人參皂苷在治療因CLDN18-ARHGAP26表達(dá)引起的耐化療藥治療過程中的抗腫瘤作用

李 靖，謝 波，汪 虎，張晨嵩，賈建光，潘成武，馬家馳

胃癌(gastric carcinoma, GC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率排名第五，病死率排名第三[1]。雖然手術(shù)治療、放療和化療已被應(yīng)用于胃癌的治療，但胃癌患者的5年生存率仍低于30%[2]?；蛑亟M是癌癥的一個標(biāo)志，可導(dǎo)致具有致癌特性的基因融合[3]。近年來研究[4]表明，胃癌中有CLDN18-ARHGAP26融合基因。表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合期的胃癌細(xì)胞系上皮表型明顯減少，出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型，從而對目前主要的胃癌化療相關(guān)藥物耐藥。研究[5]表明，人參皂苷可以有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，在低濃度奧沙利鉑(oxaliplatin, L-OHP)細(xì)胞模型中人參皂苷可以顯著提高低濃度的奧沙利鉑對胃癌側(cè)群(side population, SP)細(xì)胞的敏感性，而在耐奧沙利鉑胃癌EMT模型中，人參皂苷可以有效逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞株EMT，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。該研究中利用人參皂苷干預(yù)探究人參皂苷在CLDN18-ARHGAP26融合突變引起的耐化療藥過程中的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料人胃癌細(xì)胞系BGC-823購自南京科佰生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購美國Hyclone公司；過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的慢病毒載體由上海吉瑪基因公司構(gòu)建；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Thermo公司；TRIzol試劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；E-Cadherin、Vimentin抗體均購自美國Abcam公司；RAPI裂解液和BCA法蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑購自美國羅氏公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液均購自美國Millipore公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Hoechst33342染液購自美國Sigma公司。BD FACSMelody細(xì)胞分選儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系BGC-823用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞長到70%～80%融合時，用0.25%胰酶-EDTA消化進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞分選選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶-EDTA消化，取適量細(xì)胞懸液收集細(xì)胞1 000 r/min，4 ℃，離心5 min，用含2%FBS的PBS液洗滌2次。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml細(xì)胞，加入終濃度為5 μg/ml Hoechst33342染液放置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱箱中孵育2 h，孵育結(jié)束后，細(xì)胞用含2%FBS的PBS清洗一次終止反應(yīng)。最后使用BD FACSMelody細(xì)胞分選儀進(jìn)行SP和NSP細(xì)胞的檢測及分選(355 nm波長紫外光激發(fā)Hoechst染色，于450 nm收集藍(lán)光熒光信號，650 nm收集紅光熒光信號)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的BGC-823NSP細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個/ml，取2 ml/孔接種于6孔板中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，第二天，用含有5 μg/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基加入適量病毒懸液替換原培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。Control組加入對照慢病毒，Lentivirus組加入過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的慢病毒。培養(yǎng)12 h后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實驗檢測步驟。

1.5 總RNA提取和qPCR將轉(zhuǎn)染CLDN18-ARHGAP26融合突變基因48 h的NSP細(xì)胞培養(yǎng)基倒掉，用無菌PBS洗滌2次，再加入1 ml的TRIzol裂解液室溫裂解5 min后轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，取200 μl三氯甲烷加入裂解液中充分混勻后靜置15 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層透明的水相并加入等體積的異丙醇后混勻，室溫靜置10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，所得到的白色沉淀即為細(xì)胞總RNA，用75%乙醇將沉淀洗2次，用適量的水將RNA溶解。用Nanodrop 2000超微量分光光度計測RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

設(shè)計合成CLDN18-ARHGAP26引物，F(xiàn)：5′-TGGG TCCAACACCAAAAACAAG-3′，R：5′-GAGTCTGTTTT CCGCCGTGT-3′；ABCG2引物，F(xiàn)：5′-TTTACGCACAG AGCAAAGCC-3′，R：5′-GTCAGCGTGGGATCCTCTT C-3′；內(nèi)參GAPDH引物，F(xiàn)：5′-TCAGCCGCATCTTC TTTTGC-3′，R：5′-ATGGTGTCTGAGCGATGTGG-3′。以cDNA作為模板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，根據(jù)設(shè)計好的引物用ABI SystemStepOnePlus進(jìn)行熒光實時定量反應(yīng)。按照兩步法擴增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s進(jìn)行40個循環(huán)的擴增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到各孔的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，采用2-ΔΔCt法分析各樣本數(shù)據(jù)。

1.6 Western blot將轉(zhuǎn)染CLDN18-ARHGAP26融合突變基因48 h的NSP細(xì)胞培養(yǎng)基倒掉，用無菌PBS洗滌2次，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。分別配制分離膠和濃縮膠，蛋白電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次8 min；二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次8 min。滴加適量ECL底物顯色劑曝光，掃描圖像，應(yīng)用Image J軟件分析掃描蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 CCK-8檢測藥物敏感性將100 μl細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板每孔5×104個細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度梯度的L-OHP(0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml)培養(yǎng)24 h，加入10 μl CCK-8溶液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，讀取490 nm處吸光度值。計算細(xì)胞活力(%)=[A(待測孔)-A(空白孔)]/[A(對照孔)-A(空白孔)]×100%

2 結(jié)果

2.1 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后ABCG2蛋白的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)分選胃癌細(xì)胞系BGC-823的SP(1.3%)和NSP(98.7%)細(xì)胞(圖1A)，將得到NSP用于本研究。以慢病毒為載體攜帶過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因于NSP細(xì)胞中，用qPCR檢測CLDN18-ARHGAP26融合突變基因和ABCG2的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的表達(dá)增加(圖1B)。細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因后ABCG2 mRNA的表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖1C)。

圖1 NSP細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的效率和ABCG2的表達(dá)A：細(xì)胞分選儀分選BGC-823細(xì)胞SP和NSP細(xì)胞；B：qPCR檢測CLDN18-ARHGAP26融合突變基因；C：ABCG2的mRNA表達(dá)；Control組：轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒；Lentivirus組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的慢病毒；與Control組比較：***P<0.001

2.2 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后E-Cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)Western bolt檢測EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，Control組細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)高于Lentivirus組細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)(t=4.372，P<0.01)，Lentivirus組細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)高于Control組(t=6.674，P<0.01)。見圖2。

圖2 過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合基因的NSP細(xì)胞發(fā)生EMTA：Western bolt檢測E-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；B：統(tǒng)計學(xué)分析E-Cadherin、Vimentin蛋白相對表達(dá)量；與Control組比較：**P<0.01

2.3 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后對L-OHP耐藥性的影響不同濃度L-OHP處理轉(zhuǎn)染慢病毒的NSP細(xì)胞24 h后，用CCK-8檢測其對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合基因細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果顯示，不同濃度L-OHP對NSP細(xì)胞增殖均有抑制作用，IC50為4.28 μg/ml。過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合基因后，L-OHP對細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，IC50為15.87 μg/ml。見圖3。

圖3 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后對L-OHP耐藥性的影響 與Control組比較：**P<0.01

2.4 人參皂苷對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞耐藥性的影響為了研究人參皂苷對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞耐藥性的影響。先用不同濃度(0、10、30、50、100 μg/ml)人參皂苷處理NSP細(xì)胞，結(jié)果顯示，50、100 μg/ml人參皂苷明顯抑制NSP細(xì)胞增殖，10 μg/ml人參皂苷對NSP細(xì)胞增殖沒有明顯作用，因此選用30 μg/ml作為人參皂苷刺激NSP的有效濃度(圖4A)。進(jìn)一步檢測30 μg/ml人參皂苷和不同濃度L-OHP對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示人參皂苷和L-OHP聯(lián)合用藥降低了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。提示人參皂苷能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因引起的對L-OHP的耐藥作用。見圖4B。

圖4 人參皂苷對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞耐藥性的影響與L-OHP組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 人參皂苷對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用Western bolt檢測人參皂苷對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，人參皂苷處理的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的E-Cadherin蛋白表達(dá)高于單純轉(zhuǎn)染組(t=18.063，P<0.01)，Vimentin蛋白的表達(dá)為(0.37±0.12)，低于單純轉(zhuǎn)染組(t=4.011，P<0.05)。見圖5。

圖5 人參皂苷對過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用A：Western bolt檢測E-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；B：統(tǒng)計學(xué)分析E-Cadherin、Vimentin蛋白相對表達(dá)量；1：Lentivirus組；2：Lentivirus+人參皂苷組；與Lentivirus組比較：**P<0.01

3 討論

有研究[6]表明100個胃癌患者中有3個CLDN18(一個使細(xì)胞間緊密結(jié)合的基因)和ARHGAP26(一個編碼RHOA抑制劑的基因)發(fā)生突變，融合形成了CLDN18-ARHGAP26，細(xì)胞和細(xì)胞及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的附著力降低，表現(xiàn)出EMT，這種突變可能導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。2018年Yang et al[7]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)了CLDN18-ARHGAP26融合突變與胃印戒細(xì)胞癌臨床診斷/預(yù)后指標(biāo)和化療耐藥顯著相關(guān)，該研究表明目前的化療方式對腫瘤中存在該融合基因的患者效果不好。該研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因，在細(xì)胞水平上探索其對腫瘤細(xì)胞耐藥性和侵襲性的影響。

有研究[8]對胃癌細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選時發(fā)現(xiàn)，不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中均有少量側(cè)群(SP)細(xì)胞，比例大約在1%～4%之間。ABCG2是與腫瘤多藥耐藥性密切相關(guān)的多藥耐藥跨膜蛋白，SP細(xì)胞表現(xiàn)出高表達(dá)ABCG2的特點，SP細(xì)胞ABCG2的表達(dá)比NSP細(xì)胞高3倍。而對于未分選細(xì)胞(SP+NSP)來說，ABCG2的表達(dá)并不高，但是在進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥后ABCG2的表達(dá)明顯升高[9]。該研究利用流式細(xì)胞分選儀分選出BGC-823細(xì)胞中的NSP細(xì)胞，顯示NSP細(xì)胞中過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因能使ABCG2表達(dá)明顯升高。

EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞喪失極性和細(xì)胞間接觸等上皮細(xì)胞樣表型，轉(zhuǎn)化成具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的過程。在肺癌細(xì)胞中，EMT的發(fā)生與腫瘤的侵襲性和耐藥性有關(guān)[10]。E-Cadherin是參與細(xì)胞之間黏附連接的主要蛋白分子，主要分布于上皮細(xì)胞中，發(fā)揮著維持細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性的功能[11]。波形蛋白(Vimentin)是間充質(zhì)細(xì)胞的主要骨架成分。因此，Vimentin常被用作EMT的細(xì)胞標(biāo)記物[12]。一般情況下，E-Cadherin蛋白表達(dá)降低和Vimentin蛋白表達(dá)增加提示發(fā)生了EMT。過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26基因的NSP細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，而Vimentin蛋白表達(dá)顯著增加，表明細(xì)胞發(fā)生了EMT。為了研究CLDN18-ARHGAP26融合突變基因?qū)Π┘?xì)胞耐藥性的影響，該研究利用化療藥L-OHP對分選的BGC-823 NSP細(xì)胞進(jìn)行耐藥測試。該研究用CCK-8檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，與對照組相比，過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26基因的NSP細(xì)胞對L-OHP產(chǎn)生了耐藥。人參的主要成分是人參皂苷，人參皂苷能通過調(diào)控NF-κB、ERK、Akt信號通路等抑制癌細(xì)胞的EMT，從而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程[13]。為探究人參皂苷干預(yù)對CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的EMT和耐藥性的影響，該研究首先確定了人參皂苷對BGC-823 NSP細(xì)胞的有效作用濃度為30 μg/ml。NSP細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒之后給予人參皂苷和L-OHP干預(yù)，只用L-OHP的細(xì)胞存活率明顯低于同時給予人參皂苷和L-OHP的細(xì)胞，提示人參皂苷能逆轉(zhuǎn)CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的耐藥。同時檢測了兩組細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，人參皂苷也能逆轉(zhuǎn)CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的EMT作用。

綜上，人參皂苷干預(yù)能逆轉(zhuǎn)CLDN18-ARHGAP26過表達(dá)引起的EMT和耐藥，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。該研究對腫瘤化療藥物的研究及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用有指導(dǎo)意義。