過表達(dá)miR-370調(diào)控哮喘小鼠肺損傷及其機(jī)制

任彥紅，張凌云，趙少聰，張廣超，孫曉敏

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的異質(zhì)性疾病，一般癥狀為喘息、氣促、胸悶和咳嗽等，若治療不及時(shí)會(huì)嚴(yán)重威脅患者生命安全。研究[1-2]表明，支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制是體液中輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)失衡，Th2激活B細(xì)胞并產(chǎn)生免疫球蛋白(immunoglobulins，Ig)E，IgE介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等誘發(fā)氣道炎癥。miR-370是一類由人胚胎干細(xì)胞中被克隆的microRNA，位于人類4號(hào)染色體上，長(zhǎng)度約75個(gè)堿基。研究[3]表明，miR-370在炎性疾病中表達(dá)嚴(yán)重下調(diào)，且在多種腫瘤及炎性疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如miR-370通過靶向SIRT6和調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路來(lái)加速腦缺血再灌注損傷[4]，通過抑制性別決定域Y框12(sex determining region Y，SOX12)在膀胱癌中充當(dāng)腫瘤抑制因子[5]，通過靶向Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制由氧化的低密度脂蛋白觸發(fā)的血管炎癥和氧化應(yīng)激[6]，通過靶向叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1 (forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[7]等。但miR-370在支氣管哮喘中的作用研究鮮見報(bào)道。該研究通過建立卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型，觀測(cè)過表達(dá)miR-370對(duì)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織中炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子及凋亡蛋白表達(dá)水平的影響，初步探索過表達(dá)miR-370在哮喘小鼠肺損傷中的保護(hù)作用，為支氣管哮喘的診斷和治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑40只雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，使用許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0033，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用過程中嚴(yán)格遵守3R原則，并通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)IACUC：LYZYJSXYYXY-20190201，實(shí)驗(yàn)前在恒溫25 ℃的環(huán)境中采用標(biāo)準(zhǔn)的飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由取水。OVA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；miR-NC和miR-37過表達(dá)腺病毒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；RT-PCR試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma protein 2，Bcl-2)和胱天蛋白酶3(caspase-3，cas-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。miR-370、IL-12和IL-4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。miR-370，上游序列：5′-TAGCGGGTTTTGCTAGGGC-3′，下游序列：5′-TAGCGCCTAGGGCATCGATC-3′；IL-4上游序列：5′-TACAGCCACCATGAGAAGGAC-3′，下游序列：5′-TGATCGTCTTTAGCCTTTCCA-3′；IL-12，上游序列：5′-GACCATCACTGTCAAAGAGTT TCTAGAT-3′，下游序列：5′-AGGAAAGTCTTGTTTTTGAAATTTTTTAA-3′；GADPH，上游序列：5′-CTAGAGAGCTGACAGTGGG-TAT-3′，下游序列：5′-AG ACGACCAATGCGTCCAAA-3′。

1.2 動(dòng)物分組、建模及轉(zhuǎn)染將40只雌性BALB/c小鼠(6～8周齡，體質(zhì)量15～20 g)隨機(jī)分為4組(n=10)：對(duì)照組(Control組)、模型組(OVA組)、陰性對(duì)照組(OVA+miR-NC組)、miR-370過表達(dá)組(OVA+miR-370組)。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處理，其余各組均采用致敏加激發(fā)法建立哮喘小鼠模型。致敏激發(fā)：小鼠于第1～7天腹腔注射致敏液0.1 ml/只(0.1 ml致敏液含OVA 0.1 mg，氫氧化鋁0.02 mg)；第14天將小鼠置于自制透明霧化玻璃箱中，3% OVA溶液10 ml超聲霧化吸入，30 min/d，持續(xù)6 d。當(dāng)小鼠出現(xiàn)躁動(dòng)不安、呼吸急促、頻繁點(diǎn)頭動(dòng)作、腹部抽動(dòng)加劇、頻繁揉鼻等癥狀時(shí)表示造模成功。造模成功后，OVA+miR-NC組尾靜脈注射30 μl miR-NC腺病毒，OVA+miR-370組尾靜脈注射30 μl miR-370過表達(dá)腺病毒，1次/d，持續(xù)2 d。確定干擾成功后24 h處死小鼠，收集肺組織并分離氣管，結(jié)扎左主支氣管，將氣管上部剪出一個(gè)斜切面，以0.1 mol/L PBS緩沖液反復(fù)抽吸2～3次，每次吸取0.5 ml。得到支氣管肺泡灌洗液(BALF)。4 ℃、1 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液并置于-20 ℃冰箱中保存，剩余BALF中的細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解緩沖液處理，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過顯微鏡統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)。然后將細(xì)胞涂在載玻片上，干燥，并使用瑞氏-吉姆薩染色劑染色，在高倍鏡下進(jìn)行炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.3 RT-PCR取小鼠肺組織約70 mg，超聲研磨勻漿，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，用TRIzol試劑提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件，95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、 1 min(40個(gè)循環(huán))，熔解曲線60 ℃～95 ℃，每 15 s升0.3 ℃。以目的基因和GADPH比值表示mRNA表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.4 ELISA嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行操作。ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)、IgE水平、INF-γ和IL-13蛋白表達(dá)水平。

1.5 HE染色將固定的肺組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋等處理，按試劑盒操作說(shuō)明行HE染色，顯微鏡下觀察組織切片病理形態(tài)變化。

1.6 TUNEL染色取肺組織于4%多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后脫水、浸蠟、石蠟包埋。按照TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，凋亡細(xì)胞即陽(yáng)性細(xì)胞，在光鏡下呈棕黃色或棕褐色，非凋亡細(xì)胞即陰性細(xì)胞，呈藍(lán)色。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)使用胰酶消化細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模、脫脂奶粉封閉，加入一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育搖床過夜?；厥找豢?，加入按比例稀釋HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗(1 ∶4 000)，室溫孵育120 min。采用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影(GADPH作內(nèi)參)。將膠片進(jìn)行掃描存檔，Photoshop整理去色，Alpha軟件分析吸光度，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 miR-370過表達(dá)與Control組相比，OVA組小鼠miR-370表達(dá)水平極低(F=68.25，P=0.036)；與OVA組相比，OVA+miR-NC組miR-370表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OVA+miR-370組miR-370表達(dá)水平上調(diào)(F=57.41，P=0.042)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組小鼠miR-370表達(dá)水平1：Control組；2：OVA組；3：OVA+miR-NC組；4：OVA+miR-370組；與Control組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

2.2 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)目比較與Control組相比，OVA組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)目增多(F=74.19，P=0.026)；與OVA組相比，OVA+miR-NC組炎癥細(xì)胞總數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OVA+miR-370組炎癥細(xì)胞總數(shù)目減少(F=69.57，P=0.031)。見圖2。

圖2 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)1：Control組；2：OVA組；3：OVA+miR-NC組；4：OVA+miR-370組；Total：白細(xì)胞總數(shù)；LYM：淋巴細(xì)胞；NEU：中性粒細(xì)胞；EOS：嗜酸性粒細(xì)胞；與Control組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

2.3 各組哮喘小鼠BALF IgE水平比較與Control組相比，OVA組小鼠BALF中總IgE水平和OVA特異性IgE水平均升高(F=81.42、76.33，P=0.014、0.018)；與OVA組相比，OVA+miR-NC組總IgE水平和OVA特異性IgE水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OVA+miR-370組總IgE和OVA特異性IgE水平均降低(F=65.27、61.98，P=0.039、0.041)。見圖3。

圖3 ELISA檢測(cè)各組小鼠BALF中IgE含量A：OVA特異性IgE水平；B：各組小鼠BALF中總IgE水平；1：Control組；2：OVA組；3：OVA+miR-NC組；4：OVA+miR-370組；與Control組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

2.4 各組哮喘小鼠BALF中免疫調(diào)節(jié)因子蛋白含量比較與Control組相比，模型組高表達(dá)IFN-γ和IL-13(F=69.15、61.22，P=0.031、0.037)；與OVA組相比，OVA+miR-NC組IFN-γ和IL-13含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OVA+miR-370組IFN-γ水平下調(diào)(F=58.35，P=0.042)，IL-13含量上調(diào)(F=61.42，P=0.044)。RT-PCR檢測(cè)BALF中IL-12和IL-4 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖4B所示，與Control組相比，OVA組IL-12和IL-4均高表達(dá)(F=58.11、62.47，P=0.043、0.035)；與OVA組相比，OVA+miR-NC組IL-12和IL-4表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OVA+miR-370組IL-12表達(dá)下調(diào)(F=64.33，P=0.030)，IL-4 mRNA表達(dá)上調(diào)(F=60.02，P=0.036)。見圖4。

圖4 ELISA檢測(cè)各組小鼠BALF中免疫調(diào)節(jié)因子蛋白含量A：Th1細(xì)胞因子IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-13濃度；B：IL-12和IL-4 mRNA表達(dá)水平；1：Control組；2：OVA組；3：OVA+miR-NC組；4：OVA+miR-370組；與Control組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

2.5 各組哮喘小鼠肺組織病理?yè)p傷和細(xì)胞凋亡比較HE染色和TUNEL染色觀察小鼠肺組織形態(tài)和凋亡水平變化，如圖5所示，Control組小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小無(wú)差異，黏膜和管周未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞極少(棕褐色)；與Control組相比，OVA組小鼠無(wú)完整的肺泡結(jié)構(gòu)，支氣管上皮損傷嚴(yán)重，支氣管黏膜和管周可見大量的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)出現(xiàn)大量分泌物，凋亡細(xì)胞明顯增多；與OVA組相比，OVA+miR-370組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和凋亡細(xì)胞數(shù)減少。

圖5 HE和TUNEL染色檢測(cè)各組小鼠肺組織病理?yè)p傷和凋亡情況 ×400

2.6 各組哮喘小鼠肺組織炎癥水平比較采用5分制對(duì)肺組織10個(gè)視野下的HE染色病理圖進(jìn)行炎癥評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：支氣管周圍無(wú)炎性細(xì)胞計(jì)為0分，出現(xiàn)少量的炎性細(xì)胞計(jì)為1分；在支氣管周圍環(huán)繞細(xì)胞層厚度炎性細(xì)胞1個(gè)計(jì)為2分，2～4個(gè)計(jì)為3分，≥4個(gè)計(jì)為4分。與Control組相比，OVA組小鼠肺組織炎癥評(píng)分升高(F=81.53，P=0.011)；與OVA組相比，OVA+miR-370組小鼠肺組織炎癥評(píng)分降低(F=78.34，P=0.027)。見圖6。

圖6 小鼠肺組織炎癥評(píng)分1：Control組；2：OVA組；3：OVA+miR-NC組；4：OVA+miR-370組；與Control組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

2.7 各組哮喘小鼠肺組織中凋亡蛋白表達(dá)水平比較與Control組相比，OVA組小鼠肺組織中Bax/Bcl-2和cleaved cas3/cas3蛋白表達(dá)水平上調(diào)(F=65.53、63.12，P=0.030、0.032)；與OVA組相比，OVA+miR-NC組Bax/Bcl-2和cleaved cas-3/cas3表達(dá)水平無(wú)差異，OVA+miR-370組Bax/Bcl-2和cleaved cas3/cas3蛋白表達(dá)水平下調(diào)(F=68.33、70.22，P=0.028、0.024)。見圖7。

圖7 各組小鼠肺組織中Bax/Bcl-2和cleaved cas3/cas3蛋白表達(dá)水平1：Control組；2：OVA組；3：OVA+miR-NC組；4：OVA+miR-370組；與Control組比較：*P<0.05；與OVA組比較：#P<0.05

3 討論

支氣管哮喘常伴隨呼吸困難、發(fā)作性咳嗽、胸悶等癥狀，是一種發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜的慢性呼吸道疾病，以氣道炎癥和氣道重塑為主要特征[8]。研究[9]

表明，肺組織炎癥、免疫系統(tǒng)紊亂、組織細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致支氣管哮喘的主要病理生理因素。該研究通過建立OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型，探索過表達(dá)miR-370在哮喘小鼠BALF和肺組織炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及凋亡中的調(diào)節(jié)作用。

炎癥細(xì)胞是一類參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞，包括肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等。在支氣管哮喘發(fā)生時(shí)，炎癥細(xì)胞大量分泌，加劇支氣管氣道炎癥反應(yīng)，促使支氣管哮喘與炎癥反應(yīng)雙向作用，并最終誘發(fā)重癥哮喘[10]。嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況與哮喘氣道炎癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)，嗜酸性粒細(xì)胞被激活后，一方面合成并釋放嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)、堿基蛋白和神經(jīng)毒素等損傷氣道上皮；另一方面，不斷分泌TGF-β1作用于成纖維細(xì)胞上，使氣道結(jié)構(gòu)重塑，繼而誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)[11]。Th1/Th2在哮喘中起調(diào)控作用，Th1/Th2失衡或Th2細(xì)胞因子異常升高會(huì)誘導(dǎo)哮喘發(fā)生，IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-13是Th1和Th2細(xì)胞分泌的炎癥調(diào)控因子[12]。IL-4誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)免疫球蛋白E(IgE)的合成，同時(shí)引起嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥部位聚集誘發(fā)哮喘[13]。IL12和 IFN-γ則與之相反，IL-12誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制IgE的合成，IFN-γ則抑制IL-4誘導(dǎo)的IgE合成，阻斷IgE介導(dǎo)的的哮喘發(fā)生[14]。

凋亡蛋白Bax、Bcl-2、cas-3和cas-9是凋亡發(fā)生過程中的重要調(diào)控蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，上游細(xì)胞凋亡起始蛋白cas-9與細(xì)胞色素C結(jié)合形成凋亡小體，cas-9被活化后誘導(dǎo)并激活下游細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白cas-3，凋亡蛋白cas-9和cas-3被異常激活，使得大腦組織產(chǎn)生大量的cleaved cas-3和cleaved cas-9，并進(jìn)一步執(zhí)行DNA裂解及細(xì)胞凋亡過程，加重肺組織損傷。Bcl-2則抑制細(xì)胞色素c與cas-9結(jié)合，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[15]。

該研究結(jié)果顯示，OVA組小鼠BALF中出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，IgE和OVA特異性IgE在哮喘小鼠BALF中異常升高。而過表達(dá)miR-370抑制哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞和IgE水平，同時(shí)，降低INF-γ、IL-12水平，升高IL-13、IL-4水平。因此，過表達(dá)miR-370通過降低哮喘小鼠炎癥水平緩解肺組織損傷。為進(jìn)一步明確過表達(dá)miR-370在哮喘小鼠肺組織中的保護(hù)作用，該研究通過檢測(cè)哮喘小鼠肺組織病理?yè)p傷程度及凋亡情況，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-370改善哮喘小鼠肺組織損傷程度，抑制肺組織凋亡。

綜上所述，過表達(dá)miR-370通過調(diào)控哮喘小鼠肺組織中炎癥水平、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡在哮喘小鼠肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。該研究通過動(dòng)物模型初步探索了過表達(dá)miR-370在哮喘小鼠肺損傷中的調(diào)控作用，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可對(duì)過表達(dá)miR-370調(diào)節(jié)哮喘小鼠肺組織炎癥、免疫應(yīng)答和凋亡的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為哮喘的診斷和治療提供新的思路。