溫膽湯方劑對(duì)睡眠剝奪小鼠氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

李莉 劉茹 何晶 陳云 郭娟 陳紅 劉玲

（湖北省中醫(yī)院，湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，武漢 430074）

失眠是一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，其患病率較高，約30%以上的人口患有失眠癥狀，約10%的人口符合睡眠障礙的標(biāo)準(zhǔn)［1］。失眠癥是全球神經(jīng)精神障礙的十大原因之一，而且有負(fù)面影響的后遺癥，譬如日間疲勞、認(rèn)知困難、情緒調(diào)節(jié)受損和生活質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響公眾健康，但人們對(duì)失眠癥的潛在病理生理學(xué)或失眠影響身心健康的機(jī)制知之甚少［2］，這便給失眠的有效治療帶來了很大障礙。失眠在中醫(yī)學(xué)屬于“不寐”“不得臥”“不得眠”的范疇［3］，常見的中醫(yī)治療方法包括中藥湯劑、推拿、針灸、火罐、刺血等，相較于西藥的單靶點(diǎn)機(jī)制，中藥治療具有多靶點(diǎn)、多途徑改善失眠癥狀的優(yōu)勢(shì)［4］。溫膽湯為中醫(yī)學(xué)經(jīng)典方劑之一，具有理氣化痰、利膽合胃的功效，溫膽湯在失眠的臨床治療上具有較好效果，值得推廣［5］。然而，關(guān)于溫膽湯治療失眠的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。吳蕾［6］研究結(jié)果顯示，溫膽湯可減緩人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的氧化應(yīng)激，改善炎癥損傷。而失眠與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)［7-8］，故推測(cè)溫膽湯可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥損傷來改善失眠。本研究采用改良版水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法構(gòu)建失眠小鼠模型［9］，采用溫膽湯進(jìn)行治療，檢測(cè)小鼠氧化應(yīng)激水平以及炎癥細(xì)胞因子水平變化，以期闡明溫膽湯治療失眠的可能機(jī)制，為中醫(yī)藥治療失眠提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物30只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，4~5周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 溫膽湯方劑6 g半夏（批號(hào)：19021091）、6 g竹茹（批號(hào)：18122371）、6 g麩炒枳實(shí)（批號(hào)：19031361）、9 g陳皮（批號(hào)：19051171）、3 g炙甘草（批號(hào)：19040261）、4.5 g茯苓（批號(hào)：19061131），每劑含生藥34.5 g，均由湖北省中醫(yī)院門診中藥房提供。一煎，藥材8倍水煎制，沸騰后煎40 min，過濾取汁；二煎，6倍水煎制，沸后煎30 min，過濾取汁，2次汁液混合后，濃縮成1∶1藥液備用。

1.1.3 主要試劑艾司唑侖片購自襄陽市華中藥業(yè)股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒、兔抗核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）抗體、羊抗兔IgG抗體均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗p-NF-κB抗體購自美國CST公司；RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 睡眠剝奪小鼠構(gòu)建通過改良版水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法構(gòu)建失眠小鼠模型。使用亞克力塑料板構(gòu)建睡眠剝奪箱（長：110 cm、寬：60 cm、高：40 cm），其底部固定有15個(gè)圓柱形平臺(tái)（直徑：6.5 cm、高：8 cm），保持10 cm縱向間距，13 cm橫向間距，注入23~25℃水至平臺(tái)下1 cm處，保持水溫。適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后，將24只待造模小鼠放置于睡眠箱平臺(tái)上進(jìn)行站立訓(xùn)練，當(dāng)其即將進(jìn)入睡眠時(shí)，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各拿出休息1次，每次30 min，訓(xùn)練2周。造模期間，每2 d記錄1次小鼠行為學(xué)改變（精神狀態(tài)、飲食）、毛發(fā)和體質(zhì)量。

1.2.2 分組與處理30只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠隨機(jī)挑選6只作為對(duì)照組，剩余24只構(gòu)建睡眠剝奪模型，并隨機(jī)分為4組：模型組、溫膽湯低濃度組（含生藥0.5 g/ml）、溫膽湯高濃度組（含生藥2 g/ml）、艾司唑侖片組（0.15 mg/kg），每組6只。于模型構(gòu)建的第8天開始灌胃，1次/d，共7 d，低、高劑量組及艾司唑侖片組分別灌入0.5 ml相應(yīng)濃度的溫膽湯劑或艾司唑侖片溶液，對(duì)照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。最后1次給藥干預(yù)12 h后，眼眶采血0.5~1 ml，離心制備血清。100 mg/kg戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，收集小鼠腦組織，于-80℃冰箱保存。

1.2.3 流式檢測(cè)小鼠腦組織ROS水平取出小鼠腦組織，用含5%雙抗的PBS漂洗3次，置于200目細(xì)胞篩中，用玻璃杯輕輕研磨腦組織，研碎后用DMEM沖洗，經(jīng)過細(xì)胞篩獲得細(xì)胞懸液。吸管吹打細(xì)胞懸液后，175 g離心5 min，棄上清，重復(fù)清洗2次，PBS重懸細(xì)胞后備用。收集細(xì)胞，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，于5%CO2、37℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，為使探針和細(xì)胞充分接觸，每隔3~5 min顛倒混勻1次。孵育20 min后，無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞去除多余的DCFH-DA，重復(fù)3次。收集各組細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，NovoCyte分析軟件對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.4 生化檢測(cè)小鼠血清和腦組織GSH-PX、SOD、MPO活性及GSH、MDA濃度根據(jù)試劑盒說明書，分別檢測(cè)小鼠血清和腦組織中GSH-PX、SOD、MPO活性及GSH、MDA濃度。

1.2.5 ELISA檢測(cè)小鼠血清和腦組織IL-6、TNF-α及IL-1β濃度根據(jù)ELISA試劑盒說明書，分別檢測(cè)小鼠血清和腦組織中炎癥因子IL-6、TNF-α及IL-1β濃度。

1.2.6 Western blot檢 測(cè) 小 鼠 腦 組 織NF-κB及p-NF-κB蛋白表達(dá)將腦組織剪碎，置于冰上使用裂解液裂解，4℃、12000 g離心15 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA定量結(jié)果上樣，12% SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，加入1∶1000稀釋后一抗（NF-κB、p-NFκB、GAPDH），室溫孵育1 h后，PBS洗滌3次，每次5 min。加入1∶20 000稀釋后HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后，PBS洗滌3次，每次5 min。曝光顯影，并進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析法進(jìn)行多組間差異分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫膽湯方劑改善失眠小鼠一般癥狀與對(duì)照組相比，模型組小鼠精神狀態(tài)及毛發(fā)較差，飲食量減少，體質(zhì)量顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠以上癥狀有所改善，體質(zhì)量顯著增加（P<0.05），且高劑量組體質(zhì)量改善情況顯著高于低劑量組（P<0.05），見圖1。

圖1 小鼠處死前體質(zhì)量比較Fig.1 Comparison of mice weight before death

2.2 溫膽湯方劑降低失眠小鼠腦組織中ROS水平模型組小鼠腦組織ROS水平較對(duì)照組顯著升高（P<0.05）。相較于模型組小鼠，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠腦組織ROS水平明顯降低（P<0.05），且溫膽湯高濃度組降低效果顯著高于低劑量組（P<0.05），見圖2。

圖2 小鼠腦組織ROS水平Fig.2 ROS levels in brain tissues of mice

2.3 溫膽湯方劑緩解失眠小鼠氧化應(yīng)激與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清和腦組織中GSH-PX、SOD和GSH酶活顯著降低（P<0.05），MPO及MDA濃度均顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠血清和腦組織中GSHPX、SOD和GSH酶活顯著升高（P<0.05），MPO及MDA濃度顯著降低（P<0.05），見表1、表2。

表1 小鼠血清中氧化應(yīng)激因子水平（±s）Tab.1 Levels of oxidative stress factors in serum of mice（±s）

表1 小鼠血清中氧化應(yīng)激因子水平（±s）Tab.1 Levels of oxidative stress factors in serum of mice（±s）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs model；3）P<0.05 vs L-density.

Groups Control Model L-density H-density Estazolam tablets GSH-PX/（U·ml-1）194.70±14.29 123.03±6.021）151.40±4.092）167.27±7.642）3）172.24±2.292）3）SOD/（U·ml-1）111.88±13.22 25.38±4.491）40.24±3.032）68.17±1.952）3）70.78±3.672）3）GSH/（μmol·L-1）64.04±2.05 20.46±1.971）35.27±3.192）41.94±1.692）3）49.56±1.122）3）MPO/（U·L-1）13.40±0.70 39.31±2.741）29.52±2.292）23.18±1.492）3）20.09±0.672）3）MDA/（nmol·ml-1）20.72±1.82 84.44±2.251）67.11±5.822）56.30±2.392）3）53.53±2.932）3）

表2 小鼠腦組織中氧化應(yīng)激因子水平（±s）Tab.2 Levels of oxidative stress factors in brain tissues of mice（±s）

表2 小鼠腦組織中氧化應(yīng)激因子水平（±s）Tab.2 Levels of oxidative stress factors in brain tissues of mice（±s）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs model；3）P<0.05 vs L-density.

Groups Control Model L-density H-density Estazolam tablets GSH-PX/（U·mgprot-1）193.79±9.81 119.04±2.391）151.68±5.952）164.70±4.342）3）174.48±2.732）3）SOD/（U·mgprot-1）117.13±8.33 26.90±6.951）42.21±3.622）60.77±1.872）3）74.20±3.872）3）GSH/（μmol·gprot-1）67.69±3.88 20.56±1.071）36.53±1.182）42.27±3.282）3）53.89±2.572）3）MPO/（U·gwet weight-1）13.34±0.53 41.08±2.291）30.10±1.152）21.09±0.312）3）20.69±0.162）3）MDA/（nmol·mgprot-1）19.89±0.93 86.00±3.211）67.06±1.752）48.53±5.272）3）45.43±8.272）3）

2.4 溫膽湯方劑降低失眠小鼠炎癥細(xì)胞因子水平與對(duì)照組相比，失眠模型小鼠血清及腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，溫膽湯低、高濃度組及艾司唑侖片組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β濃度顯著降低（P<0.05），且溫膽湯高濃度組和艾司唑侖片組效果更顯著（P<0.05），見圖3。

圖3 小鼠血清（A）及腦組織（B）炎癥因子濃度Fig.3 Concentration of inflammatory cytokines in serum（A）and brain tissue（B）of mice

2.5 溫膽湯方劑抑制失眠小鼠腦組織NF-κB蛋白磷酸化水平模型組小鼠腦組織p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加（P<0.05），溫膽湯及艾司唑侖片干預(yù)后小鼠腦組織中p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著降低（P<0.05），且隨溫膽湯濃度的增加，其相對(duì)表達(dá)量降低更為顯著（P<0.05），見圖4。

圖4 小鼠腦組織中p-NF-κB蛋白表達(dá)量Fig.4 Expression of p-NF-κB protein in brain tissue of mice

3 討論

失眠的治療方法主要分為2種，藥物治療和非藥物治療（包括認(rèn)知行為治療和心理治療、替代治療方法），臨床上藥物干預(yù)多為唑吡坦、埃索匹克隆和扎萊普隆、褪黑激素等，但西藥干預(yù)會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生［10］。中醫(yī)藥治療失眠療效顯著，對(duì)失眠發(fā)病過程的理解也十分獨(dú)到，引起失眠的病位包括心、肝、脾等，影響因素有瘀血、痰等，二陳湯、溫膽湯等則以化痰理氣為特點(diǎn)，在治療失眠上取得了較好的療效［11］。溫膽湯相較于臨床上常用的抗失眠藥物，作用溫和，無不良反應(yīng)及耐藥性［12］。本研究采用溫膽湯治療睡眠剝奪小鼠，其毛發(fā)、飲食及體質(zhì)量逐漸趨于正常，提示溫膽湯能改善睡眠剝奪引起的相關(guān)癥狀。

KOLESNIKOVA等［13］研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后失眠婦女的脂質(zhì)過氧化過程和抗氧化防御系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯。王新源等［14］檢測(cè)失眠癥患者血清中GSH-PX、MDA、SOD等活性水平發(fā)現(xiàn)失眠癥患者氧化應(yīng)激水平顯著高于健康人，提示氧化應(yīng)激可能參與了失眠癥的發(fā)病過程。在本次研究中，睡眠剝奪小鼠腦組織ROS水平顯著升高，血清及腦組織中MPO及MDA濃度升高，GSH-PX、SOD和GSH酶活顯著降低，提示小鼠氧化應(yīng)激嚴(yán)重，與上述研究結(jié)果一致。睡眠障礙會(huì)導(dǎo)致多種醫(yī)學(xué)問題，包括認(rèn)知障礙、免疫功能下降、代謝失衡等［15］。臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)失眠患者炎癥因子水平顯著高于正常對(duì)照者［16］。SU等［17］研究也顯示失眠剝奪大鼠腦內(nèi)的TNF-α和IL-6水平顯著增加；本次研究結(jié)果與之一致，睡眠剝奪小鼠血清和腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高。失眠會(huì)導(dǎo)致與心腦血管疾病、糖尿病等慢性疾病相關(guān)的炎癥標(biāo)志物增加，NF-κB作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子之一，也會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量增多［18］。王甜甜［19］發(fā)現(xiàn)溫膽湯對(duì)胰島素抵抗大鼠的改善作用可能是通過減輕大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善炎癥狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)的。因此，推測(cè)溫膽湯可改善機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎癥水平，但對(duì)于失眠是否有相應(yīng)作用尚不可知，故本研究采用低、高濃度溫膽湯治療睡眠剝奪小鼠，檢測(cè)到小鼠血清及腦組織中MPO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著低于模型組，腦組織中NF-κB磷酸化水平降低，GSH-PX、SOD和GSH酶活升高，提示溫膽湯可調(diào)理失眠小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎癥水平。

綜上所述，溫膽湯可明顯改善睡眠剝奪小鼠精神萎靡、體質(zhì)量減輕等癥狀，其作用可能與降低小鼠氧化應(yīng)激和炎癥水平有關(guān)。眾所周知，中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑治療的特點(diǎn)，所以本文研究結(jié)果僅為溫膽湯治療失眠的部分作用，后續(xù)將從其他方面進(jìn)行探討，希望能提供更多溫膽湯的藥理作用，為其臨床治療失眠奠定基礎(chǔ)。