麻黃堿介導(dǎo)TSLP/OX40L通路調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠Th2型免疫反應(yīng)的作用研究

楊玲 劉杰 李江平 李鶴

（襄陽市中心醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，襄陽 441021）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一種Ⅰ型超敏反應(yīng)，源于特定過敏原的致敏作用，如家用塵螨、寵物和花粉［1-2］。免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎是一種以打噴嚏、鼻塞、鼻癢和鼻漏為特征的慢性疾病。這些癥狀是由IgE刺激的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞釋放的各種炎癥介質(zhì)引起［3］?，F(xiàn)有幾種藥物用于治療變應(yīng)性鼻炎，如抗組胺藥、皮質(zhì)類固醇、抗白三烯和鼻減充血劑。然而，在變應(yīng)性鼻炎中長期使用這些藥物可能會有不良副作用，且這些藥物對部分患者的治療效果并不理想。麻黃堿（Ephedrine）是一種存在于多種麻黃屬植物中的生物堿，同時也是經(jīng)典的α和β腎上腺素能激動劑，具有刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)、升高血壓和擴(kuò)張支氣管的作用［4］。目前，許多研究報道麻黃聯(lián)合其他藥物在變應(yīng)性鼻炎中的治療效果［5-6］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)麻黃堿與丙酸氟替卡松聯(lián)合使用對早期中重度持續(xù)變應(yīng)性鼻炎具有較好療效［7］，然而，麻黃堿治療變應(yīng)性鼻炎的具體分子機(jī)制尚不明確。輔助性T細(xì)胞2（Th2）及其釋放的細(xì)胞因子如IL-4、IL-13等與變應(yīng)性鼻炎的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［8］。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）/OX40L與Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)，TSLP/OX40L是啟動和維持變應(yīng)性鼻炎中Th2型免疫應(yīng)答的重要信號通路［9-10］。本研究的目的是考察麻黃堿對卵白蛋白（OVA）誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎大鼠模型中Th2型免疫反應(yīng)及TSLP/OX40L通路的影響，從而進(jìn)一步揭示麻黃堿治療變應(yīng)性鼻炎的藥理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量200~250 g。大鼠在12 h光-12 h暗照明、室溫（23±2）℃、濕度（45±5）%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由獲取食物和水。

卵白蛋白（OVA）購自美國Sigma-Aldrich公司；麻黃堿購自吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H22021712；總IgE、IL-4和IL-13 ELISA試劑盒購自上海心語生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒、SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。本研究所有抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模及藥物治療將雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組，對照組（Control）、模型組（Model）、麻黃 堿組（Ephedrine，10 mg/kg）和 氯雷 他 定 組（Loratadine，2 mg/kg），每組10只。除對照組外，其余組大鼠均建立OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎大鼠模型。將0.3 mg OVA和30 mg氫氧化鋁溶解于生理鹽水中，每隔1 d腹腔注射1次，連續(xù)14 d。致敏后第15~21天，每天激發(fā)1次，每鼻孔滴注10%OVA溶液20 μl（溶于1 ml生理鹽水中），連續(xù)7 d。致敏后第15~21天，麻黃堿組大鼠每天灌胃10 mg/kg麻黃堿，氯雷他定組大鼠每天灌胃2 mg/kg氯雷他定，均連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 鼻部癥狀評分鼻部評分在研究第22天進(jìn)行。大鼠單獨放在籠子里，在經(jīng)過10 min的適應(yīng)期后，觀察10 min內(nèi)大鼠打噴嚏、撓鼻和流鼻涕［11］。每分鐘打噴嚏次數(shù)：0分無、1分1~2次、2分3~5次、3分>6次；每分鐘撓鼻次數(shù)：0分無、1分1~2次、2分3~5次、3分>6次；流鼻涕：0分 無、1分 單鼻孔、2分雙鼻孔、3分涕流滿面?？偡殖^5分即為造模成功。

1.2.3 ELISA分析所有大鼠在40 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg賽拉嗪麻醉下頸椎脫位處死。眼底靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min。分離血清，并將其冷藏于-80℃。使用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測血清總IgE、IL-4和IL-13水平。IgE以KU/L表 示、IL-4以pg/ml表示、IL-13以ng/L表示。

1.2.4 組織病理學(xué)分析將大鼠處死后，剪下鼻部并用4%多聚甲醛固定48 h，然后石蠟包埋，切成4 μm切片。按照制造商說明，對切片進(jìn)行HE染色。

1.2.5 qRT-PCR分析用TRIzol試劑從大鼠鼻黏膜組織中提取總mRNA，PrimeScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒在Applied Biosystems 7900HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列如下，TSLP：5'-CTCCGGTATAGCACAATTC-3'（正向）和5'-TGCATACCGAGTCATAAG-3'（反向）；OX40L：5'-CCCATGTCTCGGCACCTATTAA-3'（正向），5'-ATGTCTGAATGAATGTCGGGGA-3'（反向）；β-actin：5'-CTGAAGAGATCTACGGGA-3'（正向），5'-GCATTGCTGC?TACCGTAACTGT-3'（反向）。反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃10 s、60℃30 s、72℃40 s，40個 循 環(huán)；72℃10 min。將TSLP和OX40L的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin，通過2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6 Western blot將大鼠鼻黏膜組織剪碎、研磨，使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解組織，12 000 g離心10 min。BCA試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白（20 μg），并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。使用含5%脫脂乳的TBST封閉膜2 h，將膜與TSLP（1∶1 000稀釋）、OX40L（1∶1 000稀釋）和β-actin（1∶2 000稀釋）一抗4℃孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影。

1.2.7 免疫組織化學(xué)分析鼻黏膜組織切片用PBS洗滌后，在3%H2O2中孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。在500 W微波下用抗原修復(fù)液處理2次，每次5 min，將切片冷卻。用PBS洗滌后，切片與PBS稀釋的環(huán)氧合酶2（COX2）（1∶1 000稀釋）一抗4℃過夜孵育。PBS洗滌后，將切片與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG二抗（1∶1 000稀釋）室溫避光孵育1 h，PBS洗滌。然后DAB染色3~10 min，蘇木精復(fù)染。每張切片隨機(jī)選擇6個高倍視野（200倍），計數(shù)100個視野中的細(xì)胞，并計算陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布檢驗后，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Tukey事后檢驗對正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻黃堿對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻部癥狀的影響各組大鼠的鼻部癥狀評分如圖1所示，模型組大鼠的鼻部癥狀評分顯著高于對照組（P<0.05），表示建模成功。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組的鼻部癥狀評分顯著降低（P<0.05），說明麻黃堿和氯雷他定均能明顯減輕變應(yīng)性鼻炎大鼠的鼻部癥狀。

圖1 各組大鼠的鼻部癥狀評分Fig.1 Scores of nasal symptoms of rats in each group

2.2 麻黃堿對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜組織病變的影響HE染色顯示（圖2），對照組大鼠鼻黏膜和黏膜下層組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠出現(xiàn)鼻腔杯狀細(xì)胞增生，鼻上皮纖毛脫屑，嗜酸性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，鼻腔內(nèi)有壞死的嗜酸性腫塊。在黏膜下層觀察到嚴(yán)重水腫、血管擴(kuò)張和充血。麻黃堿組和氯雷他定組輕度杯狀細(xì)胞增生，黏膜下層輕度水腫，血管輕度擴(kuò)張。

圖2 各組大鼠鼻腔組織的HE染色（×200）Fig.2 HE staining of rat nasal cavity tissues in each group（×200）

COX2是炎癥反應(yīng)的重要組分和標(biāo)志物，本研究通過免疫組化染色檢測了各組大鼠鼻黏膜組織中COX2的表達(dá)，如圖3所示，模型組大鼠鼻黏膜組織中COX2陽性細(xì)胞率顯著高于對照組（P<0.05）。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組大鼠鼻黏膜組織中COX2陽性細(xì)胞率顯著降低（P<0.05）。結(jié)果說明麻黃堿和氯雷他定均能明顯減輕變應(yīng)性鼻炎大鼠的鼻黏膜組織病變。

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織中COX2的免疫組織化學(xué)染色（×200）Fig.3 Immunohistochemical staining of COX2 in nasal mucosa tissue of rats in each group（×200）

2.3 麻黃堿對變應(yīng)性鼻炎大鼠Th2型免疫反應(yīng)的影響由于Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)是通過釋放細(xì)胞因子如IL-4、IL-13等進(jìn)行抗原呈遞的，并且IL-4和IL-13通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE而導(dǎo)致過敏性炎癥，因此，IL-4和IL-13的異常可直接反映Th2細(xì)胞免疫的激活與否。因此，本研究通過ELISA分析各組大鼠血清中IgE水平以及Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13的水平，從而考察麻黃堿對變應(yīng)性鼻炎大鼠Th2型免疫的影響。如圖4所示，模型組大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平顯著高于對照組（P<0.05）。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果說明麻黃堿和氯雷他定均能明顯抑制變應(yīng)性鼻炎大鼠Th2型免疫反應(yīng)。

圖4 各組大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平Fig.4 Levels of IgE，IL-4 and IL-13 in serum of rats in each group

2.4 麻黃堿對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜組織TSLP/OX40L通路的影響通過qRT-PCR和Western blot分析各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達(dá)水平，如圖5和圖6所示，模型組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組（P<0.05）。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果說明麻黃堿和氯雷他定均抑制了變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜組織中TSLP/OX40L通路的活化。

圖5 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA水平Fig.5 TSLP and OX40L mRNA levels in nasal mucosa tissues of rats in each group

圖6 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L蛋白水平Fig.6 TSLP and OX40L protein levels in nasal mucosa tissues of rats in each group

3 討論

據(jù)報道，麻黃堿通過PI3K/Akt途徑增加抗炎細(xì)胞因子IL-10和降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的表達(dá)，從而控制炎癥反應(yīng)［4］。此外，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠模型中，麻黃堿通過平衡TLR4信號中促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)并發(fā)揮抗炎作用［12］。目前，許多研究報道麻黃聯(lián)合其他藥物在變應(yīng)性鼻炎中的治療效果［5-7］，然而，麻黃堿治療變應(yīng)性鼻炎的具體分子機(jī)制尚不明確。

變應(yīng)性鼻炎發(fā)展過程中，炎癥改變會導(dǎo)致鼻涕、瘙癢和打噴嚏等鼻部癥狀。隨后是中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞遷移到鼻黏膜的后期階段［13］。在這種細(xì)胞流動中，嗜酸性粒細(xì)胞尤其會增加活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生，從而增加鼻黏膜的通透性并促進(jìn)黏液的產(chǎn)生，降低上皮纖毛的功能，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)和炎癥介質(zhì)的釋放。另外，COX2是花生四烯酸生成二十烷酸的原因，也是炎癥反應(yīng)的重要組成部分和標(biāo)志物［14］。本研究顯示，麻黃堿顯著減少變應(yīng)性鼻炎大鼠的鼻部癥狀，HE染色證實麻黃堿治療后大鼠鼻黏膜內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，免疫組織化學(xué)染色顯示麻黃堿抑制了鼻黏膜組中COX2的表達(dá)，并且麻黃堿的治療效果與氯雷他定相當(dāng)，說明麻黃堿在治療變應(yīng)性鼻炎方面具有較好的療效。

Th2炎癥反應(yīng)是變態(tài)反應(yīng)性炎癥疾病的主要誘因。在變應(yīng)性鼻炎的致敏階段，鼻黏膜的過敏原接觸T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致Th2淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)。隨著Th2淋巴細(xì)胞的激活，產(chǎn)生導(dǎo)致IgE合成和肥大細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，如IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13［15］。當(dāng)肥大細(xì)胞表面的過敏原遇到自身的特異性IgE時，早期的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放介質(zhì)。這些物質(zhì)包括IL-4、IL-6和COX2等介質(zhì)，會引起鼻腔內(nèi)的炎癥過程。高IgE水平是變態(tài)反應(yīng)性疾病存在的重要標(biāo)志。WINTHER等［16］研究表明，季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎患者的IgE水平升高，這與鼻炎的嚴(yán)重程度有關(guān)。一項OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎模型的研究表明，大鼠血清IgE水平升高［11］。此外，與血清IgE水平一樣，變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜局部IgE水平也升高［17］。IL-4和IL-13在變應(yīng)性鼻炎中占有重要地位。這些Th2型細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞抗原呈遞功能所必需的，還通過產(chǎn)生IgE而導(dǎo)致過敏性炎癥［18］。IL-13在氣道高反應(yīng)性、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和黏液纖毛分化中起重要作用。它還被證明能刺激鼻腔上皮細(xì)胞合成NO，從而加重血管擴(kuò)張和呼吸道炎癥［19］。其他文獻(xiàn)報道，變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IgE、IL-4和IL-13水平明顯高于對照組［11，20］。在花粉誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎模型中，IgE、IL-4和IL-13的水平也同樣升高［21］。本研究中，與對照組相比，變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IgE、IL-13和IL-4水平顯著升高，然而麻黃堿治療的大鼠血清IgE、IL-4和IL-13水平顯著降低。

致敏細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP），是在上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞之間啟動變態(tài)反應(yīng)性炎癥的主開關(guān)之一［22］。OX40與其配體OX40L是TSLP信號通路的下游分子，OX40L調(diào)控Th1和Th2細(xì)胞的分化過程。TSLP/OX40L是啟動和維持變應(yīng)性鼻炎中Th2型免疫應(yīng)答的重要信號通路［10］。在過敏性炎癥中TSLP能激活髓樣樹突狀細(xì)胞（DC）產(chǎn)生OX40L，從而觸發(fā)Th2炎癥反應(yīng)［23］。本研究結(jié)果顯示，麻黃堿治療后，變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達(dá)均被抑制。結(jié)果提示，麻黃堿可能通過TSLP/OX40L通路調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠Th2型免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究表明麻黃堿對OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎大鼠具有良好的治療作用，麻黃堿可能通過TSLP/OX40L通路調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠Th2型免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮治療作用。