不同溫度對人體髂靜脈保存效果的影響

任章勇，呂少誠，王芳菲，趙昕，郎韌，賀強

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 肝膽外科，北京 100020

近年來隨著血管外科技術(shù)及器官移植技術(shù)的發(fā)展，血管重建技術(shù)廣泛應(yīng)用于血管外科、腫瘤外科、移植外科等的手術(shù)中[1-4]，臨床上對血管移植物的需求越來越大。盡管各類生物工程類血管移植物陸續(xù)推出，同種異體血管依然是成本低廉、組織相容性好、近遠(yuǎn)期通暢率高的常用血管移植物。深低溫冷凍保存(frozen storage，F(xiàn)S)是離體血管組織最常用的保存方式，據(jù)報道可保持細(xì)胞活性長達(dá)數(shù)年之久[5-6]，但該保存方案需要昂貴的保存設(shè)備以及煩瑣的降溫和復(fù)溫步驟，在臨床中的應(yīng)用遭到一定程度的限制。低溫冷藏保存(cold storage，CS) 方案是目前臨床醫(yī)療實踐中離體血管組織常用的短期保存方式，但其安全使用時限及其對離體血管結(jié)構(gòu)和功能的影響尚缺乏系統(tǒng)性的研究。本研究在血管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性、抗張力性能等方面評估不同保存溫度對離體人髂靜脈的影響。

材料與方法

1 實驗材料 血管來源于12 例成年腦死亡器官捐獻(xiàn)者的共24 條髂靜脈。本研究已取得捐贈者家屬的同意，并獲得北京朝陽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號：2021-科-16)。本研究中所有程序均按照機構(gòu)研究委員會的倫理標(biāo)準(zhǔn)和1964 年赫爾辛基宣言進行。

2 實驗儀器 透射電子顯微鏡(日本，HITACHI)，光學(xué)顯微鏡(日本，Olympus)，-80℃冰箱(美國，ThermoFisher)，立式冷藏柜(青島海爾特種電冰柜有限公司)，液氮存儲罐(美國，ThermoFisher)，HLD 手搖式螺旋機架(樂清市艾德堡儀器有限公司)；HP-50N 高精度數(shù)顯拉力計(樂清市艾德堡儀器有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國，ThermoFisher)。

3 實驗試劑 UW液[University of Wisconsin solution，百時美施貴寶(中國) 投資有限公司]；199 培養(yǎng)基(美國，Sigma)；青霉素-鏈霉素雙抗液(美國，ThermoFisher)。

4 血管獲取、分組及保存液配制 血管來源于成年腦死亡器官捐獻(xiàn)者，選取雙側(cè)髂靜脈，用0.9%氯化鈉注射液沖去血漬，去除血管周圍脂肪等組織，修剪為長1.2～ 1.5 cm 的血管段并通過簡單隨機法隨機分為冷藏(CS)組、冷凍(FS)組和新鮮對照(fresh control，F(xiàn)C)組；分別設(shè)置保存1 d、3 d、5 d、1 周、2 周、4 周共6 個檢測時間點；每組于每個檢測時間點均設(shè)置10 個樣本。FC 組只參與第1 次檢測，不參與保存過程。

CS 組的保存液組成(1 L)為青霉素&鏈霉素雙抗液1 000 U、無菌0.9% 氯化鈉注射液500 mL、Medium199 培養(yǎng)液500 mL。取40 mL 上述保存液于50 mL 無菌離心管中，每個凍存管保存5 段血管，封口膜封口后置于4℃冰箱中保存。保存時間大于1 周的標(biāo)本每隔1 周更換1 次保存液。

FS 組的保存液組成(1 L)為青霉素&鏈霉素雙抗液1 000 U、無菌0.9% 氯化鈉注射液450 mL、Medium199 培養(yǎng)液450 mL、DMSO 100 mL(保存方式及保存液組成參照歐洲同種異體移植物保存庫的建議[5])。取4 mL 上述保存液于5 mL 無菌凍存管中，每個凍存管保存1 段血管，封口膜封口后置于-80℃冰箱中的程序性降溫盒中進行梯度降溫，降溫速率為1℃/min，2 h 后取出迅速轉(zhuǎn)移至-186℃的液氮儲存罐中保存。待檢測時將凍存管取出，置于37℃水浴中復(fù)溫15 min，然后用37℃0.9%氯化鈉注射液沖洗3遍，去除血管組織中的DMSO 后送檢。

5 血管細(xì)胞活性檢測 取一段新鮮血管，失活處理作為空白對照。將各組血管段剪碎為1～ 2 mm的組織碎片，加入12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再向培養(yǎng)孔加入2 mL 新鮮配置的MTT 液(1 mg/mL)，于37℃的溫箱中孵育1 h，棄去培養(yǎng)孔中的MTT液，加入1 mL DMSO，室溫下震蕩15 min，洗脫細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色結(jié)晶，多功能酶標(biāo)儀于570 nm 下讀取各組血管洗脫液的吸光值(Di)和空白對照組吸光值(D0)；稱取各組血管段的重量(mi)；結(jié)果以單位重量的吸光值表示：MTT(OD/m)=(Dx-D0)/mi。

6 血管極限應(yīng)力測試 用4-0 Prolene 線于血管段兩端“8”字縫合牽引線，將兩端的牽引絲線分別系在拉力測試臺的兩個夾具上，緩慢搖動手柄增加張力，直至絲線從血管上拉下，記錄此時的最大拉力Fmax。

7 血管組織病理檢測 各組標(biāo)本取出后，經(jīng)10%中性甲醛固定、脫水、包埋和切片后，分別行HE 染色、Masson 染色及EVG 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察血管段內(nèi)膜、膠原纖維和彈性纖維的變性情況。

8 血管TUNEL 熒光檢測 各組標(biāo)本取出后，經(jīng)10% 中性甲醛固定、脫水、包埋和切片后行TUNEL 熒光染色檢查，每張切片隨機選取5 個高倍視野(200×)，使用Image J 軟件統(tǒng)計每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，作為凋亡指數(shù)，評估血管細(xì)胞的凋亡情況。

9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用EXCEL2016 進行數(shù)據(jù)匯總，使用SPSS25.0 進行研究資料分析。研究資料中的計量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗，以表示，兩組間的比較為成組t檢驗或校正t'檢驗(統(tǒng)計量為t)，組內(nèi)前后比較為配對t檢驗(統(tǒng)計量為t)?？紤]到本研究資料為同樣本來源，有較強的配對樣本屬性，故多時點觀測資料按重復(fù)觀測資料行重復(fù)測量方差分析(統(tǒng)計量為F)+兩兩組間比較LSD-t檢驗(統(tǒng)計量為LSD-t)+兩兩時間比較差值t檢驗(統(tǒng)計量為t)。統(tǒng)計檢驗水準(zhǔn)α=0.05，均為雙側(cè)檢驗。重復(fù)測量分析及分割檢驗的多次比較按Bonferroni 校正法進行檢驗水準(zhǔn)調(diào)整，α'=0.05/n，n 為多次比較的次數(shù)。

結(jié)果

1 不同血管保存組之間一般資料的比較 新鮮血管長度為(1.44 ± 0.05) cm，周長為(4.24 ± 0.06) cm，重量為(0.33 ± 0.01) g。經(jīng)1 d～ 4 周的保存后，冷藏組與冷凍組的血管長度、寬度和重量，組間及組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(兩因素重復(fù)測量方差分析，組間、組內(nèi)，交互等3 個維度P均＞0.05)。見表1。

表1 各組血管長度、寬度及重量的比較Tab.1 Comparison of the length,width and weight of blood vessels in different preservation groups

2 血管細(xì)胞活性檢測結(jié)果 新鮮組血管細(xì)胞活性結(jié)果為(2.76 ± 0.56) OD/m。經(jīng)1 d～ 4 周的保存后，各個保存組血管在各個時間點細(xì)胞活性均低于新鮮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；在保存1 d 和3 d 時冷藏組細(xì)胞活性高于冷凍組，3 d～2 周時兩組細(xì)胞活性相當(dāng)，2 周及4 周后冷藏組細(xì)胞活性低于冷凍組。部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組血管在不同時間點細(xì)胞活性結(jié)果Tab.2 Results of cell activity of blood vessels in each preservation group at different time points

3 極限應(yīng)力測試結(jié)果 新鮮組血管極限應(yīng)力Fmax為(12.11 ± 0.55) N。冷藏組極限拉力值Fmax隨著保存時間的延長逐漸減小，但5 d 內(nèi)其與新鮮組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但優(yōu)于冷凍組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。1～ 2 周兩組抗張力效果相當(dāng)，4 周后冷藏組的抗張力性能弱于冷凍組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組血管極限拉力值結(jié)果Tab.3 Results of ultimate tension value of blood vessels in different preservation groups

4 TUNEL 熒光結(jié)果 如圖1 所示：新鮮血管血管壁中平滑肌及內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核被DAPI 染成藍(lán)色，外膜層可見個別綠色熒光的凋亡細(xì)胞。隨著保存時間的延長，兩個保存組血管內(nèi)凋亡細(xì)胞均逐漸增多，保存1 周后，冷藏組管壁內(nèi)膜層和外膜層可見綠色熒光的凋亡細(xì)胞，冷凍組管壁亦可見散在凋亡細(xì)胞，平均凋亡指數(shù)分別為6.09% ±0.90%和3.96% ± 0.69%(P=0.001)；保存2 周后，冷藏組管壁全程可見凋亡細(xì)胞，內(nèi)膜層及外膜層更明顯，冷凍組管壁凋亡細(xì)胞較前增多，平均凋亡指數(shù)分別為34.58% ± 3.40%和17.45% ± 1.74%(P＜0.001)；保存4 周后，兩保存組血管壁凋亡細(xì)胞均進一步增多，平均凋亡指數(shù)分別為74.90% ±5.68%和31.23% ± 1.52%(P＜0.001)。

圖1 各保存組血管在不同時間點TUNEL 熒光染色(100×)Fig.1 TUNEL fluorescence staining of blood vessels in each preservation group at different time points (100×)

5 組織病理學(xué)結(jié)果 如圖2 所示：新鮮血管HE染色可見血管管壁各層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜由單層內(nèi)皮細(xì)胞附著于內(nèi)彈性膜構(gòu)成，肌層由內(nèi)環(huán)、外縱兩層構(gòu)成，由結(jié)締組織構(gòu)成血管外膜層；Masson染色可見膠原纖維染為藍(lán)色，連續(xù)性良好；EVG染色可見內(nèi)彈性膜及彈力纖維染為紫黑色，連續(xù)性良好。保存1 周后，冷藏組和冷凍組血管管壁各層結(jié)構(gòu)與新鮮血管對比均無明顯改變，內(nèi)皮細(xì)胞、肌纖維、膠原纖維及彈力纖維均保存良好。保存2 周后，冷藏組內(nèi)皮細(xì)胞可見脫落破壞，但管壁其余各層均無明顯改變；冷凍組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變圓，但連續(xù)性良好，其余管壁各層結(jié)構(gòu)仍保存良好。保存4 周后，冷藏組血管著色變淺，細(xì)胞核較前明顯減少，肌纖維可見水腫樣變化，內(nèi)皮細(xì)胞幾乎全部破壞脫落，但膠原纖維及彈力纖維仍保存良好；冷凍組內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)破壞，其余管壁各層仍保存良好。

圖2 各保存組血管在不同保存時間后的HE、Masson 和EVG 染色(200×)Fig.2 HE,Masson and EVG staining of vessels in each preservation group at different preservation time points (200×)

討論

目前血管重建中應(yīng)用的血管移植物有自體血管、人工血管及同種異體血管。迄今為止，自體動脈和靜脈仍然是替換病變血管的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。但自體血管獲取會增加患者的手術(shù)創(chuàng)傷，并且可獲取的自體血管資源有限，已不能滿足當(dāng)前日益增長的臨床需求。人工血管在過去的幾十年中得到了廣泛的應(yīng)用和研究，盡管經(jīng)過不同方式進行改良及術(shù)后抗血栓治療，術(shù)后6 個月的血管總體通暢率也只有35%～ 77%[8-9]。同種異體血管取自于供體器官獲取時的尸體血管，因其來源豐富、管徑易匹配、組織相容性好、近遠(yuǎn)期通暢率高等優(yōu)點，在臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

深低溫冷凍保存方法首先由O'Brien等[11]于1975 年引入到離體主動脈瓣的保存，其原理是通過降低組織細(xì)胞的溫度而降低細(xì)胞代謝速度。Brockbank等[12]通過氚化甘氨酸滲入實驗證明液氮冷凍保存兩年后的心臟瓣膜組織中成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)合成功能仍保留。Mirabet等[13]亦通過外植體培養(yǎng)和組織學(xué)研究證明同種異體移植物的細(xì)胞活性能在液氮保存達(dá)13 年之久。在隨后的幾十年里，深低溫冷凍保存技術(shù)不斷得到改進，保存效果得到進一步的提高，該方案被廣泛用于組織細(xì)胞的長期保存[14-15]。但深低溫冷凍并非是同種異體移植物最完美的保存方案，其降溫及復(fù)溫程序均會導(dǎo)致大量細(xì)胞損傷甚至死亡[16-17]。與深低溫冷凍保存不同，低溫冷藏保存并不強調(diào)將細(xì)胞代謝降為零，而是將細(xì)胞代謝抑制到一個較低水平，從而在一定時間范圍內(nèi)保存細(xì)胞組織的活性。由于操作方便，不需要煩瑣的降溫和復(fù)溫程序以及昂貴的設(shè)備，低溫冷藏保存技術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)療實踐中常見的離體器官保存方式[18-19]。

隨著時間的延長，兩組血管細(xì)胞活性均逐漸降低，但保存3 d 內(nèi)冷藏組細(xì)胞活性高于冷凍組，保存3 d～ 1 周內(nèi)兩種保存方案效果相當(dāng)，保存2 周后冷藏組血管細(xì)胞活性低于冷凍組。TUNEL熒光顯示兩組血管隨著保存時間的延長，凋亡細(xì)胞均逐漸增多，冷藏組的變化趨勢更為顯著。作為血管移植物，抗張力性能的保存尤為重要，其直接影響著血管縫合的成敗，但這在以往關(guān)于血管保存的研究中極少被研究者關(guān)注。我們的研究發(fā)現(xiàn)，兩組血管的膠原纖維及彈性纖維在組織病理中均未觀察到明顯的破壞改變，保存1 周內(nèi)冷凍組血管的抗張力性能較冷藏組和新鮮組低。隨著保存時間的延長，冷藏組血管的抗張力性能逐漸下降，而冷凍組血管無明顯改變，在4 周時冷藏組抗張力性能低于冷凍組。由此可認(rèn)為冷藏組血管抗張力性能的下降是由保存時間延長所致，而冷凍組則是在降溫和復(fù)溫過程中導(dǎo)致血管的脆性增加所致。

對于離體靜脈的保存，血管結(jié)構(gòu)的完整保留至關(guān)重要。靜脈管壁主要由內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)彈性膜構(gòu)成的內(nèi)膜、內(nèi)環(huán)外縱兩層平滑肌構(gòu)成的中膜及結(jié)締組織構(gòu)成的外膜層組成。我們通過組織病理結(jié)果可看出，保存4 周內(nèi)，低溫冷藏和深低溫冷凍均能良好地保存血管的中膜和外膜結(jié)構(gòu)，膠原纖維和彈性纖維亦保存良好。但冷藏組在保存2 周后內(nèi)皮細(xì)胞可見脫落破壞，保存4 周后內(nèi)皮細(xì)胞幾乎全部破壞脫落，盡管內(nèi)皮層的完整可減少血栓形成[20]，但亦有研究認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有包括ABO 抗原和HLA 抗原在內(nèi)的多種自身抗原，其脫落破壞可能會導(dǎo)致宿主特異性抗原的減少從而減少術(shù)后排斥反應(yīng)[21]。內(nèi)皮細(xì)胞在保存過程中的破壞對移植術(shù)后的影響尚需進一步的研究評估。

綜上所述，2 周內(nèi)，低溫冷藏方案的保存效果與深低溫冷凍方案相當(dāng)，可作為離體靜脈安全可靠的保存方案；4 周后，深低溫冷凍方案的保存效果優(yōu)于低溫冷藏。但遺憾的是，本研究是植入前的體外觀察，其綜合保存效果仍需進一步在體實驗研究進行評估。