對氯苯甲酸構(gòu)筑的銅(Ⅱ)配合物的合成、HSA結(jié)合及細(xì)胞毒性

曾振芳，袁 芳，黃秋萍，龐華鈺，楊紅蘭，黃秋嬋

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，崇左 532200)

0 引 言

銅是人體必要的微量元素，參與機(jī)體內(nèi)許多生理過程，如細(xì)胞呼吸[1]、心血管健康[2]和代謝[3]。銅金屬配合物的合成及性質(zhì)研究受到了廣大學(xué)者的關(guān)注，岳愛琴等[4]合成的兩個銅(Ⅱ)配合物對體外HeLa、HepG2和SGC7901腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖的能力。王大偉等[5]合成的2-羥基萘-1-甲醛Cu(Ⅱ)配合物對稻疫真菌具有抗菌活性。鄧燕等[6]合成槲皮苷銅配合物具有P-糖蛋白抑制作用。HSA(人血清蛋白)是人體循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的載體蛋白，它可以與許多內(nèi)因性和外因性物質(zhì)相結(jié)合，在儲存和運(yùn)輸中起著重要的作用[7]，因其易溶于水，且不易與其他物質(zhì)反應(yīng)，可以用作臨床藥物研究中的模型蛋白質(zhì)，在臨床醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)中具有重要的應(yīng)用價值[8]?？鼓[瘤藥物與蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系及其引起的蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化亦是其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究的目標(biāo)、內(nèi)容和途徑，故抗腫瘤藥物與HSA間相互作用的研究在生命科學(xué)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要理論價值[9]。為了發(fā)現(xiàn)和發(fā)展新型金屬配合物作為抗腫瘤藥物，本文合成了一個新型對氯苯甲酸構(gòu)筑的銅(Ⅱ)配合物 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)]，通過紅外、元素分析及 X-射線單晶衍射等方法對配合物進(jìn)行表征及結(jié)構(gòu)分析，并研究了配合物與HSA 的相互作用方式及配合物對胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela和肝癌細(xì)胞HepG2的抗增殖能力。

1 實 驗

1.1 主要儀器和試劑

實驗儀器：XTL-220型顯微鏡(中國上海天省)，Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer)，HERA cell CO2型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)，Smart ApexII CCD X 型X-射線單晶衍射儀(德國 Bruker)，Multiskan Spectrum型酶標(biāo)儀(美國Thermo)，RF-5301 PC型熒光分光光度計(日本島津)，VarioEL Ⅲ元素分析儀(德國艾樂曼)，常數(shù)毛細(xì)管黏度計(中國上海申誼)，UV-8000型紫外可見分光光度計(中國上海元析儀器)。

實驗試劑：對氯苯甲酸(上海阿拉丁生化科技)，三水合硝酸銅(天津市光復(fù)科技)，甲醇(成都市科龍化工試劑廠)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，武漢市恒沃科技)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone)，F(xiàn)12K培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，CCK-8試劑(Biosharp)，0.25% 胰酶溶液(索來寶)，人正常肝細(xì)胞LO2、胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela和肝癌細(xì)胞HepG2(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，順鉑(上海麥克林生化科技)，人血清蛋白(HSA，Sigma)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，武市恒沃科技)。緩沖溶液是pH值為7.2的Tris-HCl/NaCl溶液，緩沖溶液和人血清蛋白(HSA)溶液根據(jù)文獻(xiàn)[10]配制。

1.2 配合物 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 的合成

稱取對氯苯甲酸0.047 0 g (0.3 mmol)、1-10-菲羅啉0.018 1 g (0.1 mmol)和三水硝酸銅0.024 2 g (0.1 mmol)，分別置于三個50.0 mL的燒杯中，各加5.0 mL甲醇將固體溶解，攪拌，將對氯苯甲酸溶液和1,10菲羅啉溶液分別滴至三水硝酸銅溶液中，滴加完畢，常溫下攪拌30 min，保鮮膜封口，10 d后析出淡藍(lán)色塊狀晶體，過濾后50 ℃下烘干。[Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 的分子式為C26H18Cl2CuN2O5，相對分子質(zhì)量MW=572.86。元素分析理論值(%)：C 54.51, H 3.17, N 4.89；實驗值(%)：C 54.38, H 3.12, N 4.78。IR(ν/cm-1): 3 414, 1 593, 1 388, 1 089, 1 017, 831, 776, 721, 533。

1.3 配合物的晶體結(jié)構(gòu)測定

選擇合適大小為0.26 mm×0.24 mm×0.18 mm的晶體置于CCD X 射線面探衍射儀上，衍射光源為石墨單色化的Mo-Kα(λ=0.071 073 nm)，溫度為300.75 K，數(shù)據(jù)收集角度范圍為2.053°<θ<29.340°，衍射區(qū)為(-10≤h≤10,-12≤k≤14,-19≤l≤20)，收集15 983個衍射點(diǎn)，其中獨(dú)立衍射點(diǎn)有5 207個。結(jié)構(gòu)分析工作采用OLEX2和SHEXTL-97軟件完成。由理論加氫法確定氫原子的坐標(biāo)，對氫原子和非氫原子分別采用各向同性和各向異性溫度因子進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正。配合物的晶體學(xué)、主要鍵長與鍵角分別列于表1、表2。CCDC:2104589。R(int)=0.034 0，R1=0.035 9，wR2=0.089 1。

表1 配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of the complex

表2 配合物的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths and bond angles of the complex

1.4 配合物與HSA相互作用

1.4.1 紫外-可見吸收光譜

在樣品池和空白池中分別加入2.5 mL 緩沖溶液校準(zhǔn)基線，將樣品池的緩沖溶液換成5 μmol·L-1的HSA溶液，并在250～300 nm的波長下掃描。用移液槍加入50 μL的配合物溶液(50 μmol·L-1)，吹打混勻。室溫下放置5 min后，在同樣波長范圍內(nèi)掃描，共加7次配合物溶液。

1.4.2 熒光光譜

向樣品池中加入2.5 mL的 5.0 μmol·L-1HSA溶液，最優(yōu)激發(fā)波長為300 nm，在波長為320～365 nm下掃描。用移液槍加入30 μL的配合物溶液(50 μmol·L-1)，吹打混勻，室溫下放置5 min后，在同樣波長范圍內(nèi)掃描，共加4次配合物溶液。

1.5 細(xì)胞毒性

將LO2、HepG2、HeLa和A549細(xì)胞消化，配制成濃度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(每孔5×103個細(xì)胞)，將細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)，使用培養(yǎng)液(90%培養(yǎng)液+10%胎牛血清)配制不同濃度配合物溶液，每孔加入100 μL配合物溶液，每種濃度重復(fù)3次，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄上清液，培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，CCK-8染色，λ=450 nm下用酶標(biāo)儀測定OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物晶體結(jié)構(gòu)解析

配合物部分鍵長、鍵角列于表2，分子晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2 配合物與HSA的相互作用

2.2.1 紫外-可見吸收光譜

HSA與的配合物結(jié)合產(chǎn)生的紫外吸收光譜如圖2所示。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)α-螺旋化，HSA在273 nm處產(chǎn)生特征吸收峰。隨著配合物濃度增大，273 nm處的吸收峰發(fā)生減色效應(yīng)，表明配合物與HSA發(fā)生了相互作用[11]。

2.2.2 熒光光譜分析

HSA內(nèi)部含有氨基酸殘基，能吸收紫外線而發(fā)射內(nèi)源性熒光。由圖3可以看出，HSA強(qiáng)吸收峰在336 nm處，隨配合物濃度增高，熒光強(qiáng)度由96.89%降低至78.49%，這是由于配合物對HAS發(fā)生熒光猝滅作用。蛋白質(zhì)的熒光猝滅可分為兩種，一是動態(tài)猝滅，為電子轉(zhuǎn)移過程。二是靜態(tài)猝滅，因結(jié)合而導(dǎo)致熒光猝滅[12]。判斷熒光猝滅是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，可以用Stern-Volmer方程：F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C][9]，式中F和F0分別為加入和不加入配合物時EB-CT-DNA的熒光強(qiáng)度，Kq為分子猝滅過程的速率常數(shù)，Ksv為猝滅常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，[C]為猝滅劑的濃度?？汕蟮肒sv=2.35×105L·mol-1，猝滅速率常數(shù)Kq=Ksv×108=2.35×1013L·mol-1·s-1，顯然配合物對HSA的猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)大于藥物小分子與生物大分子之間的最大擴(kuò)散的碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·S-1[13]，表明配合物對HSA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅。對靜態(tài)猝滅，以lg[(F0-F)/F]對lg[C]作圖(見圖4)，計算得到配合物與HSA的結(jié)合常數(shù)Ka=2.14×1013L·mol-1，結(jié)合位點(diǎn)n=2.37，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)比較大[14-16]，說明所合成配合物和HSA的結(jié)合能力較強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞毒性

配合物 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 對胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela、肝癌細(xì)胞HepG2和肝細(xì)胞LO2作用48 h后細(xì)胞的IC50值見表3，由表3可知，配合物對四種細(xì)胞都具有抗增殖作用，相同條件下，配合物對三種癌細(xì)胞的抗增殖效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于配體pcba，抗癌效果沒有順鉑好，對四種細(xì)胞的毒性作用順序為LO2>A549>HepG2>HeLa。本文合成的 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 細(xì)胞毒性不如文獻(xiàn)[10]報道的配合物1細(xì)胞毒性效果好，[Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 的結(jié)構(gòu)單元中含有兩個對氯苯甲酸根，文獻(xiàn)[10]報道的配合物1結(jié)構(gòu)單元中含有四個4-氯3-硝基苯甲酸，可能是結(jié)構(gòu)單元中氯原子和硝基的數(shù)量導(dǎo)致細(xì)胞毒性差異。

表3 配合物的對LO2、A549、HeLa和HepG2細(xì)胞的毒性Table 3 IC50 of the complex against LO2, A549, HeLa, and HepG2 cell

3 結(jié) 論