單肺通氣誘發(fā)兔肺損傷時花生四烯酸代謝通路變化及丹參多酚酸鹽的干預(yù)研究

陳 華，張柏盛，龍小平

胸外科手術(shù)(如食管癌根治術(shù)、肺葉切除術(shù)等)的通氣方式通常首選單肺通氣(one lung ventilation,OLV)技術(shù)，通過隔離患側(cè)肺，從而使氣道通暢，避免發(fā)生交叉感染，同時為手術(shù)治療建立良好的操作環(huán)境[1-2]。但是此技術(shù)會增加肺內(nèi)分流與氣道阻力，危及肺泡氧合機能與肺組織順應(yīng)性，造成急性肺損傷，對患者生命與術(shù)后恢復(fù)產(chǎn)生極大危害[3-4]。

丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的一種水溶性有效成分，與傳統(tǒng)丹參注射液相比，具有療效穩(wěn)定、毒副反應(yīng)小、質(zhì)量容易監(jiān)控等優(yōu)點，臨床上主要用于冠心病的治療[5-6]。丹參多酚酸鹽對急性肺損傷有保護作用，但對OLV誘發(fā)肺損傷的保護機制尚不清楚。該研究通過建立兔OLV模型，探討丹參多酚酸鹽對其所產(chǎn)生的效用以及可能機制，為后續(xù)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物與分組24只健康雌、雄性6月齡日本白兔，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，購自廣東省醫(yī)學科學院醫(yī)學研究中心，許可證號：SCXK(粵)2015-0022。使用許可證號SYXK(湘)2017-0015。實驗動物隨機分為對照組、模型組、治療組，每組8只；對照組：行假手術(shù)，暴露氣管、左頸總動脈和右頸外靜脈，經(jīng)2～3個氣管環(huán)行氣管切開，置入氣管(內(nèi)徑2.0 mm)，雙肺通氣3 h；模型組：調(diào)整氣管導管至右主支氣管，行機械通氣2 h，OLV 3 h；治療組在OLV前給予丹參多酚酸鹽30 mg/kg靜脈滴注，其余與模型組相同。3組均采用容量通氣模式，通氣頻率40次/min，OLVVT為12 ml，F(xiàn)iO2100%。試驗結(jié)束后2 h開胸取肺組織，部分于4%多聚甲醛中固定，剩余肺組織于液氮中保存。實驗過程符合動物3R原則。

1.2 儀器與試劑丹參多酚酸鹽(上海綠谷藥業(yè))；花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和6-keto-PGF1α檢測ELISA試劑盒(上海樊克生物科技有限公司)；環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、5-脂氧化酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)、Clara細胞分泌蛋白(clara cell secretory protein, CCSP)和胞質(zhì)型磷脂酶A2(cytoplasmic phospholipase A2,C-PLA2)抗體(美國Sigma公司);逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)試劑(日本Invitrogen公司)；TRIzol 試劑盒(美國TaKaRa公司)；多功能麻醉機(美國Datex Ohmeda公司)；H500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；9600PCR 擴增儀(美國PE公司)。

1.3 肺濕/干重值(wet / dry weight, W/D值)取兔右肺下葉組織稱濕重，然后置于恒溫烤箱中(80 ℃、72 h)烘烤，至恒重后稱干重，計算肺濕/干重之比(W/D值)。

1.4 肺組織學評分取右肺組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、二甲苯脫蠟、經(jīng)各級乙醇溶液至水洗，然后HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5 透射電子顯微鏡肺組織標本用2.5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再1%四氧化鋨固定2 h，樣品在室溫下通過丙酮脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，切片，用透射電鏡檢查。

1.6 ELISA法檢測肺組織中AA、LTB4、6-keto-PGF1α和TXB2含量由于血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)和前列環(huán)素(prostacyclin 2, PGI2)組織半衰期分別為30 s、3 min，因此判斷濃度采用其穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2和6-酮-前列環(huán)素F1α(6-keto-PGF1α)值作為指標。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測兔肺中AA、6-keto-PGF1和TXB2的含量。

1.7 RT-qPCR檢測兔肺組織COX-2、5-LOX mRNA表達水平取重約50 mg肺組織，置于TRIzol中提取總RNA，并測定總RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，采用SYBR Green MasterMix試劑盒(美國Kapa公司)進行實時定量PCR實驗。β-actin作為內(nèi)參，上游引物：5′-AGAGAACACCCAA GCCACT-3′；下游引物：5′-GGCATCGGAAAGGCACA AACG-3′。5-LOX上游引物：5′-GCCGTCTATGAACA CGCGTGT-3′；下游引物：5′-GTCTCTAGATGAAGTTG G-3′。COX-2上游引物：5′-TCAGTCGATCACGAGTGA-3′；下游引物：5′-CTAATGACAAGCCAGGGA-3′。以2-ΔΔCt計算各樣品表達量的相對值，對照組相對值均設(shè)為1。

1.8 Western blot法檢測AA代謝途徑相關(guān)蛋白表達取肺組織100 mg，加1 ml組織裂解液，勻漿后經(jīng)BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加一抗、二抗孵育，用TBST漂洗10 min×3次，室溫下反應(yīng)1 h，采用ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 肺W/D值與對照組相比，模型組肺W/D值升高(P<0.05)，而治療組肺W/D值低于模型組(P<0.05)，見圖1。

圖1 兔肺W/D值與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 肺組織HE染色及評分對照組肺組織無明顯病理改變；模型組毛細血管擴張充血，肺泡腔內(nèi)有紅色滲出物，肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤；治療組部分肺泡破壞融合，肺間質(zhì)有少量紅細胞以及炎性細胞浸潤，與模型組比較有所減輕，見圖2。

圖2 3組肺組織HE染色 ×100A：對照組；B：模型組；C：治療組

2.3 透射電鏡觀察肺組織病理學改變對照組顯示肺泡Ⅰ型上皮細胞(alveolar epithelial cell I,AT-Ⅰ)損傷較輕。而模型組線粒體腫脹，多數(shù)線粒體嵴斷裂甚至消失空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴張，形成不同大小的液泡變性。治療組AT-Ⅰ超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組明顯改善，見圖3。

圖3 各組肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化 ×50 000A：對照組；B：模型組；C：治療組；黑色箭頭：線粒體；紅色箭頭：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2.4 各組肺組織中AA、LTB4、TXA2、PGI2含量比較與對照組相比，模型組或治療組肺組織中AA、LTB4、TXA2和PGI2含量上升(t=6.39、9.31、5.98、7.05，P<0.05;t=2.17、9.01、1.79、6.33，P<0.05)；與模型組相比，治療組肺組織中AA、LTB4、TXA2和PGI2含量下降(t=3.87、2.76、1.43、2.22，P<0.05)，見圖4。

圖4 各組肺組織中LTB4、TXA2、PGI2、AA含量A: LTB4含量；B: PGI2(6-k-PGF1α)含量；C: TXA2(TXB2)含量；D: AA含量；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 各組肺組織中COX-2、5-LOX mRNA表達水平與對照組相比，模型組或治療組兔肺組織中5-LOX、COX-2 mRNA表達水平上升(t=30.55、27.89，P<0.01；t=77.31、12.30，P<0.01)，而與模型組相比，治療組兔肺組織中COX-2、5-LOX mRNA表達水平下降(t=18.16、18.55，P<0.01)，見圖5。

圖5 肺組織中COX-2、5-LOX 表達A: 5-LOX mRNA相對表達；B: COX-2 mRNA相對表達；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.6 各組肺組織COX-2、5-LOX、CCSP和C-PLA2蛋白表達與對照組相比，模型組兔肺組織中COX-2、5-LOX 和C-PLA2蛋白表達上升，而CCSP蛋白表達下降；與模型組相比，治療組兔肺組織中COX-2、5-LOX 和C-PLA2蛋白表達下降，而CCSP蛋白表達上升，見圖6。

圖6 各組肺組織中COX-2、5-LOX、CCSP和C-PLA2蛋白表達

3 討論

OLV拓展了胸科手術(shù)適應(yīng)證，改善了手術(shù)條件，近年隨著胸腔鏡技術(shù)的成熟，其應(yīng)用更加廣泛。但這種通氣方式屬于非生理性通氣，會提高氣道阻力、減弱肺順應(yīng)性及肺泡局部通氣機能，術(shù)中易發(fā)生低氧血癥，使肺部缺血癥狀加劇，導致肺損傷更為嚴重[7]。

經(jīng)大量研究[5]證實，丹參多酚酸鹽具有多環(huán)節(jié)、多靶點的藥理作用特點，不僅有抗心肌缺血、保護缺血-再灌注損傷、保護心肌等作用，還有保護肝膽、改善腎功能等作用。本研究擬評價經(jīng)丹參多酚酸鹽治療后對OLV誘發(fā)肺損傷的效用及對AA代謝途徑的影響，以期為明確可能作用機制提供參考。

W/D值結(jié)果顯示：模型組W/D值高于對照組，而經(jīng)丹參多酚酸鹽治療后W/D值下降。這說明OLV會誘發(fā)肺損傷，致使W/D值上升；透射電鏡觀察顯示：對照組顯示AT-Ⅰ損傷較輕，而模型組線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴張。治療組AT-Ⅰ超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組明顯改善。這也證實OLV對肺組織產(chǎn)生損傷作用，而經(jīng)丹參多酚酸鹽治療后能明顯改善狀況，具有保護作用。

AA及其代謝物質(zhì)如白三烯類(LTs)、TXA2、前列腺素類等是具有廣泛生物學活性的重要炎性介質(zhì)，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[8-10]。對于哺乳動物而言，AA代謝途徑主要有2類[11-12]：① 脂氧化酶(LOX)途徑，大多源自5-LOX發(fā)揮致炎效能；② 環(huán)氧化酶(COX)途徑。此途徑可分泌PGE2、TXA2、PGF2與PGI2等生物活性物質(zhì)。文獻[13]報道，眾多的AA代謝產(chǎn)物中，對炎癥反應(yīng)影響最大的是PGI2，其抑制血小板聚集、舒張血管方面表現(xiàn)出強大作用；TXA2具有很強的收縮血管作用，可誘發(fā)血栓及加速血小板聚集。在LOX途徑中，5-LOX是催化AA生成LTs物質(zhì)的為主要途徑[14]。其中代謝產(chǎn)物LTB4對炎癥反應(yīng)影響較大，與多種疾病的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。ELISA檢測結(jié)果顯示模型組肺組織中AA、LTB4、PGI2、TXA2含量均高于對照組，而丹參多酚酸鹽治療后上述含量較模型組均下降。這說明OLV誘發(fā)的肺損傷會引起AA代謝途徑炎性物質(zhì)的大量生成，而丹參多酚酸鹽能起到抑制AA代謝途徑的作用。

Western blot和RT-qPCR結(jié)果顯示，模型組肺組織中5-LOX、COX-2蛋白和mRNA表達水平上升，出現(xiàn)急性肺損傷，而經(jīng)丹參多酚酸鹽治療后5-LOX、COX-2蛋白和mRNA表達下降。這提示OLV能使5-LOX 與COX-2這兩條代謝途徑活化，導致經(jīng)其產(chǎn)生的AA代謝產(chǎn)物增加，出現(xiàn)肺損傷，而丹參多酚酸鹽對5-LOX 與COX-2這兩條代謝途徑均有抑制作用，因此能夠起到減輕急性肺損傷作用；C-PLA2廣泛參與人體炎癥反應(yīng)，通過催化細胞內(nèi)膜磷脂水解，產(chǎn)生以AA為主的游離脂肪酸和溶血磷脂，因此被認作是AA類產(chǎn)物生成及其所致后續(xù)炎癥反應(yīng)中最為重要的酶。而Clara細胞分泌蛋白是Clara細胞的主要分泌產(chǎn)物，被認為是PLA2強烈的內(nèi)源性抑制劑，具有較強的抗炎作用。Western blot結(jié)果還顯示，與模型組相比，治療組肺組織C-PLA2表達下降，而CCSP表達上升。這說明丹參多酚酸鹽能夠下調(diào)C-PLA2表達，上調(diào)CCSP表達，抑制AA等炎性產(chǎn)物生成，繼而對OLV誘發(fā)的肺損傷起到保護功效。由上述結(jié)果推測，丹參多酚酸鹽可能通過抑制5-LOX，下調(diào)該途徑主要產(chǎn)物LTB4表達，從而減少TXA2生成，起到炎癥抑制作用。同時，丹參多酚酸鹽還能通過抑制COX-2表達，從而減少代謝產(chǎn)物PGI2產(chǎn)生，進而下調(diào)TXA2生成。

綜上，本研究證實OLV可激活COX和5-LOX途徑導致AA代謝增加，而丹參多酚酸鹽可能通過下調(diào)5-LOX、COX-2、C-PLA2表達，上調(diào)CCSP表達從而抑制AA代謝途徑，對OLV誘發(fā)的肺損傷產(chǎn)生保護作用。