鹽堿脅迫對藥用植物羊蹄三種藥用成分的影響

李江楠，尤健，蔣章，趙偉，陳霞※

（1.吉林大學(xué)中草藥育種與栽培國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130112）

植物在受到環(huán)境脅迫時，往往通過自身產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物來抵御外界環(huán)境脅迫，以保證植物的生長發(fā)育。這些次生代謝產(chǎn)物通常也是藥用植物的主要藥用成分。環(huán)境脅迫對植物次生代謝產(chǎn)物合成的影響主要包括生物脅迫與非生物脅迫，其中非生物脅迫，如光照、水分和土壤等都是影響植物次生代謝產(chǎn)物合成、積累的重要因素，也是影響藥用植物藥用成分含量的重要因子。土壤鹽堿化是植物面臨鹽堿脅迫、制約植物生長的主要非生物脅迫之一[1]。有研究顯示，世界上有接近20%的土地受到鹽堿化的影響[2,3]，到2025年，超過50%的土地會發(fā)生不同程度的鹽堿化，嚴(yán)重威脅到作物的生產(chǎn)與土地利用[4]。我國的鹽堿地面積超過3000萬hm2，集中分布在西北、東北三省和華北等地，嚴(yán)重制約了種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5,6]。

我國土地資源緊缺，鹽堿土地的改良與利用已經(jīng)成為緩解土壤資源緊缺、擴(kuò)大種植規(guī)模的重要方式。近年來，我國在鹽堿地土壤改良技術(shù)方面取得了大量成果，但限于地域、資源和改良成本等因素的制約，很多鹽堿地的改良仍然難以大面積實(shí)現(xiàn)[1]，而利用成本低廉、產(chǎn)出較高的植物資源尤其是經(jīng)濟(jì)價值較高的藥用植物對鹽堿土地進(jìn)行生物改良，是快速解決土壤鹽堿化和實(shí)現(xiàn)鹽堿土資源化利用的一種有效措施。因此，研究篩選合適于鹽堿地種植的作物種質(zhì)，對鹽堿地的改良和種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

羊蹄（Rumex japonicas Houtt.）又名土大黃、牛耳大黃，為蓼科（Polygonaceae）酸模屬（Rumex）多年生草本植物，主要分布于我國的東北、華北、華東、華中、華南、四川及貴州，朝鮮、日本和俄羅斯（遠(yuǎn)東）也有分布[7]。羊蹄為傳統(tǒng)藥用植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱通便、涼血止血和殺蟲止癢等功效，常用于鼻出血、血小板減少性紫癜、慢性肝炎及痔瘡、皮癬等癥[8]。羊蹄以根入藥，其作為藥用成分的主要次生代謝物質(zhì)有大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等[9-11]。目前國內(nèi)外關(guān)于羊蹄化學(xué)成分提取、含量測定[10-13]以及藥理[14-16]研究較多，也有部分學(xué)者針對不同土壤[17]、銅脅迫[18]下羊蹄藥用成分的變化進(jìn)行了研究。然而，關(guān)于鹽堿脅迫對羊蹄主要藥用成分的研究尚缺乏研究。大黃素、大黃酚和大黃素甲醚屬于蒽醌類次生代謝產(chǎn)物[9]，而蒽醌類化合物不僅具有極高的藥用價值，也有助于植物抵御逆境脅迫，如紫外線輻射[19]和食草昆蟲啃食等[20]。此外，一些酸模屬植物在鹽堿地生長良好，如雜交酸模[21]等。本研究以酸模屬藥用植物羊蹄為研究對象，旨在探討鹽堿脅迫下3種藥用次生代謝產(chǎn)物的變化，為在鹽堿地種植羊蹄、豐富鹽堿地植物種植品種提供參考。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用羊蹄種子于2015年9月采自吉林大學(xué)校園，經(jīng)吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院關(guān)樹文教授鑒定為蓼科酸模屬植物羊蹄（Rumex japonicas Houtt.）。

1.2 主要試劑

乙醇（北京化工廠），色譜甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），碳酸鈣（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），大黃素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：D-029-150707）、大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品（批號：D-017-160219）、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品（批號：D-004-170113），均購于成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

ME型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，752紫外可見分光光度計（上海光譜儀有限公司），Eppendorf移液槍（德國Eppendorf公司），HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），DL6000B型低速冷凍離心機(jī)（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)有限公司），超聲儀KQ-250DE型（昆山市超聲儀器有限公司），高效液相色譜儀（Acchrom），﹣80℃超低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)），828型臺面式pH測試儀（上海理達(dá)）。

2 方法

2.1 鹽堿脅迫處理

選擇飽滿的羊蹄種子，浸種后，以洗凈并經(jīng)高壓滅菌的細(xì)沙（過20目篩）為培養(yǎng)基質(zhì)，種植于直徑為30cm的塑料花盆中，每隔2 d用Hoagland營養(yǎng)液澆灌1次，待幼苗長至2片真葉時，開始鹽堿脅迫處理。

鹽堿脅迫溶液均采用Hoagland營養(yǎng)液配制。鹽脅迫采用NaCl和Na2SO4（NaCl和Na2SO4比為9:1），濃度梯度分別為20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L、160 mmol/L和200 mmol/L；堿脅迫采用Na2CO3和NaHCO3（Na2CO3和NaHCO3比為9：1），濃度梯度分別為10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L和160 mmol/L。

按照隨機(jī)區(qū)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)布置，共分為11個處理，其中1個不添加鹽堿，作為對照。每個處理重復(fù)3次。每隔2 d按照所設(shè)計的鹽堿濃度進(jìn)行鹽堿脅迫處理，連續(xù)進(jìn)行5次。

2.2 樣品處理

于第5次鹽堿脅迫處理完成間隔2 d后開始采樣。樣品采集時莖葉和根分開保存，洗凈后裝袋放入烘箱，105℃殺青20 min，轉(zhuǎn)80℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩，待用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取羊蹄根部樣品和莖葉樣品粉末各50 mg，分別置于2 mL離心管中，加入2 mL色譜甲醇，稱重；60℃下超聲提取1 h，取出稱重；加入色譜甲醇補(bǔ)充溶液損失質(zhì)量，搖勻。吸取上清液，經(jīng)0.22m濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取用五氧化二磷干燥后的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品，以色譜甲醇為溶劑各配制成濃度為1.0 mg/mL、0.4 mg/mL和0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取大黃素、大黃酚及大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)液100L、200L、200L，混合后以0.1%磷酸溶液定容至1 mL，混勻，即得到大黃素0.1 mg/mL、大黃酚0.08 mg/mL及大黃素甲醚0.05 mg/mL的混合對照品溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱為華譜C18色譜柱（250mm 4.6mm，5m）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0~5min，55%A；5~15 min，65%A；15~30 min，70%A；30~40 min，92%A；40~45min，92%A）；流速1.0mL/min；柱溫35℃；檢測波長254 nm。在此條件下，羊蹄樣品中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚3種藥用成分色譜峰分離良好，見圖1。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.2 精密度試驗(yàn) 在2.5色譜條件下，取大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對照品溶液連續(xù)測定6次，進(jìn)樣量為20L，分別測定其峰面積。大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h，按2.5色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積RSD＜2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批樣品適量，按2.3的方法制備供試品溶液，共6份，再按2.5色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD＜2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2010軟件計算樣品3種藥用成分含量，Origin 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖形化處理，采用中藥指紋相似度評價軟件（2004A）[22]對羊蹄鹽堿脅迫樣品的中藥指紋進(jìn)行比較分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 鹽堿脅迫對羊蹄根部3種藥用成分含量的影響

在不同濃度鹽堿脅迫下羊蹄地下根部大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量均發(fā)生了不同改變，結(jié)果見圖2。圖2統(tǒng)計結(jié)果顯示，在以NaCl和Na2SO4比為9:1的不同濃度鹽脅迫處理條件下，隨著鹽濃度的升高，大黃素在鹽濃度為200 mmol/L時含量顯著高于無鹽脅迫的對照處理；大黃酚含量在20~200 mmol/L鹽脅迫下先出現(xiàn)含量顯著降低，隨后逐漸上升，在200 mmol/L時達(dá)到最大；大黃素甲醚含量則是下降后升高，再下降，最后在200 mmol/L時含量達(dá)到最大。在以Na2CO3和NaHCO3比為9:1的不同濃度堿脅迫處理時，大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均表現(xiàn)為在低濃度10 mmol/L時含量顯著下降、在20 mmol/L時含量顯著上升及在40 mmol/L時含量開始顯著下降的特點(diǎn)，當(dāng)堿濃度達(dá)到80 mmol/L時，羊蹄植株即出現(xiàn)死亡。以上結(jié)果說明鹽堿脅迫均能刺激羊蹄根部大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的產(chǎn)生，3種藥用成分的含量也都能顯著提升。鹽脅迫和堿脅迫相比較，羊蹄對鹽脅迫的耐受范圍更寬一些，而堿脅迫刺激的耐受性相對較低。

圖2 鹽堿脅迫對羊蹄根部大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的影響Fig.2 Effects of the saline-alkali stress on the contents of emodin，chrysophanol and rheochrysidin in the root of Rumex japonicas

3.2 鹽堿脅迫下羊蹄莖葉3種藥用成分含量比較

許多以根及根莖入藥的植物，其莖葉里面也往往含有一定量的藥用成分，本研究同時測定了鹽堿脅迫下羊蹄莖葉3種藥用成分的含量，結(jié)果見圖3。通過圖3分析可以看出，當(dāng)鹽脅迫為40 mmol/L時莖葉大黃素含量相對較高，但顯著低于對照處理，堿脅迫濃度為10 mmol/L時莖葉大黃素含量最高，但依然顯著低于對照處理。莖葉大黃酚含量在鹽脅迫濃度為160 mmol/L和堿脅迫濃度為20mmol/L時分別達(dá)到最高，均顯著高于對照處理。莖葉大黃素甲醚的含量在鹽脅迫處理后均高于對照處理，在鹽脅迫濃度160mmol/L時達(dá)到最高，在200 mmol/L時出現(xiàn)下降；堿脅迫處理后僅在10 mmol/L處理下顯示出明顯高于對照的含量，其他處理則顯著低于未處理的對照組。以上結(jié)果說明鹽堿處理后同樣會刺激羊蹄地上莖葉大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的產(chǎn)生，大黃酚和大黃素甲醚顯示出與根部相似的趨勢。

圖3 鹽堿脅迫對羊蹄莖葉大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的影響Fig.3 Effects of the saline-alkali stress on the contents of emodin，chrysophanol and rheochrysidin in the stem and leaf of Rumex japonicas

3.3 鹽堿脅迫下羊蹄根部和莖葉3種藥用成分分布

羊蹄的根和莖葉均含有一定量的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，進(jìn)一步分析了鹽堿脅迫處理羊蹄地下根部與地上莖葉含量比例組成，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，在未施加鹽堿脅迫時，即鹽堿處理濃度為0 mmol/L時，大黃素在莖葉中含量比例比較高，達(dá)到了72%，大黃酚和大黃素甲醚均在根部中含量比例比較高，分別達(dá)到88%和77%。當(dāng)加以鹽堿脅迫處理時3種成分在根和莖葉中的分布比例發(fā)生了明顯改變，大黃素以鹽脅迫處理200 mmol/L和堿脅迫處理40 mmol/L時根中含量比例最大，分別為47%和57%；大黃酚與大黃素同樣在鹽脅迫處理200 mmol/L和堿脅迫處理40mmol/L時根中含量比例最大，均超過了90%；大黃素甲醚以鹽脅迫處理200 mmol/L和堿脅迫處理20 mmol/L時最大，分別為79%和85%。這種分布比例的變化可能是由于羊蹄植株直接處于鹽堿脅迫環(huán)境之中，使地上部莖葉形成的部分次生代產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至根部所致。

圖4 鹽堿脅迫下大黃素、大黃酚和大黃素甲醚在羊蹄植株地上和地下的分布Fig.4 Aboveground and underground distributions of emodin chrysophanol and rheochrysidin in Rumex japonicas under the salinealkali stress

3.4 鹽脅迫和堿脅迫對羊蹄3種藥用成分含量的差異比較

鹽脅迫和堿脅迫處理均能夠顯著影響羊蹄植株3種藥用成分的含量，進(jìn)一步比較了兩種脅迫類型最佳脅迫濃度下羊蹄3種藥用成分含量的影響效果，結(jié)果見圖5。由圖5分析可以看出，羊蹄根部大黃素、大黃酚和大黃素甲醚在堿脅迫處理下顯著高于鹽脅迫處理，而莖葉則為鹽脅迫處理顯著高于堿脅迫處理。由此可見，羊蹄不同藥用部位對鹽脅迫和堿脅迫的響應(yīng)是不同的，根部對堿脅迫響應(yīng)更為強(qiáng)烈，莖葉則對鹽脅迫響應(yīng)較為強(qiáng)烈。

圖5 鹽脅迫和堿脅迫下羊蹄大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量比較Fig.5 Comparisons of the contents of emodin，chrysophanol and rheochrysidin of Rumex japonicas under the salt and alkali stress

3.5 鹽堿脅迫下羊蹄次生代謝指紋變化

中藥化學(xué)指紋可以較為全面地反應(yīng)中藥成分的組成變化，本研究進(jìn)一步采用中藥指紋相似度評價軟件（2004A），對不同濃度鹽堿脅迫下的羊蹄樣品進(jìn)行了中藥指紋圖譜比對分析，以盡可能全面地評價鹽堿脅迫對藥用植物羊蹄有效成分的影響。

3.5.1 相似度評價將計算的不同羊蹄樣品之間相似度結(jié)果以氣泡圖的形式進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖6。圖6中氣泡的直徑大小和顏色深淺代表了樣品之間相似度的高低，可以看出，無論是在鹽脅迫還是堿脅迫處理下，地下根部與地上莖葉之間的相似度存在一定差異，說明不同藥用部位在化學(xué)組成上存在一定的差異。鹽脅迫處理與堿脅迫處理之間，無論是在根部樣品還是莖葉樣品也都存在一定差異。在所有樣品中莖葉樣品在鹽脅迫處理160 mmol/L和200 mmol/L、堿脅迫處理20 mmol/L和40 mmol/L時均表現(xiàn)出與其他樣品極為顯著的相似度差異。

圖6 不同鹽堿脅迫處理羊蹄相似度比較Fig.6 Comparisons of the similarity of Rumex japonicas under the different saline-alkali stress

3.5.2 聚類分析基于中藥指紋圖譜分析軟件獲得的指紋峰匹配數(shù)據(jù)，采用層次聚類分析法對羊蹄不同鹽堿脅迫處理樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖7。聚類分析展示了羊蹄在鹽堿脅迫處理下代謝成分組成變化關(guān)系，通過圖7可以看出，鹽脅迫處理下羊蹄各樣本與未處理對照樣品（R-0 mmol/L和SL-0 mmol/L）關(guān)系較近，隨著鹽濃度的升高關(guān)系漸遠(yuǎn)；堿脅迫處理與對照樣本距離明顯大于鹽處理，且莖葉在20 mmol/L和40 mmol/L堿脅迫處理時獨(dú)自聚為一支，明顯區(qū)別于其他樣品，說明堿脅迫處理對羊蹄次生代謝產(chǎn)物形成影響更為顯著。

圖7 不同鹽堿脅迫處理羊蹄樣本聚類分析樹狀圖Fig.7 The dendrogram of the cluster analysis of Rumex japonicas samples under the different salt-alkali stress

4 討論

2020年11月17日國務(wù)院辦公廳發(fā)布了《國務(wù)院辦公廳關(guān)于防止耕地“非糧化”穩(wěn)定糧食生產(chǎn)的意見》，防止耕地“非糧化”是我國保護(hù)耕地、擴(kuò)大糧食生產(chǎn)、保障糧食安全的重要舉措。長期以來，中藥材種植存在與糧食生產(chǎn)爭地的矛盾，隨著近年來中藥材種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，這一矛盾日益凸顯，而耕地“非糧化”意見的出臺意味著中藥材種植可利用土地資源必然減少，開發(fā)新的土地資源以保證中藥材生產(chǎn)的穩(wěn)定就成為中草藥種植亟待解決的突出問題。我國是世界第三大鹽堿地分布地區(qū)[23]，主要分布在東北、華北、華東和西北四大區(qū)域，總面積約1億hm2[24]。因此，充分利用鹽堿地種植中草藥成為解決與糧爭地這一矛盾的有效途徑。此外，作為中藥材生產(chǎn)的藥用植物含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝產(chǎn)物是植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的重要因素，因此，中草藥品種在鹽堿地種植也存在很大的可能性。

本實(shí)驗(yàn)研究了鹽堿脅迫對藥用植物羊蹄3種藥用成分大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的影響，研究結(jié)果證實(shí)羊蹄不僅能夠在一定的鹽堿濃度下存活，其根部和地上莖葉藥用成分的含量在合適的鹽堿濃度下均顯著增加，鹽脅迫對地上莖葉的影響大于堿脅迫，堿脅迫對根部的影響大于鹽脅迫。周子曄等[17]研究了酸性土壤和堿性土壤環(huán)境對羊蹄大黃素含量的影響，結(jié)果顯示在堿性土壤條件下羊蹄根部和地上莖葉大黃素含量均低于酸性土壤條件。我們的研究結(jié)果顯示在較高堿脅迫濃度下，羊蹄根部大黃素含量會有一個顯著升高，莖葉大黃素含量在鹽堿脅迫下含量會下降，羊蹄根部大黃素含量與前人報道有所不同，這可能與羊蹄生長的堿脅迫環(huán)境差異有關(guān)，我們同樣觀察到了在低濃度堿脅迫條件下根部大黃素含量的下降。對于羊蹄大黃酚、大黃素甲醚在鹽堿環(huán)境下的含量變化尚未見報道。此外，本實(shí)驗(yàn)利用中藥指紋圖譜從多個次生代謝產(chǎn)物評價了鹽堿脅迫對羊蹄根部、莖葉整個中藥指紋的影響，發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫下羊蹄中藥指紋圖譜有一定的變化，堿脅迫的影響更為明顯一些，這種中藥指紋上的變化是否會對其藥效產(chǎn)生影響，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過多成分、多角度初次探索了藥用植物羊蹄在鹽堿地種植的可能，初步評價了鹽堿環(huán)境種植羊蹄藥用成分的變化，研究結(jié)果為篩選更多適合鹽堿地種植的藥用植物種類提供了參考，也為改變藥糧爭地的矛盾提出了新的解決思路。