣本中共有的和獨有的OTU數(shù)目。結(jié)果可知，兩組樣本一共有2 601個OTU，共有的OTU數(shù)目為335個，CFA組和Mock組分別獨有720個和1 546個。見圖1。

2.3 菌群Alpha多樣性分析Chao1、Simpson、Shannon、Pielou_e、Observed_species和Goods_coverage指數(shù)是可用于綜合評價樣本微生物群落豐富度和多樣性的參數(shù)。CFA組的Chao1、Observed_species指數(shù)低于Mock組，由此可見，Mock組的物種豐富度顯著高于CFA組；Mock組的Shannon、Simpson和Pielou_e指數(shù)高于CFA組，說明Mock組的物種多樣性和均勻度都高于CFA組；以上表明CFA導致的慢性炎性疼痛影響了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，降低了小鼠腸道菌群的菌群豐富度和多樣性。Mock組和CFA組的Goods_coverage指數(shù)相差不大且都高于99.5%，表明樣本測序覆蓋率很高，沒有被測出的概率很低，實驗數(shù)據(jù)可靠。見圖1。

圖1 慢性炎性疼痛對小鼠腸道微生物基因OTU分布的影響

2.4 菌群Beta多樣性分析由圖3可知，6個樣本共聚為兩大分支，CFA組3個樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高，共同聚集在上方。Mock組3個樣本之間微生物群落構(gòu)成相似度相對于CFA組較低，聚集在下方，其中一個樣本與其他樣本差異度略高。

圖2 慢性炎性疼痛對小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)的影響

圖3 小鼠腸道微生物群落聚類分析

2.5 菌群結(jié)構(gòu)分析兩組小鼠腸道菌群在門水平主要由5個門組成(圖4A)，即厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、TM7門(TM7)和放線菌門(Actinobacteria)。相對于Mock組，CFA組厚壁菌門(24.69%→66.86%)和TM7門(1.55%→5.47%)的相對豐度顯著升高，而擬桿菌門(45.41%→9.20%)和變形菌門(26.30%→14.98%)的相對豐度顯著降低。

在科水平上，共鑒定出114個科，兩組共享52個科。CFA組和Mock組分別有53個和9個獨有的科。由圖4B可見，兩組在科水平主要由氣球菌科(Aerococcaceae)、S24-7科(S24-7)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、乳酸桿菌科 (Lactobacillaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、F16科(F16)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)10個科組成。相對于Mock組，CFA組氣球菌科(7.31%→35.10%)、乳酸桿菌科(5.32%→23.51%)、理研菌科(2.01%→5.68%)、F16科(1.55%→5.46%)和脫硫弧菌科(0.62%→5.03%)的相對豐度均升高，S24-7科(33.66%→2.08%)、莫拉菌科(24.42%→8.77%)和瘤胃菌科(4.21%→1.28%)的相對豐度均降低，毛螺菌科(1.30%→1.40%)的相對豐度未見明顯差異。

測序結(jié)果表明，腸道微生物共由184個屬組成，其中CFA組為166個，Mock組為106個。圖4C顯示：占比最多的10個屬為氣球菌屬(Aerococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、顫螺菌屬(Oscillospira)、安德克氏菌屬(Adlercreutzia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。相對于Mock組，CFA組氣球菌屬(7.30%→34.74%)、乳酸桿菌屬(5.30%→23.51%)和脫硫弧菌屬(0.48%→4.64%)的相對豐度均升高，嗜冷桿菌屬(24.09%→8.64%)、普雷沃氏菌屬(1.01%→0.07%)、顫螺菌屬(2.35%→0.55%)和雙歧桿菌屬(1.27%→0%)的相對豐度均降低。由圖4D可知，CFA組和Mock組的優(yōu)勢菌屬及所占比例均存在較大差異，其結(jié)果與結(jié)腸內(nèi)糞便菌群在屬水平上的微生物結(jié)構(gòu)(圖4C)分析相一致。

為了通過腸道微生物組成結(jié)構(gòu)區(qū)分慢性炎性疼痛小鼠和健康小鼠，該研究通過LEfSe分析組間差異，尋找具有統(tǒng)計學差異的潛在鑒別生物標志。然而，在所有的分類水平上，即從門到屬(從內(nèi)圈到外圈)的主要分類等級上，發(fā)現(xiàn)的生物標志物較多，包括Mock組的乳球菌屬(Lactococcus)及CFA組的27個潛在生物標志物(圖5)。結(jié)合LDA閾值以及屬水平上的微生物結(jié)構(gòu)(圖4C、D)，可知，Mock組與CFA組菌群結(jié)構(gòu)差異較大，相對于CFA組，Mock組乳球菌屬的相對豐度較高，且差異顯著。

圖4 不同處理組在門水平、科水平和屬水平上的微生物結(jié)構(gòu)A:小鼠腸道微生物門水平物種組成分析圖；B:小鼠腸道微生物科水平物種組成分析圖；C:小鼠腸道微生物屬水平物種組成分析圖；D:小鼠腸道微生物屬水平熱圖

圖5 基于分類等級樹的組間差異分類單元展示圖

3 討論

慢性炎性疼痛屬于慢性疼痛范疇，通常與其他疾病同時發(fā)生，并表現(xiàn)出復雜的痛覺異常和痛覺過敏，可引起劇烈的情緒反應，一般伴有焦慮或抑郁障礙。WHO流行病學調(diào)查表明，成人慢性疼痛在全世界的平均發(fā)病率高達30%左右[4-5]。慢性疼痛伴隨負性認知及情緒，給患者本人、家庭和社會都帶來節(jié)點大小對應于該分類單元的平均相對豐度；空心節(jié)點代表組間差異不顯著的分類單元，而其它顏色的節(jié)點則表明這些分類單元體現(xiàn)出顯著的組間差異，且在該色所代表分組樣本中豐度較高；字母為標識組間存在顯著差異的分類單元的名稱了嚴重的負擔，已成為當今社會普遍關(guān)注的公共健康問題，屬于重大疾病的范疇[4-6]。

研究[7-10]表明，無論是在生理還是病理條件下，腸道微生物都是腸道和大腦之間復雜交互作用中的重要因素。不同腸道微生物成分可以影響行為和認知，神經(jīng)系統(tǒng)亦可間接影響腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)，這些研究[11]有助于建立大腦和腸道之間的對話橋梁“腸-腦軸”。目前，有研究[12-14]表明，腸道微生物菌群可能在疼痛感知和慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。該研究以臨床較為常見的慢性疼痛即慢性炎性疼痛作為切入點，利用小鼠足底注射CFA成功構(gòu)建了慢性炎性疼痛模型，應用16S rRNA測序技術(shù)對慢性炎性疼痛模型小鼠與健康小鼠的結(jié)腸內(nèi)糞便菌群進行了鑒定與分析，以間接探討慢性炎性疼痛對小鼠腸道菌群的影響，為尋找治療慢性炎性疼痛提供新思路。

該研究中兩組樣本的測序覆蓋率都高于99.5%，表明實驗數(shù)據(jù)可靠。經(jīng)菌群分析顯示，CFA組和Mock組的細菌多樣性、物種豐度和微生物群落組成各不相同，CFA組小鼠腸道菌群多樣性和均勻度均降低。由此可知，慢性炎性疼痛影響了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)、分布和數(shù)量，造成了腸道菌群平衡的紊亂。在門水平上，CFA組大大增加了厚壁菌門這一有益微生物的豐度，降低了變形菌門這一有害微生物的豐度，以增強機體自身的免疫力；但又降低了有益菌擬桿菌門的豐度，使得擬桿菌門/厚壁菌門的比值降低，同時增加了TM7菌的豐度，亦增加了疾病發(fā)生的可能性；這也說明腸道微生物菌群在機體健康中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用，其平衡和失調(diào)在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。在科水平上，共鑒定出114個科，CFA組和Mock組分別有53個和9個獨有的科；兩組在10個優(yōu)勢菌科的豐度上都存在較大的差異，其優(yōu)勢菌群氣球菌科和乳酸菌科占細菌總序列的比例亦存在較大的差異，分別占CFA組和Mock組細菌總序列的58.61%(35.10%+23.51%)和12.63%(7.31%+5.32%)。在屬水平上，相對于Mock組，CFA組的有益菌氣球菌屬、乳酸桿菌屬的相對豐度升高，由此可見，即使發(fā)生慢性炎性疼痛，小鼠菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，機體腸道菌群仍然能夠增加部分有益菌的比例，發(fā)揮著有益菌的屏障作用，抑制有害菌的增殖，維持腸道健康，延緩疾病的發(fā)生與發(fā)展；然而，部分有益菌如普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬的相對豐度均降低，雙歧桿菌屬甚至降低至無，有害菌脫硫弧菌屬相對豐度升高，這也表明，慢性炎性疼痛降低了部分有益菌的比例，且有害菌脫硫弧菌屬可能參與慢性炎性疼痛/消極情緒的發(fā)生發(fā)展。LEfSe分析篩選顯著差異性物種，結(jié)果顯示，相對于CFA組，Mock組的差異物種為具有良好改善腸道屏障功能和抵御病原微生物作用的乳球菌屬。

該研究對慢性炎性疼痛小鼠結(jié)腸內(nèi)糞便菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)組成有了一定的認識，間接反映了腸道菌群的多樣性和豐度，為今后篩選有益微生物、進一步探究通過腸道調(diào)整微生物治療慢性炎性疼痛，經(jīng)“腸-腦軸”改善病人消極情緒奠定基礎(chǔ)。