SHP-2抑制劑PHPS1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊作用及其機(jī)制的研究

張 雪，馬 倩，李新新，譚 鶴，朱學(xué)燦，帖彥清

易損動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerotic， AS)斑塊是導(dǎo)致心肌梗死、卒中等致死、致殘性心腦血管疾病的主要病因，又被稱為“犯罪斑塊”，所以如何穩(wěn)定易損斑塊是重要的研究方向，對(duì)減少疾病發(fā)生具有重要臨床意義。AS易損斑塊的主要病理學(xué)特征為大的壞死核心，其上覆蓋有薄的、并不連續(xù)的纖維帽，膠原成分及斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)減少，巨噬細(xì)胞成分增加[1-2]。巨噬細(xì)胞是參與斑塊形成和炎癥因子分泌的主要細(xì)胞，其可通過(guò)分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)來(lái)降解膠原，促使斑塊不穩(wěn)定性增加，極易破裂受損，其中研究較多，作用較清晰的為MMP-1、MMP-2、MMP-9等，所以抑制這些基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌可以加強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，使其不易破裂。巨噬細(xì)胞內(nèi)部有許多信號(hào)通路，通過(guò)這些信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)各種反應(yīng)，有些研究[2-4]中表明：巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)表達(dá)的主要調(diào)控途徑，ERK通路的激活是決定斑塊破裂的重要原因之一。研究[5]表明蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2(scr homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2)主要通過(guò)調(diào)控ERK的活性來(lái)影響斑塊，該研究使用SHP-2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)ApoE-/-小鼠來(lái)說(shuō)明抑制SHP-2對(duì)AS穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器16只8周齡體質(zhì)量(20±5)g SPF級(jí)ApoE-/-小鼠購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨研中心SPF級(jí)動(dòng)物房，每籠4～6只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)了醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的 3R 原則給予人道關(guān)懷；抗CD 68、抗MMP-9、抗ERK及p-ERK、山羊抗兔 IgG H&L (HRP)、山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor?488)預(yù)吸附二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司；蛋白裂解液、PMSF、蛋白酶磷酸酶抑制劑、BCA蛋白試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶公司；PHPS1及天狼星紅染液均購(gòu)自美國(guó)sigma aldrich公司；西方膳食飼料購(gòu)自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；正置顯微鏡(德國(guó)Carl zeiss公司)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.2 動(dòng)物分組及標(biāo)本取材16只6～8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為2組，8只/組。PHPS1處理組給予腹腔注射3 mg/(kg·d) PHPS1，對(duì)照組給予腹腔注射同等劑量0.9% NaCl溶液，同時(shí)喂養(yǎng)西方膳食飼料(1.25%膽固醇、7%脂肪、其余為基礎(chǔ)飼料)16周，以構(gòu)建AS模型。實(shí)驗(yàn)中期每組死亡1只小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出主動(dòng)脈根部存于福爾馬林中，固定后石蠟包埋，制備連續(xù)切片，用于Movat染色、天狼星紅染色、免疫組化和免疫熒光雙染色；整條降主動(dòng)脈浸入液氮中，研磨提取蛋白后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 Movat及天狼星紅染色每個(gè)主動(dòng)脈根部標(biāo)本切片30張，每間隔6張切片選取1張分別做Movat、天狼星紅染色。Movat染色分別經(jīng)過(guò)阿爾新藍(lán)染色細(xì)胞外基質(zhì)，乙醇氨水返藍(lán)，鐵蘇木素染色動(dòng)脈彈力板，比布列希猩紅染色血管平滑肌，乙醇藏紅花染斑塊內(nèi)膠原成分；天狼星紅染色特異性評(píng)估膠原成分，天狼猩紅-苦味酸飽和溶液染30 min, 無(wú)水乙醇分化脫水, 中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.4 免疫組化染色將石蠟切片放置于65 ℃恒溫箱中烘烤2 h，依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化后置于3%的H2O2中以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，用蒸餾水沖洗2～3次，5 min/次, 將切片放入盛有pH值6.0檸檬酸緩沖液的容器中，置于90～95 ℃的微波爐中加熱25～30 min，修復(fù)結(jié)束后取出容器，冷卻至室溫，用正常山羊血清室溫封閉孵育30 min后加入一抗CD68 (1 ∶100)孵育4 ℃過(guò)夜，第二天PBS沖洗3次，5 min/次，洗去未結(jié)合抗體的后，加入山羊抗兔 IgG H&L (HRP) 的二抗室溫孵育45 min，用PBS沖洗3次，5 min/次，然后DAB顯色、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、常規(guī)脫水、透明后中性樹(shù)膠封片，自然晾干后使用Carl zeiss顯微鏡采圖后，經(jīng)使用Image Pro Plus 6.0測(cè)算斑塊面積、分析組化染色光密度值，觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的陽(yáng)性面積。

1.5 免疫熒光染色將切片放于恒溫烤箱中烘烤2 h，依次經(jīng)梯度乙醇脫蠟后，用免疫組化筆在標(biāo)本附近畫(huà)一個(gè)圓圈，滴加3%的H2O2，室溫封閉30 min，取出切片放入TBS中沖洗3次，5 min/次，甩干切片，滴加2 % BSA 封閉液室溫封閉2 h，加入一抗CD68(1 ∶50)、MMP-9(1 ∶80)置于濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜；第二天取出濕盒，平衡至室溫，用TBS沖洗3次，5 min/次，加入山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor?488)預(yù)吸附二抗，室溫避光孵育45 min后TBS沖洗3次，5 min/次，加入DAPI封片，蓋上蓋玻片，避免氣泡，全程避光，倒置熒光顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.6 Westen blot實(shí)驗(yàn)將主動(dòng)脈蛋白提取，將主動(dòng)脈放入研磨皿中研磨，加入蛋白裂解液500 μl、5 μl PMSF、蛋白酶磷酸酶抑制劑5 μl混合物，在冰上充分研磨30 min后4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液置于1.5 ml EP管中，按照BCA蛋白試劑盒操作測(cè)定蛋白濃度，按4：1的 比例加入 5×上樣緩沖液，煮沸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?0 %聚丙烯酰胺SDS-PAGE電泳120 V，60 min，PVDF膜半干式轉(zhuǎn)膜300 mA，90 min后，封閉PVDF膜過(guò)夜，TBST緩沖液充分震蕩洗膜，一抗(ERK/p-ERK和MMP-9濃度均為1 ∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育后，TBST震蕩洗脫未結(jié)合的一抗2 h，加入二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，TBST緩沖液搖床震蕩洗膜，ECL發(fā)光液曝光。

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積大小與對(duì)照組相比，PHPS 1處理組主動(dòng)脈根部斑塊面積大小有差異(F=3.703,P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組小鼠主動(dòng)脈根部Movat染色評(píng)估斑塊 ×40與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.2 斑塊內(nèi)膠原成分結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組PHPS1斑塊內(nèi)膠原成分含量增加(F=2.702,P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 主動(dòng)脈根部切片天狼星紅染色評(píng)估膠原成分 ×40與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.3 斑塊內(nèi)容物評(píng)估對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞成分陽(yáng)性面積/斑塊面積分別為：(0.799±0.031)、(0.621±0.043)，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞陽(yáng)性面積減少(F=1.911,P<0.01)。見(jiàn)圖3；免疫熒光雙染可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組抑制了巨噬細(xì)胞(CD 68)分泌的MMP-9的表達(dá)量，MMP-9熒光強(qiáng)度減弱(F=1.117,P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖3 兩組小鼠主動(dòng)脈根部切片巨噬細(xì)胞(CD68)免疫組化染色 ×40與對(duì)照組比較：**P<0.01

圖4 免疫熒光檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈根部CD68及MMP-9的表達(dá) ×100與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.4 Western blot檢測(cè)降主動(dòng)脈內(nèi)蛋白水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)PHPS1處理后的小鼠降主動(dòng)脈內(nèi)ERK活性下降(F=1.222,P<0.01)，同時(shí)伴隨著其調(diào)控的下游MMP-9蛋白表達(dá)量也降低(F=37.49,P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)小鼠降主動(dòng)脈內(nèi)ERK/p-ERK、MMP-9蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較:**P<0.01

3 討論

蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTPase) SHP-2主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)包括ERK1和ERK 2(total ERK1/2)發(fā)揮作用，是參與AS進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白之一[4-6]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展程度取決于斑塊的大小、穩(wěn)定性，穩(wěn)定性決定了動(dòng)脈管壁的狀態(tài)，斑塊不穩(wěn)定是由于纖維帽的連續(xù)性差，厚度薄，當(dāng)血流沖擊時(shí)，易引起不穩(wěn)定的斑塊脫落，導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床后果[7-9]。斑塊的纖維帽主要是由膠原構(gòu)成的，膠原可以抵抗血流對(duì)血管壁的沖擊，也可以保護(hù)斑塊的完整性。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中，單核細(xì)胞遷移到血管內(nèi)皮，分化為易損斑塊中的巨噬細(xì)胞[10-12]，巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，可以降解不穩(wěn)定斑塊的纖維帽， MMP-9是MMPs的一種， MMP-9活性升高，可加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，加速斑塊破裂的速度，加重AS的進(jìn)展[13]。

ERK通路是參與AS進(jìn)程發(fā)展的蛋白之一，也是調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)分泌的關(guān)鍵[13]。由于SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員[14]，其主要是通過(guò)調(diào)控ERK蛋白活性而達(dá)到不同的生物學(xué)作用[3-5]。PHPS1可以特異性地結(jié)合SHP-2的生物活性區(qū)域，進(jìn)而順利打入細(xì)胞內(nèi)部，所以是理想的SHP-2抑制劑[15]。該研究以3 mg/(kg·d) PHPS1腹腔注射ApoE-/-小鼠來(lái)觀察SHP-2在AS中的作用，以斑塊大小/動(dòng)脈總面積代表動(dòng)脈的堵塞或者狹窄程度。結(jié)果表明PHPS1處理后可影響小鼠主動(dòng)脈根部斑塊的面積，斑塊面積減小。斑塊內(nèi)膠原成分的含量是評(píng)估斑塊穩(wěn)定性的重要因素之一，膠原是構(gòu)成纖維帽的主要成分，經(jīng)過(guò)天狼星紅特異性病理染色觀察斑塊內(nèi)膠原含量，顯示PHPS1組小鼠主動(dòng)脈根部切片斑塊內(nèi)纖維帽連續(xù)性較好并且厚度增加，提示PHPS1可以穩(wěn)定斑塊。AS斑塊主要由平滑肌和巨噬細(xì)胞構(gòu)成，其中斑塊內(nèi)平滑肌是分泌膠原成分的主要細(xì)胞，具有增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性的作用；而巨噬細(xì)胞是AS斑塊內(nèi)最主要的細(xì)胞成分，可以分泌多種炎癥因子和MMPs降解膠原成分，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是加速斑塊進(jìn)展、導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的主要的細(xì)胞，通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)：PHPS1組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞成分陽(yáng)性面積減少，提示PHPS1具有抑制炎癥的作用。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光雙染進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞因子MMP-9分布具有一致性，提示PHPS1可能是通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)進(jìn)而抑制了膠原的降解。進(jìn)一步，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明在經(jīng)PHPS1處理后MMP-9蛋白含量減少，并檢測(cè)降主動(dòng)脈中ERK/p-ERK的活性(磷酸化水平)，結(jié)果表明PHPS1抑制了ERK/p-ERK的磷酸化水平，提示其下游的MMP-9的表達(dá)量降低，可能是由于ERK的活性被抑制。

綜上所述，該研究表明PHPS1可以通過(guò)抑制ERK通路的蛋白活性，降低基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)，來(lái)保持斑塊纖維帽的完整，加強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，所以該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SHP-2的活化能夠?qū)е乱讚p斑塊不穩(wěn)定性增強(qiáng)。該研究表明SHP-2調(diào)控ERK/P-ERK通路而影響MMP-9的表達(dá)及活性，可為AS進(jìn)一步臨床研究提供研究方向、思路及相對(duì)客觀理論依據(jù)。