沖擊波對糖尿病慢性創(chuàng)面微環(huán)境下HaCat 細胞增殖及遷移的影響

康靖汶，盛煒，甕長水，李美蓉，羅蕓，張麗

1解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853；3 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；4 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 組織再生與創(chuàng)面修復(fù)科，北京 100853；5 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部，北京 100853；6 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853

隨著社會和經(jīng)濟的快速發(fā)展，糖尿病已經(jīng)成為造成體表慢性創(chuàng)面的首要原因[1]。慢性創(chuàng)面治療困難，花費巨大，嚴重影響患者健康狀態(tài)、降低其生活質(zhì)量，正在成為社會和家庭的重要負擔(dān)。積極探索新型治療方法，提高慢性創(chuàng)面愈合率，具有重要的臨床、經(jīng)濟及社會價值[1]。體外沖擊波療法(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)已在骨肌疾病臨床治療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2]，但在創(chuàng)面治療中的應(yīng)用尚屬較新領(lǐng)域[3]。臨床研究初步證實，ESWT 可促進糖尿病足創(chuàng)面、壓力性潰瘍等慢性創(chuàng)面愈合[4-5]，但其機制有待深入研究。在創(chuàng)面愈合過程中，皮膚基底層表皮細胞的增殖和遷移功能對創(chuàng)面的成功上皮化具有重要作用[1]。本研究擬觀察沖擊波(shock wave，SW)對離體條件下糖尿病慢性創(chuàng)面(chronic diabetic wound，CDW)微環(huán)境中HaCat 細胞(人表皮角質(zhì)形成細胞)增殖和遷移能力的影響，嘗試從細胞水平探討ESWT 促進CDW 愈合的作用機制。

材料與方法

1 實驗細胞 人表皮角質(zhì)形成細胞(human keratinocyte cell line，HaCat；細胞編號：3111C0001 CCC000373)，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。

2 主要試劑與儀器 MEM-EBSS(minimum essential medium eagles with earle’s balanced salts)培養(yǎng)基，美國Sigma-Aldrich 有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，美國Gibco 公司；青霉素/鏈霉素液，中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)，中國南京拜睿生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，中國北京索萊寶生物科技有限公司；葡萄糖溶液，美國Gibco 公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)，中國北京索萊寶生物科技有限公司；絲裂霉素C，美國Sigma-Aldrich 有限公司；96 孔細胞培養(yǎng)板及6 孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning公司。

Dolor-Clast 型放散式體外沖擊波治療設(shè)備，瑞士EMS 公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司；HF151 型CO2細胞培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；XD-RFL 型生物相差倒置顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；80-2型臺式低速離心機，上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

3 細胞分組 細胞分為5組，其干預(yù)方法如下。1)對照組：用葡萄糖濃度5 mmol/L 的MEM-EBSS培養(yǎng)基，模擬正常HaCat 細胞；2) CDW 組：通過高糖低氧孵育條件模擬糖尿病慢性創(chuàng)面微環(huán)境，建立糖尿病慢性創(chuàng)面細胞模型；3) SW1 組：針對糖尿病慢性創(chuàng)面細胞模型，進行沖擊波干預(yù)，能流密度(energy flux density，ED) 0.05 mJ/mm2，500脈沖，頻率8 Hz/s；4) SW2 組：針對糖尿病慢性創(chuàng)面細胞模型，進行沖擊波干預(yù)，ED 0.10 mJ/mm2，500 脈沖，頻率同上；5) SW3 組：針對糖尿病慢性創(chuàng)面細胞模型，進行沖擊波干預(yù)，ED 0.10 mJ/mm2，1 000 脈沖，頻率同上。

4 HaCat 細胞培養(yǎng) HaCat 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、5 mmol/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的MEM 培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中以5% CO2、37℃以及飽和濕度條件下松蓋培養(yǎng)，每2～ 3 d 換液1次，80% 鋪滿時進行消化、傳代，直至第3 代(P3)。

5 細胞模型建立 HaCat 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、25 mmol/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的MEM 培養(yǎng)基中，低氧狀態(tài)采用混合缺氧氣體預(yù)充方式(1% O2，5% CO2，94%N2)，利用簡易輸液袋將培養(yǎng)好的HaCat 細胞培育瓶或培育板放入其中，用封口機密封后真空泵抽空袋內(nèi)空氣，隨后將混合缺氧氣體灌入袋中，保證輸液袋內(nèi)為含1% O2的缺氧氣體，隨后將輸液袋放入5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育相應(yīng)時間[6-7]。

6 沖擊波干預(yù)方法 取對數(shù)生長期的HaCat 細胞，胰酶消化、離心，調(diào)整為適宜的細胞濃度，采用放散式?jīng)_擊波治療設(shè)備，將36 mm 沖擊波探頭采用環(huán)氧乙烷進行滅菌消毒后，在嚴格無菌的條件下，根據(jù)各組不同干預(yù)參數(shù)，對HaCat 細胞懸液進行沖擊波干預(yù)[8]。

7 HaCat 增殖能力測定 采用CCK-8 試劑盒檢測HaCat 細胞增殖能力。方法如下：取對數(shù)生長期的HaCat 細胞，胰酶消化、離心，調(diào)整細胞濃度為l × 104/mL，進行ESWT 干預(yù)；將ESWT 干預(yù)后的HaCat 細胞懸液200 μL 加入到96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 000 個細胞，每組設(shè)8 個復(fù)孔；在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在每孔加入CCK-8 溶液10 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h；采用全自動酶標(biāo)儀在450 nm 測定吸光度(optical density，OD)，其細胞增殖能力與吸光度成正比。檢測時間為ESWT 干預(yù)后1 d、2 d、4 d、6 d、8 d。

8 HaCat 遷移能力測定 采用細胞劃痕試驗，方法如下：取對數(shù)生長期的HaCat 細胞，胰酶消化、離心，調(diào)整細胞濃度為5 × 105/mL，進行ESWT 干預(yù)；于6 孔板加入ESWT 干預(yù)后的細胞混懸液，每孔1.5 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h；PBS 清洗，加入含20 μg/mL 絲裂霉素C 的1640 培養(yǎng)基1.5 mL，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h；取出6 孔板，用50 μL Tip 頭比著直尺，垂直于孔板底部在單層貼壁細胞上劃出劃痕；PBS 清洗2次，去除脫落的細胞；加入MEM 培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別于0 h、12 h、24 h 用倒置相差顯微鏡觀察細胞遷移情況，記錄劃痕寬度，拍照取樣。每組設(shè)6 個復(fù)孔。用Image J 軟件測量各時間點愈合劃痕面積，并計算劃痕愈合率，公式如下：

細胞劃痕愈合率=(1-劃痕面積/最初劃痕面積) × 100%。

9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。本研究數(shù)據(jù)主要為多組、多時間點觀測的計量資料，均滿足正態(tài)性分布，以表示。采用兩因素重復(fù)測量方差分析+兩組間比較LSD-t檢驗+組內(nèi)兩時點比較差值t檢驗。統(tǒng)計檢驗水準α=0.05，均為雙側(cè)檢驗。其中差值t檢驗屬多次比較，按Bonferroni 校正法進行檢驗水準調(diào)整，α'=0.05/n，n 為多次比較的次數(shù)。

結(jié)果

1 不同干預(yù)條件對HaCat 細胞形態(tài)的影響 通過倒置相差顯微鏡觀察，可見對照組HaCat 細胞呈梭形或多邊形外觀，胞液透明，排列緊湊，邊界清楚；CDW 組HaCat 細胞形態(tài)未見異常，胞內(nèi)可見密集、高亮折光點；不同劑量SW 組HaCat 細胞形態(tài)均未見異常，胞液清亮透明，與對照組比較無明顯差異。見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下不同干預(yù)組HaCat 細胞形態(tài)Fig.1 Morphological changes of HaCat cells in different groups under inverted phase contrast microscope

2 ESWT 干預(yù)對HaCat 細胞增殖活性的影響CCK-8 試驗結(jié)果列示于下。經(jīng)兩因素重復(fù)測量方差分析，整體組間、組內(nèi)(時間)及交互作用，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩兩精細比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：

1) ESWT 干預(yù)對HaCat 細胞增殖活性的影響：孵育1 d時，各組HaCat 細胞增殖活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；孵育2 d時，SW2 組細胞增殖活性增加明顯，其OD450值：SW2 組＞SW1 組＞對照組＞SW3 組＞CDW 組(P＜0.05)；孵育4 d時，各組細胞增殖活性均有增加，以SW2 組最為明顯，其OD450值：SW2 組＞對照組＞SW1 組＞CDW 組＞SW3 組(P＜0.05)；孵育6 d時，SW2 組和SW1 組細胞增殖活性增長明顯，OD450值：SW2 組＞SW1 組＞SW3 組＞對照組＞CDW 組(P＜0.05)；孵育8 d時，各組細胞增殖活性顯著下降，但仍以ESWT 干預(yù)組更強(P＜0.05)，提示不同處理對細胞增殖活性的影響顯著。見表1。

2)不同孵育時間HaCat 細胞增殖活性的變化：HaCat 細胞增殖活性呈現(xiàn)出早期增加、后期下降的趨勢，具體表現(xiàn)：干預(yù)后2 d，除CDW 組外，各組細胞增殖活性開始增加，之后增殖速度明顯加快，在干預(yù)后6 d 達到增殖高峰，在干預(yù)后8 d 增殖活性顯著下降，其OD450值：Day6＞Day4＞Day8＞Day2＞Day1，Day2 及其后各時點與Day1 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，各組表現(xiàn)為相似的變化趨勢和特征，尤以ESWT 干預(yù)組最明顯。見表1。

表1 各組HaCat 細胞增殖活性(OD450)Tab.1 Proliferation ability of HaCat cells in different groups by CCK-8 (OD450)

綜合來看，不同劑量的ESWT 干預(yù)及孵育時間均對HaCat 細胞的增殖活性具有顯著影響。3 沖擊波干預(yù)對HaCat 細胞遷移能力的影響 沖擊波干預(yù)對HaCat 細胞遷移能力的影響列示于下。亦經(jīng)兩因素重復(fù)測量方差分析，整體組間、組內(nèi)(時間) 及交互作用，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩兩精細比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：各組HaCat 細胞劃痕愈合率均隨時間延長逐漸增加；劃痕12 h 及24 h時，各組劃痕愈合率：SW2 組＞SW1 組＞SW3 組＞對照組＞CDW 組(P＜0.05)。見圖2、表2。

表2 不同干預(yù)組HaCat 細胞劃痕愈合率(%,n=6)Tab.2 Healing rate of HaCat cells in different groups by scratch assay (%,n=6)

圖2 倒置相差顯微鏡下不同干預(yù)組HaCat 細胞遷移能力Fig.2 Migration ability of HaCat cells in different groups by scratch assay under inverted phase contrast microscope

討論

慢性創(chuàng)面是一大類長期不愈或難愈的組織損傷，國際創(chuàng)面愈合學(xué)會將其定義為無法通過正常有序而及時的修復(fù)過程，達到解剖和功能上完整狀態(tài)的創(chuàng)面[1]。

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，涉及多種修復(fù)細胞、炎癥細胞、炎癥介質(zhì)、細胞因子和細胞外介質(zhì)等的共同參與，其中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都可能導(dǎo)致創(chuàng)面的延遲愈合或不愈合[9]。在此過程中，基底層表皮細胞不斷增殖并向上遷移，并最終形成創(chuàng)面再上皮化，這是實現(xiàn)創(chuàng)面成功修復(fù)的關(guān)鍵步驟，因此表皮細胞的活性及功能對創(chuàng)面的愈合過程甚為重要[1,3]。而在糖尿病高糖微環(huán)境中，多種細胞的增殖能力受到抑制[10-11]，創(chuàng)面局部表皮細胞也會數(shù)量減少、活性下降，創(chuàng)面再上皮化的進程受阻，從而延遲創(chuàng)面的愈合[12-13]。因此，重新激活糖尿病慢性創(chuàng)面微環(huán)境中表皮細胞的活性和功能，對加速糖尿病慢性創(chuàng)面的愈合具有重要意義。

本研究中選用的HaCat 細胞來自于正常人皮膚的永生化表皮細胞，具有增殖能力強、細胞培養(yǎng)條件簡單等優(yōu)點；根據(jù)文件檢索[6]和前期預(yù)實驗，選擇高糖低氧孵育條件模擬糖尿病慢性創(chuàng)面局部微環(huán)境，其方法簡便可行，HaCat 細胞形態(tài)未見顯著改變，但細胞的增殖和遷移功能受到明顯抑制，較為客觀地反映了糖尿病慢性創(chuàng)面中表皮細胞的功能狀態(tài)和生物學(xué)特征，保障了本研究的順利實施。

ESWT 是利用沖擊波的機械能量進行疾病治療與康復(fù)的新型物理療法[14]，具有非侵入、安全、有效的特點，在難愈性骨折、骨不連、肌腱末端病等肌肉-骨骼系統(tǒng)損傷或疾病的治療中廣泛應(yīng)用[14-15]。近年來，ESWT 治療領(lǐng)域不斷拓展，在年齡相關(guān)性退行性病變的治療(如肌少癥、骨質(zhì)疏松癥等)、創(chuàng)傷修復(fù)、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也顯示出獨特優(yōu)勢[4,16-17]。現(xiàn)有臨床證據(jù)初步證實，作為一種新型慢性創(chuàng)面的輔助治療方法，ESWT 具有良好的臨床應(yīng)用前景[4-5]，但其作用機制尚不明確。相關(guān)研究表明，沖擊波的機械能量可能促進新生血管的形成和微循環(huán)改善[18-19]、調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)、刺激堿性成纖維細胞生長因子、基質(zhì)細胞衍生因子、內(nèi)皮生長因子等生長因子的表達[18,20]、誘導(dǎo)干細胞的增殖和多向分化等一系列生物反應(yīng)[21]，被認為是ESWT 促進慢性創(chuàng)面愈合效果的重要機制[22-23]。

細胞學(xué)研究證實，沖擊波的機械能量可以刺激成纖維細胞[24-26]、成骨細胞、肌腱細胞、間質(zhì)祖細胞[22]、骨髓干細胞、脂肪干細胞[22]、肌腱干細胞[27]等的增殖、遷移和(或)分化過程。目前尚無沖擊波應(yīng)用于表皮HaCat 細胞的相關(guān)研究。

本研究觀察了不同劑量沖擊波對糖尿病慢性創(chuàng)面微環(huán)境中人表皮HaCat 細胞形態(tài)以及增殖和遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CDW 組HaCat 細胞的增殖和遷移能力均受到明顯抑制，而沖擊波作用后，HaCat 細胞的增殖和遷移能力顯著增強，其增殖效應(yīng)在干預(yù)后6 d 達到高峰。上述結(jié)果提示沖擊波對HaCat 細胞的生物學(xué)效應(yīng)，這可能是ESWT 促進慢性創(chuàng)面愈合的重要作用機制之一。在臨床研究中，我們也觀察到ESWT 治療后，慢性創(chuàng)面再上皮化速度明顯加快，佐證了ESWT 治療機制可能與創(chuàng)面周圍組織中表皮細胞的功能增強有關(guān)[5]。通過細胞實驗與臨床研究的結(jié)果相互印證，將為ESWT 在創(chuàng)面修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

能流密度是反映沖擊波能量的重要參數(shù)，描述單位面積沖擊波能量的集中度[2]。根據(jù)2019年中國研究型醫(yī)院學(xué)會沖擊波醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會制定的《中國骨肌疾病體外沖擊波療法指南》[2]：按能量等級，將沖擊波劃分為低、中、高3 個能級：低能量范圍為0.06～ 0.11 mJ/mm2，中能量范圍為0.12～ 0.25 mJ/mm2，高能量范圍為0.26～0.39 mJ/mm2。據(jù)此標(biāo)準，本研究中所選擇的沖擊波能流密度均為低能量范圍，具體輸出劑量：SW3 組(0.10 mJ/mm2，1 000 脈沖)＞SW2 組(0.10 mJ/mm2，500 脈沖)＞SW1 組(0.05 mJ/mm2，500 脈沖)；而進一步比較不同劑量沖擊波對HaCat 細胞的生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW2 組細胞的增殖和遷移能力增強最為明顯，SW1 組次之，SW3 組低于前兩組，提示在較低劑量沖擊波作用時，對細胞促增殖效應(yīng)更加明顯，其中0.10 mJ/mm2、500 脈沖的干預(yù)劑量效果最佳；而在較高劑量的沖擊波作用時，對細胞的促增殖效應(yīng)相對減弱。該結(jié)果與既往基礎(chǔ)和臨床研究的結(jié)果一致，即過高能量的沖擊波作用時，局部組織可能出現(xiàn)損傷性或抑制性反應(yīng)[19]。上述劑量-效應(yīng)關(guān)系將對ESWT 臨床應(yīng)用于慢性創(chuàng)面具有指導(dǎo)作用。

需要注意的是，創(chuàng)面愈合過程非常復(fù)雜，涉及到多種細胞類型和生物學(xué)過程，除表皮細胞的功能外，成纖維細胞、內(nèi)皮細胞的增殖活性和功能、新生血管以及基質(zhì)合成等生物學(xué)過程的參與亦非常重要。而本研究中，僅涉及沖擊波對表皮細胞的作用和特點，而對其他細胞及生物學(xué)過程的效應(yīng)研究還有待開展；另一方面，在分子生物學(xué)水平上，沖擊波促進慢性創(chuàng)面愈合的信號通路和作用機制也有待更為深入的研究。