LED紅光對人根尖乳頭干細胞增殖和成骨分化的影響

牙源性干細胞是目前的研究熱點，目前已經(jīng)被分離和鑒定的人類牙源性干細胞有5 種

。根尖乳頭干細胞（human stem cells from apical papilla，hSCAPs）是由Sonoyama 等從成年人的牙齒中分離出來的一組具有干細胞特性的細胞群，具備多向分化能力

。hSCAPs 較其他牙源性干細胞具備更強的自我更新和分化能力

，其增殖和分化可以促進牙根發(fā)育。hSCAPs 是干細胞治療中潛在的細胞來源

。

兩個相鄰小鎮(zhèn)一天死了4個人，人們議論紛紛。參與救援瑪麗的消防員菲利普和朋友理查德在閑談時，偶然提到瑪麗死前吃過泰諾速效膠囊，理查德不經(jīng)意地說：“也許亞當(dāng)一家也是吃泰諾死的？”

光生物調(diào)節(jié)（photobiomodulation，PBM）是通過低能量激光或發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）照射來調(diào)節(jié)生物組織功能，可以有效減少炎癥

、促進傷口愈合

、增強細胞活力

、促進細胞增殖和成骨分化能力

。LED 紅光是指波長在620～720 nm 范圍內(nèi)的不相干光源，穿透力強，可以達到組織深層。LED 紅光較激光具有儀器便于攜帶、經(jīng)濟、安全的特點

，能促進干細胞增殖和成骨分化

。LED紅光對牙源性干細胞生物學(xué)特性的影響機制尚不明確。因此本實驗選擇hSCAPs 為研究對象，探討LED 紅光照射對其增殖和成骨分化的影響。

為便于比較，采用單項污染物指數(shù)法，按城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(GB18918—2002)中一級標(biāo)準中A標(biāo)準進行污染分析[9].計算公式為：

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

CCK-8 試劑盒（Dojindo，日本），低糖DMEM（Hyclone 公司，美國），青霉素-鏈霉素（Bioder 公司，中國），胎牛血清（四季青，中國），Dispase II 分散酶（Yeasen，美國），PBS磷酸鹽緩沖液干粉、胰蛋白酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、1% Triton-X100、茜素紅染色液、氯化十六烷吡啶（Sloarbio 公司，中國），抗CD24、抗CD34、抗CD45、抗CD90、抗CD146（Ebioscience，美國），I 型膠原酶、多聚甲醛（Biosharp 公司，中國），堿性磷酸酶顯色試劑（生工公司，中國），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime公司，中國），堿性磷酸酶測定試劑盒（南京建成，中國），TRIpure Total RNA Extraction Reagent、EntiLink

1st Strand cDNA Synthesis Kit、EnTurbo

SYBR Green PCR SuperMix（ELK Biotechnology，中國）。

在光照后第7 天，5 J/cm

組較對照組上調(diào)hSCAPs 中成骨相關(guān)基因ALP（

＝784.697，

＜0.001），OCN（

＝3 563.798，

＜0.001），OPN（

＝511.775，

＜0.001），BSP（

＝150.117，

＜0.001）和Runx2（

＝713.872，

＜0.001）的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。光照后第14 天，5 J/cm

組上調(diào)hSCAPs 中成骨相關(guān)基因ALP（

＝601.905，

＜0.001）、OCN（

＝779.152，

＜0.001）、OPN（

＝1120.033，

＜0.001）、BSP（

＝1736.171，

＜0.001）和Runx2（

＝206.170，

＜0.001）的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖6。

分別統(tǒng)計兩版教材“平方根”“無理數(shù)的引入”兩塊內(nèi)容中的例習(xí)題數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)：美GMH版的例習(xí)題數(shù)量遠多于浙教版，大約是浙教版的1.5倍.而且美GMH版在每一道例題后都會相應(yīng)安排同一類型的習(xí)題，方便學(xué)生及時鞏固.

1.2 hSCAPs 的分離培養(yǎng)和鑒定

5 d 后可見細胞從組織塊邊緣爬出，貼壁生長，呈長梭形，見圖1a。培養(yǎng)約20 d，可見細胞趨于融合，見圖1b；成骨誘導(dǎo)3 周后，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)沉積，見圖1c；成脂誘導(dǎo)3 周后，油紅O 染色可見著色的脂滴，見圖1d。流式細胞鑒定結(jié)果：第3 代hSCAPs 的干細胞表面標(biāo)志物CD24、CD90、CD146 表達呈陽性，造血干細胞表面標(biāo)志物CD34、CD45 呈陰性，表明獲得的細胞屬于間充質(zhì)干細胞譜系，見圖2。

1.3 實驗分組及干預(yù)

根據(jù)CCK-8 檢測的結(jié)果繪制每組hSCAPs 的生長曲線，見圖3a。與對照組相比，在光照后第1、3、5、7 和9 天，實驗組均顯著促進hSCAPs 的增殖。光照后第1 天（1 J/cm

組

對照組，

＝0.002；3 J/cm

組

對照組，

＝0.001；5、7 J/cm

組

對照組，

＜0.001）、第7 天（

＝51.110，

＜0.001）、第9 天（

＝83.743，

＜0.001），各光照組的細胞增殖能力均強于對照組。光照后第3 天，3、5、7 J/cm

組的細胞增殖率明顯高于對照組（

＝106.942，

＜0.001）。光照后第5 天，僅5 J/cm

組顯示出更強的細胞增殖能力（

＝18.199，

＜0.001）。此外，在各檢測時間點的光照組之間，hSCAPs 的細胞增殖率也有差異，見圖3b。

1.4 CCK-8 檢測LED 紅光對hSCAPs 增殖的影響

取第4 代hSCAPs 接種于96 孔板，密度為2 ×10

/孔，每組設(shè)置5 個副孔，加入含10%FBS 的低糖DMEM 培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO

條件下孵育。次日換液后分組進行光照。分別在光照后的第1、3、5、7、9天進行CCK-8 檢測。去原培養(yǎng)液，加入CCK-8 混合液，孵育1 h，酶標(biāo)儀（450 nm）檢測吸光度值。根據(jù)用每個時間點的平均吸光度繪制細胞生長曲線。

1.5 ALP 染色和ALP 定量檢測hSCAPs 成骨分化

取第4 代hSCAPs 接種于3.5 cm 細胞培養(yǎng)皿中，加入含10% FBS 的低糖DMEM 培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO

孵育，2 d 后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。分組進行光照。培養(yǎng)至第7、14 天時，去上清液，PBS 清洗3 遍，多聚甲醛固定30 min。PBS 清洗2 遍，根據(jù)ALP 顯色試劑說明書配置染液，染色15 min。在倒置顯微鏡下觀察細胞。

hSCAPs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7、14 天時，胰蛋白酶消化，1% TritonX-100 裂解細胞40 min。使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定裂解物中總蛋白質(zhì)濃度、ALP 測定試劑盒測定樣本細胞內(nèi)ALP 活性，計算ALP 相對活性。

1.6 茜素紅定量檢測hSCAPs 成骨礦化

hSCAPs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至第21 天時，去除上清液，PBS 清洗3 遍，多聚甲醛固定30 min。PBS 清洗2 遍，1%茜素紅染色5 min。超純水清洗2 遍，加入氯化十六烷基吡啶溶液，室溫避光靜置30 min。將溶解后的上清液分別置于96 孔板中，每組設(shè)置5 個副孔，酶標(biāo)儀（562 nm）檢測吸光度值。

1.7 RT-PCR 檢測hSCAPs 中成骨相關(guān)基因的表達

選擇5 J/cm

LED 紅光照射條件作為RT-PCR的實驗組。hSCAPs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7、14 天時，使用TRIpure Total RNA Extraction Reagent 試劑盒進行總RNA 提取。使用EntiLink

1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行第一鏈cDNA 的合成。以GAPDH 為內(nèi)參照，使用EnTurbo

SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒進行實時聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）分析各組細胞中成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）的表達水平，每個樣品均設(shè)置3 個復(fù)孔。目的基因的相對表達量通過2

方法計算得出。相關(guān)基因的引物序列見表1。

1.8 Western blot 檢測hSCAPs 中成骨相關(guān)蛋白的表達

3、注意：家長一定要在旁邊觀察寶寶的反應(yīng)，并且多用言語鼓勵寶寶看鏡子和拿玩具，還可以利用鏡子的反射和寶寶做鬼臉、對話。建議大家從寶寶2個月左右大的時候開始做這個親子游戲，每周安排至少2次這樣的訓(xùn)練。玩具最好能經(jīng)常換一換，增加寶寶的新鮮感。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果進行方差齊性檢驗，Shapiro-Wilk 法進行正態(tài)性檢驗，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析進行多組間的比較，LSD法進行不同組間樣本均數(shù)的兩兩比較。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，

＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

④明確規(guī)定供水企業(yè)、用水戶、管水部門的權(quán)利、義務(wù)以及相關(guān)法律責(zé)任，使供、用、管水三方能夠從各自角度出發(fā)自覺執(zhí)行計劃用水管理辦法。

2 結(jié) 果

2.1 hSCAPs 的分離培養(yǎng)和鑒定

本實驗已取得西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準（批號：20180314001）。根尖乳頭組織來源于西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科?；颊咭蛘璋纬淖枭谌パ溃@得患者及家屬知情同意后立即放入PBS 中備用。待生物安全柜消毒完畢后，用含有20%、3%青霉素-鏈霉素雙抗的PBS 反復(fù)沖洗凈組織表面殘留物，將組織剪碎，加入Ⅰ型膠原酶（3 g/L）和Dispase 酶（4 g/L），待組織塊消化至絮狀后加入等量完全培養(yǎng)基中止反應(yīng)，將組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10% FBS的低糖DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO

條件下培養(yǎng)，每隔3 d 換液，細胞長滿瓶底后傳代。取第3 代SCAPs，經(jīng)成骨誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)3 周后，去除上清液，PBS 清洗3 遍，多聚甲醛固定30 min。PBS清洗2 遍，進行茜素紅染色及油紅O 染色。取第3代SCAPs，PBS 重懸，分別加入抗人CD24、CD34、CD45、CD90、CD146 抗體，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物。

2.2 CCK-8 檢測LED 紅光對SCAPs 增殖的影響

本研究采用的LED 紅光光源功率輸出穩(wěn)定、連續(xù)，波長在600～700 nm 之間。光源與細胞之間的距離為2 cm。在這些條件下，測得光源的功率密度約為66.7 mW/cm

。根據(jù)公式：輻射曝光量（radiant exposure，J/cm

）＝功率密度（power density，W/cm

）×?xí)r間（irradiation time，s）計算可得，LED 紅光照射15、45、75、105 s 時，輻射曝光量分別為1、3、5、7 J/cm

。將細胞分為0 J/cm

組（對照組），1 J/cm

組，3 J/cm

組、5 J/cm

組和7 J/cm

組，每48 h 對細胞進行一次照射。所有細胞均在暗室中進行照射，照射的第一天設(shè)為光照后第0 天。

2.3 ALP 染色和ALP 定量檢測LED 紅光對hSCAPs成骨分化的影響

LED 紅光照射后第7 天和第14 天，ALP 染色結(jié)果顯示光照組較對照組著色較明顯，且5 J/cm

組著色最深；同時，光照后第14 天各組較第7 天染色深，見圖4a。ALP 活性檢測結(jié)果顯示在光照后第7天和第14 天，光照組ALP 活性高于對照組；光照后第7 天，3、5 和7 J/cm

組促進hSCAPs 的ALP 活性（

＝9.380，3 J/cm

組

對照組，

＝0.006；5 J/cm

組

對照組，

＜0.001；7 J/cm

組

對照組，

＝0.008）；在各光照組之間，5 J/cm

組ALP 活性最高（5 J/cm

組

1 J/cm

組，

＝0.002；5 J/cm

組

3 J/cm

組，

＝0.043；5 J/cm

組

7 J/cm

組，

＝0.032）；光照后第14 天，僅3 J/cm

和5 J/cm

組促進hSCAPs 的ALP 活性（

＝36.867，3 J/cm

組

對照組，

＝0.035；5 J/cm

組

對照組，

＜0.001），5 J/cm

組較其他光照組顯著提高ALP 活性（

＜0.001）；同時，光照后第14 天各組都顯示出比第7天更高的ALP 水平，見圖4b。

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7、14 天時，收集對照組和5 J/cm

組細胞，使用RIPA 總蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定裂解物中總蛋白質(zhì)濃度，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后，加入封閉液室溫封閉1 h，孵育一抗，二抗，增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）方法進行顯影。

2.4 茜素紅定量檢測LED 紅光對hSCAPs 礦化的影響

Western blot 結(jié)果顯示，5 J/cm

組在第7 天ALP（

＝172.997，

＜0.001）、OCN（

＝465.951，

＜0.001）、OPN（

＝207.232，

＜0.001）、BSP（

＝209.934，

＜0.001）和 Runx2（

＝585.258，

＜0.001）蛋白的表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。5 J/cm

組在第14 天上調(diào)ALP（

＝110.244，

＜0.001）、OCN（

＝182.052，

＜0.001）、OPN（

＝38.148，

＝0.003）、BSP（

＝65.461，

＝0.001）和Runx2（

＝79.046，

＝0.001）蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖7。

2.5 RT-PCR 檢測LED 紅光對hSCAPs 成骨相關(guān)基因表達水平的影響

生物安全柜（BSC-1000ⅡA2，蘇州凈化設(shè)備廠，中國），低速離心機（KDC-1044，中佳，中國），CO

孵箱（CCL-170B-8，Esco Micro Pte. Ltd.，新加坡），流式細胞儀（FACSAria，BD，美國），倒置相差熒光顯微鏡（IX2-ILL100，Olympus，日本），LED 紅光燈（T6，芮森，中國），高精度光功率計（Field-MaxII-TO，Coherent，美國），酶標(biāo)儀（Synergy

HTX，BioTek，美國），PCR 儀（Veriti 96-Well Thermal Cycler，Thermofisher，新加坡），熒光定量PCR 儀（CFX Connect

，Bio-Rad，美國），蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（DYY-6C，北京市六一儀器廠，中國）。

2.6 Western blot 檢測LED 紅光對hSCAPs 成骨相關(guān)蛋白表達水平的影響

茜素紅染色結(jié)果見圖5a。茜素紅定量檢測結(jié)果（

＝8.763）為僅5 J/cm

組促進hSCAPs 的礦化（

＜0.001），且5 J/cm

組的礦化結(jié)節(jié)表達量高于1 J/cm

、3 J/cm

和7 J/cm

組（5 J/cm

組

1 J/cm

組，

＝0.002；5 J/cm

組

3 J/cm

組、

＝0.004；5 J/cm

組

7 J/cm

組，

＝0.001）。用1、3、5和7 J/cm

LED紅光照射后，各光照組礦化結(jié)節(jié)表達量分別相當(dāng)于對照組的104%、105%、118%和102%，見圖5b。

3 討 論

間充質(zhì)干細胞因其強大的自我更新和分化能力，成為再生療法中日益重要的細胞來源

。hSCAPs 具有類似于神經(jīng)嵴細胞的增殖和分化特征，免疫原性低，有助于組織再生和修復(fù)

。年輕恒牙疾病在保守治療后可能出現(xiàn)牙髓壞死和根尖周病變，但其牙根仍能繼續(xù)發(fā)育，表明hSCAPs 可能在牙髓壞死過程中存活，促進牙根的繼續(xù)發(fā)育

。一定條件下hSCAPs 可以分化形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體

、牙周組織

和骨組織

。因此，hSCAPs不僅具有發(fā)育成生物根的潛力，促進牙根繼續(xù)發(fā)育，在牙周軟硬組織再生中也能發(fā)揮作用，可以應(yīng)用于組織工程和干細胞治療研究。

近五年，所讀之書多與小學(xué)語文和教育關(guān)聯(lián)不大，是跳出語文、跳出教育的閱讀。在這些閱讀中，中國文化讓我感到特別親切，因為它比較貼近我們的生活，尤其是巴蜀文化及巴蜀名士的書籍，司馬相如、揚雄、三蘇、魏了翁、劉沅、唐甄、賀麟等，更讓我著迷。為了讓學(xué)生們了解并熱愛地方文化，我們結(jié)合小學(xué)語文教學(xué)研究的情況，在“兒童視野下的小學(xué)語文教學(xué)研究”的基礎(chǔ)上，提出了小學(xué)“三味”語文教學(xué)的主張，即小學(xué)語文教學(xué)要具有兒童味、語文味和地方味，并在一些學(xué)校開展了一系列探索和實踐，取得了比較好的效果。

LED 紅光已被證明具有多種生物調(diào)節(jié)作用，如減輕炎癥和促進傷口愈合

，具有價格低廉、使用壽命長、電路實現(xiàn)簡單、應(yīng)用安全等優(yōu)點，儀器便于攜帶，可以作為在家中進行光動力治療的工具

，可以通過多種方式影響不同干細胞的增殖和成骨分化

?，F(xiàn)階段LED 紅光對牙源性干細胞增殖和成骨分化的影響逐漸引起關(guān)注，但其對hSCAPs 生物學(xué)特性的影響研究較少。Horvát-Karajz等

發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)光照后的光生物學(xué)效應(yīng)可以持續(xù)48 h。Marques 等

發(fā)現(xiàn)1.2～7.5 J/cm

的紅光能對干細胞的細胞存活率和增殖產(chǎn)生積極效應(yīng)。同時本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)1、3、5 J/cm

的LED 紅光對牙源性間充質(zhì)干細胞有積極作用

。故本實驗選擇1、3、5、7 J/cm

LED 紅光，每48 h 對細胞進行一次照射，探討LED 紅光對hSCAPs 增殖及成骨分化的影響，以期為光生物療法在牙組織工程中的應(yīng)用篩選適宜的光學(xué)參數(shù)，為hSCAPs 作為牙再生種子細胞提供實驗數(shù)據(jù)。

Hamblin 等

認為光生物調(diào)節(jié)作用存在雙相劑量反應(yīng)，即低劑量光照具有促進作用，高劑量光照產(chǎn)生抑制作用，可能是細胞色素C 氧化酶光受體吸收LED 紅光后被激活，提供更高速率的氫質(zhì)子泵入線粒體，產(chǎn)生能量，并催化產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）促進細胞增殖。Ferreira 等

報道5 J/cm

紅光促進牙髓干細胞增殖，Marques等

發(fā)現(xiàn)5 J/cm

紅光照射乳牙牙髓干細胞的存活率和增殖率較高，Yamauchi 等

發(fā)現(xiàn)8 J/cm

對PDLSCs 增殖促進效果最顯著。本實驗中，增殖實驗結(jié)果也顯示LED 紅光在hSCAPs 增殖早中晚期均有不同程度的促進作用，5 J/cm

紅光照射對hSCAPs 的促進作用最顯著，提示LED 紅光照射對不同干細胞產(chǎn)生的光生物學(xué)效應(yīng)有微小差異。

本實驗發(fā)現(xiàn)在成骨誘導(dǎo)條件下，LED 紅光促進hSCAPs 的成骨分化及鈣結(jié)節(jié)的形成，其中5 J/cm

組在第7、14 和21 天均有良好的促進作用，表明5 J/cm

LED 紅光可以在hSCAPs 早中晚期成骨中均發(fā)揮有利作用。根據(jù)以上結(jié)果，筆者選擇5 J/cm

組與對照組進行PCR 和western blot 實驗探討相關(guān)機制。ALP 和Runx2 是成骨分化早期的標(biāo)志

，OCN 在成骨細胞分化晚期表達

。OPN 的表達與骨形成/吸收相關(guān)，是成骨分化中晚期的標(biāo)志

。BSP 在骨形成開始時、成骨分化后期和礦化早期表達

。結(jié)果顯示5 J/cm

LED 紅光能上調(diào)ALP、Runx2、OCN、OPN、BSP 基因和蛋白的表達，進一步提示LED 紅光促進SCAPs 成骨分化。Li 等

報道LED 紅光促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，Ruan 等

發(fā)現(xiàn)LED 紅光具有促進人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用，與本研究結(jié)果一致。但Pagin 等

提出LED 紅光不影響前成骨細胞MC3T3細胞的分化，這可能與LED 紅光照射曝光量等光學(xué)參數(shù)不一致有關(guān)，也可能與LED 紅光選擇性促進干細胞成骨分化有關(guān)。

綜上所述，本實驗探討LED 紅光對hSCAPs 增殖和成骨分化的量效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在模擬成骨誘導(dǎo)環(huán)境中，LED 紅光促進hSCAPs 體外增殖和成骨分化，其中5 J/cm

的光照效果最顯著，為促進hSCAPs和光生物調(diào)節(jié)療法在組織工程和干細胞治療中的應(yīng)用提供了新的研究基礎(chǔ)。

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Su YT performed the experiments and wrote the article. Hou L， Jiang B， Zheng GZ， Liu Y and Wang Y performed the experiments and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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