溫度響應(yīng)性水凝膠的制備及其對姜黃素的控制釋放研究*

魏蕾 焦韻蘋 李娜 李陽

(1.西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710061；2.陜西省第二人民醫(yī)院，陜西 西安 710005)

皮膚損傷是人類生活中最常見的損傷類型。在傷口愈合過程中，炎癥往往會阻礙傷口的愈合，并且傷口部位產(chǎn)生的過多的過氧自由基也不利于傷口的修復(fù)[1]。姜黃素是姜黃中提取的天然小分子活性物質(zhì)，具有很多優(yōu)良的特性，姜黃素具有極佳的抗炎、抗氧化作用，在傷口修復(fù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[2-4]。然而，姜黃素自身較差的水溶性限制了它的應(yīng)用。如何有效地解決姜黃素的分散問題成為了一個(gè)亟待解決的難題。

疏水相互作用是通過疏水物的疏水基與水相互排斥而發(fā)生的一種作用，利用兩親性分子的疏水高分子鏈段與姜黃素發(fā)生疏水相互作用有望解決其分散的難題[5]。Pluronic F-127(PF-127)作為一種兩親性三嵌段共聚物，可在水中自組裝成具有疏水空腔，親水外壁的膠束，其疏水空腔對負(fù)載疏水類藥物效率極高[6-7]。此外，其自組裝特性能夠?yàn)樗z網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建帶來極大的貢獻(xiàn)。PNIPAM是一種具有溫度響應(yīng)的高分子材料，將其引入可以實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放[2，8-11]。在PF-127中引入雙鍵形成PF127-DA，通過BIS作為交聯(lián)劑，在APS引發(fā)與TEMED的催化下，PF127-DA與PNIPAM共價(jià)交聯(lián)形成第一重網(wǎng)絡(luò)[6，12]。

葡聚糖是一種高分子多糖，其本身具有良好的生物相容性，可降解性，可吸收等特點(diǎn)，常被用來做藥物載體[13]。此外葡聚糖還具有促進(jìn)吸收，粘膜粘附性以及易功能化等特點(diǎn)，作為藥物載體具有很大的優(yōu)勢[14]。

本文構(gòu)建了PNIPAM與PF127的共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，搭配葡聚糖分子鏈構(gòu)成半互穿雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，姜黃素通過疏水作用被負(fù)載于其中。實(shí)驗(yàn)采用紅外光譜證明了水凝膠的成功制備，通過溶脹實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡觀察等表征溫度響應(yīng)性能，通過不同溫度下藥物釋放實(shí)驗(yàn)來表征溫度響應(yīng)性藥物緩釋性能。實(shí)驗(yàn)證明該水凝膠具備良好的溫度響應(yīng)性藥物緩釋功能，在載藥水凝膠領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[15]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 6700傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet)；Lambda 35紫外分光光度儀(PerkinElmer)；QUTAN-feg250場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI)。

1.2試藥 葡聚糖(VETEC)；Pluronic F-127(SIGMA)； N-異丙基丙酰胺(TCI)；NIPAM；丙烯酰氯(SIGMA)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 圖1為水凝膠合成示意圖，首先在PF-127上引入雙鍵，以BIS作為交聯(lián)劑，通過APS引發(fā)、TEMED催化，使NIPAM聚合以及交聯(lián)PF-127。凝膠中葡聚糖組分通過連纏繞的方式與PNIPAM作用，形成了最終的半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。

圖1 水凝膠合成示意圖

2.2實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1PF127-DA的合成 將2.54 g(0.2 mmoL)的PF-127與0.061 g(0.6 mmoL)的三乙胺溶解在20 mL無水二氯甲烷中冰浴鼓泡攪拌15 min。將0.05 mL的丙烯酰氯在氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢加入其中，室溫反應(yīng)24 h。將合成的產(chǎn)物旋蒸、透析、凍干即得到PF127-DA[16]。

2.2.2水凝膠的制備 水凝膠以一鍋法制備，將NIPAM、PF127-DA、葡聚糖及BIS分散于10 mL離心管中，加入 APS引發(fā)、TEMED催化下，室溫放置5 min成膠。其中水凝膠的加料量為100 mg，BIS的加入量為NIPAM的5%，APS加入量為1.5 mg，其余加料量如表1所示。

表1 水凝膠加料比例表(%)

2.2.3載姜黃素水凝膠的制備 稱量2 mg姜黃素固體至1 mL凝膠前體溶液中，使用渦旋機(jī)混勻，加入APS與TEMED靜置5 min即可成膠。

2.2.4紅外光譜的測定 將制備的水凝膠凍干后，研磨成粉末分散在溴化鉀中，壓片后進(jìn)行紅外光譜測定。

2.2.5溶脹的測定 將樣品分別置于50 mL離心管加磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered salline,PBS)20 mL，分別放至25 ℃與37 ℃恒溫箱中，每隔固定時(shí)間測定水凝膠質(zhì)量，直至溶脹平衡[17]。其中溶脹率的計(jì)算公式為：

2.2.6場發(fā)射掃描電鏡的拍攝 將溶脹后的水凝膠用液氮迅速冷凍后凍干，制樣并噴金。置于場發(fā)射掃描電鏡10 kV，400倍下進(jìn)行形貌觀察，分別拍攝各水凝膠形貌。

2.2.7姜黃素釋放的測定 將3號載姜黃素水凝膠浸泡于5 mL PBS中，分別置于25 ℃與37 ℃恒溫?fù)u床中，每隔固定時(shí)間移取1 mL液體并補(bǔ)加1 mL PBS，使用紫外分光光度法測量浸出液中姜黃素的含量，直至釋放完全。

3 結(jié)果分析

3.1紅外光譜分析 如圖2為葡聚糖、NIPAM、與3號水凝膠的紅外光譜圖。從圖中可以看出在1680 cm-1處NIPAM有一峰為碳碳雙鍵吸收峰，而該峰在水凝膠中消失證明了NIPAM的聚合與PF-127的連接。水凝膠1230 cm-1處與3350 cm-1的峰則證明葡聚糖的存在。通過紅外譜圖的分析，證明了水凝膠的成功制備。

圖2 紅外光譜圖

3.2溶脹實(shí)驗(yàn) 如圖3為水凝膠的溶脹結(jié)果圖，由圖可以看出無論是在25 ℃還是在37 ℃，隨著NIPAM含量的逐漸增加，水凝膠的溶脹逐漸降低，這是因?yàn)樵黾覰IPAM的含量會使水凝膠的結(jié)構(gòu)變得更加致密，孔隙變小，從而不利于水凝膠的溶脹。并且，整體上來看37 ℃下水凝膠的溶脹率比25 ℃下更低，這是因?yàn)镹IPAM具有溫度響應(yīng)性能，在溫度高于35 ℃時(shí)會收縮排水，使得水凝膠的整體體積減小，降低了凝膠的溶脹。

圖3 溶脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3掃描電鏡圖 如圖4為不同NIPAM含量的水凝膠在25 ℃與37 ℃溶脹后的電鏡拍攝圖片，可以看出隨著NIPAM含量的增加，水凝膠的孔徑逐漸減小，90%NIPAM組的孔徑最小結(jié)構(gòu)最致密，也驗(yàn)證了溶脹結(jié)果的分析結(jié)論。整體而言，37 ℃下水凝膠的孔徑相較于25 ℃明顯減小，這也證明了制備的水凝膠具有優(yōu)異的溫度響應(yīng)性能。

圖4 水凝膠SEM圖(比例尺200 μm)

3.4藥物釋放 如圖5為水凝膠預(yù)聚溶液中分散的姜黃素與水溶液中分散的姜黃素效果對比圖。由圖可以看出，相比于水，預(yù)聚液可以很好地分散姜黃素。

圖5 姜黃素增容效果圖

如圖6為姜黃素的釋放曲線，可以看出在最初的50 h內(nèi)，姜黃素的釋放速度較快，隨著時(shí)間的增加，在120 h左右達(dá)到最大釋放量，且會持續(xù)釋放200 h以上。并且，水凝膠37 ℃下的姜黃素釋放量為22.7%，25 ℃下為18.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了該水凝膠具有良好的藥物緩釋性能及溫度響應(yīng)釋放性能。

圖6 姜黃素釋放曲線

4 結(jié)論

本課題針對姜黃素分散性差，生物利用度低的難題，設(shè)計(jì)了一種姜黃素負(fù)載的基于葡聚糖與PNIPAM和PF-127共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的溫度響應(yīng)性半互穿網(wǎng)絡(luò)藥物緩釋水凝膠。水凝膠中兩親性的PF-127膠束可以利用疏水相互作用通過其疏水腔來負(fù)載藥物[18]，而PNIPAM作為一種熱敏性分子在溫度高于32 ℃時(shí)，其分子鏈會收縮從而將凝膠中的藥物“擠出”，實(shí)現(xiàn)溫度響應(yīng)釋放[19]。通過水凝膠載藥的方式，不僅大大增加了姜黃素在水中分散性，而且在水凝膠的溫度響應(yīng)性以及緩釋性使得姜黃素可以在傷口部位持續(xù)作用，從而有利于傷口的修復(fù)[20]。該方法相較于傳統(tǒng)的方法大大增加了姜黃素的分散性與生物利用度。實(shí)驗(yàn)中，通過紅外光譜證明了水凝膠的成功制備；在溶脹實(shí)驗(yàn)中，通過模擬室溫(25 ℃)與體溫(37 ℃)下水凝膠的溶脹行為驗(yàn)證了該水凝膠在人體環(huán)境下的溫度響應(yīng)性溶脹。此外對該水凝膠進(jìn)行的場發(fā)射掃描電鏡觀察結(jié)果顯示其具有相對均勻且規(guī)律明顯的孔結(jié)構(gòu)。在藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，該水凝膠也表現(xiàn)出了良好的溫度響應(yīng)性藥物釋放性能。綜上，我們成功的制備了一種水凝膠，該水凝膠具有良好的溫度響應(yīng)性能，溶脹性能，均勻的孔結(jié)構(gòu)以及良好的藥物緩釋功能，在溫度響應(yīng)藥物釋放領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。