應(yīng)用整合藥理學(xué)方法探討甘姜苓術(shù)湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制①

陳少波 位佳琳 何蕊邢春來 初洪波 位鴻

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春130117）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性疾病，主要表現(xiàn)為慢性對稱性關(guān)節(jié)炎［1-2］。一般認(rèn)為RA是感染引發(fā)的自身免疫反應(yīng)，臨床研究表明RA發(fā)生與環(huán)境、家族遺傳、感染以及性激素失調(diào)有關(guān)，特征為關(guān)節(jié)滑膜組織、軟骨和骨骼炎癥變化，導(dǎo)致以滑膜炎為基礎(chǔ)的關(guān)節(jié)病變，晚期可引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形和功能嚴(yán)重受損，最終導(dǎo)致殘疾和死亡［3-5］。RA可發(fā)生于任何年齡，60歲以上患者明顯多于30歲以下者，女性發(fā)病率普遍高于男性，嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量［6］。臨床上RA治療方式主要為糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥等，雖緩解疼痛效果明顯，但副作用較大，故采用傳統(tǒng)中藥進(jìn)行多靶點治療是更好的選擇［7-9］。

甘姜苓術(shù)湯（Ganjianglingzhu Decoction，GJLZ）即腎著湯，出自漢代張仲景所著《金匱要略》，由甘草、白術(shù)、干姜、茯苓四味藥材組成［10］。近年研究表明，GJLZ應(yīng)用廣泛，除可治療腎著?。ê疂窀街I經(jīng)而見腰部寒冷沉重的病證），在RA、寒濕腰痛、膝骨關(guān)節(jié)痛等臨床治療方面也有較好療效［11］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)對疾病發(fā)展過程進(jìn)行闡釋，再采用一系列網(wǎng)絡(luò)觀念認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用，可通過尋找藥物和疾病間有意義的共同靶點系統(tǒng)揭示中藥產(chǎn)品在分子水平上的治療機(jī)制，對RA防治具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義，為臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)［12］。

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及體外實驗結(jié)合的模式，更全面地研究藥物作用機(jī)制［13］。應(yīng)用超高液相色譜-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF/MS）指認(rèn)出復(fù)方中關(guān)鍵成分，再采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對GJLZ的成分靶點和疾病靶點、生物學(xué)過程及途徑進(jìn)行預(yù)測，采用CCK-8和ELISA實驗驗證小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）的炎癥反應(yīng)，初步闡明GJLZ作用于RA的機(jī)制，為RA治療提出新的見解，為臨床深入研究RA提供新思路［14］。

1 材料與方法

1.1 材料干姜、茯苓、白術(shù)、甘草經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)肖井雷教授鑒定均符合規(guī)定；對照品甘草苷（批號：111610-201607）、甘草酸（批號：111847-201505）、β-谷甾醇（批號：110851-201608）、常春藤皂苷元（批號：111733-201205）、麥角甾醇（批號：111845-201604）、月桂酸（批號：111774-201602）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號：111976-201501）、棕櫚酸（批號：111733-201607）均購于中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>95%；乙腈（色譜純，4 L，美國Thermo Fisher Scientific公司）；小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫；胎牛血清（美國Clark）；青霉素-鏈霉素雙抗（100 ml，定州百克賽斯生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（500 ml，美國Gibco）；CCK-8溶液（500 T，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；脂多糖（LPS，上海懋康生物科技有限公司）；VEGF、IL-17 ELISA檢測試劑盒（鼠源，48 T，中國黃石科研）。

1.2 方法

1.2.1 藥材提取和溶液制備按處方量取甘草28.0 g、干姜56.0 g、茯苓56.0 g、白術(shù)28.0 g（共168.0 g），加1 000 ml水浸泡30 min，武火煎煮至沸騰，轉(zhuǎn)文火煎煮至600 ml，冷凍干燥，粉碎，得到提取物粉末。對照品溶液制備：分別稱取各對照品約2.0 mg置于10 ml量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到單一對照品溶液（0.2 mg/ml）。分別精密吸取各對照品溶液適量，混合，得到混合對照品溶液（2 μg/ml）。供試品溶液制備：稱取粉末約0.1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶，加70%乙醇8 ml，超聲處理40 min（250 W，40 kHz），放冷，70%乙醇水溶液稀釋至刻度定容，搖勻，離心，0.45 μm濾膜過濾［15］。

1.2.2 UPLC-Q-TOF/MS篩選有效成分采用UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行有效成分篩選，色譜柱：OOD-4475-AN C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；波長：237 nm；流速：0.3 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：8 μl；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫見表1。采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子檢測模式，噴霧電壓3.8 kV，氣體溫度350℃，霧化器40psig，干燥氣體（氮氣）流速為10.0 L/min，碎片器175 V，撇油器電壓65 V，全掃描范圍m/z50~1 000。根據(jù)對照品鑒定精確相對分子量及保留時間確定化學(xué)成分。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

1.2.3 藥物靶點和疾病靶點收集取1.2.2中獲取的成分輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）和SwissTargetPrediction平臺（http：//swisstargetprediction.ch/）中，以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似度（DL）≥0.18為條件，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，收集成分靶點，篩重，獲得藥物靶點。以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，在Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）中進(jìn)行檢索，獲得靶點，篩重，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化成基因名稱，獲得疾病靶點。

1.2.4 疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將疾病、藥物成分、靶點導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，以三者為節(jié)點，選用Merge功能，相互關(guān)系分別用邊相連，構(gòu)建“疾病-藥物成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。為進(jìn)一步研究GJLZ治療RA的靶點，將RA和GJLZ蛋白靶點上傳至venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）軟件，繪制藥物靶點和疾病靶點韋恩圖（veen），得到成分和疾病的交集靶點，采用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建“疾病-藥物成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 交集靶點的GO生物功能分析和KEGG通路富集分析將1.2.3獲得的交集靶點輸入至String Versio軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape3.8.0軟件對其進(jìn)行可視化分析。將得到的共同靶標(biāo)導(dǎo)入R語言軟件，基于GO和KEGG分析，結(jié)合富集計算（GO：Count≥2，P≤0.05；KEGG：P≤0.01）確定交集靶點參與的生物學(xué)過程和通路，根據(jù)P值進(jìn)行降序排列，選擇前20位生物學(xué)功能和通路，采用Cyto?scape3.8.0軟件繪制“疾病-藥物成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖，闡明核心靶點在信號通路中的作用，得到GJLZ抗RA的主要作用通路及初步機(jī)制。

1.2.6 分子對接驗證選取生物利用度較高的3個成分與3個核心靶點進(jìn)行對接，將Gingerenone-A、Glycyrol、Gingerenone-B輸 入PubChem［PubChem（nih.gov）］平臺，下載化合物2D結(jié)構(gòu)，通過Autodock vina 1.1.2軟件將其轉(zhuǎn)化為PDBQT格式配體。從Protein DataBank（RCSB PDB：Homepage）網(wǎng)站獲取小分子受體，采用Pymol軟件去除水和有機(jī)配體，采用Autodock vina 1.1.2軟件對受體蛋白和小分子進(jìn)行對接。結(jié)合能<0時表明配體和受體親和力較強(qiáng)，選擇親和力最好的作為對接構(gòu)象，Pymol分析作圖。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物毒性檢測RAW264.7細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2。將對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞懸液接種于96孔板（8×104個/ml），100 μl/孔，設(shè)置對照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、GJLZ組（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/ml），各組設(shè)6個復(fù)孔，加藥培養(yǎng)24 h，加入10 μl CCK-8溶液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔吸光度（A）值。

1.2.8 ELISA檢測細(xì)胞因子IL-17、VEGF含量將RAW264.7細(xì)胞懸液接種于6孔板（1×105個/ml），2 ml/孔，貼壁后設(shè)置對照組（NOR）、LPS模型組（MOL）、LPS+GJLZ低、中、高劑量組，培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)基，離心（2 500 r/min），取上清，采用ELISA試劑盒檢測IL-17、VEGF含量。

2 結(jié)果

2.1 GJLZ化學(xué)成分鑒定與確認(rèn)將液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果與化學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對［16］，共得到15種化學(xué)成分（東莨菪醇、月桂酸、甘草苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、棕櫚酸、姜烯酮-C、甘草酸、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、甘草素B、麥角甾醇、姜烯酮-A、甘草酚、姜烯酮-B、12-姜辣素），將15種成分的出峰時間、化學(xué)名稱、分子式、分子量及加合物進(jìn)行匯總，結(jié)果見附圖1、附表1（www.immune99.com）。

2.2 藥物靶點和疾病靶點收集通過Swiss Target Prediction和TCMSP數(shù)據(jù)庫得到15種化學(xué)成分靶點，篩選后（OB>30，DL>0.18）得到177個成分靶點。從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取RA疾病靶點，篩選后（置信度得分>5.0分）得到2 048個疾病靶點，置信度得分>5.0分表明該靶點與RA密切相關(guān)（圖1A）。

2.3 疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及PPI構(gòu)建將篩選出的15種成分、疾病、相關(guān)靶點構(gòu)建“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1C）。為進(jìn)一步研究RA，采用R軟件制作成分靶點和疾病靶點veen圖，得到GJLZ和RA交集靶點19個（圖1A）。采用Cytoscape3.8.0軟件繪制“疾病-成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行可視化分析（圖1C）。通過網(wǎng)絡(luò)圖可觀察到15個成分中甘草素B連接12個交集靶點，甘草酚連接8個交集靶點，姜烯酮-A、姜烯酮-B、姜烯酮-C分別連接5個交集靶點，12-姜辣素連接2個交集靶點，其余成分連接1個或1個以上靶點。PPI顯示34個節(jié)點，144條邊，置信度得分最高的（置信度得分>0.9分）節(jié)點包括AKT1、HSP90AA1、NOS3、KDR、MAPK14，均高度參與細(xì)胞炎癥、細(xì)胞周期及增殖過程（圖1B）。

圖1 GJLZ調(diào)控RA的靶基因分析Fig.1 Analysis of GJLZ target genes regulating RA

2.4 GO分析和KEGG分析GO功能分析根據(jù)P<0.05篩選出前20條結(jié)果，繪制條形圖進(jìn)行對比（圖2A），交集靶標(biāo)主要與炎癥、增殖、腫瘤及生長周期相關(guān)，交集靶點主要參與核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ一般轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合、一般轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合等生物學(xué)功能。與交集靶基因連接密切的有核受體活性及配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性，分別連接5個靶點，類固醇激素受體活性與4個靶點相連，其余生物功能分別與3個或3個以上靶點基因相連，同一個靶點蛋白也同時參與多個生物學(xué)功能。

KEGG通路分析根據(jù)P<0.05篩選出前20條有顯著意義的通路，繪制KEGG條形圖（圖2B），主要包括化學(xué)致癌作用-受體激活、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、催乳素信號通路、IL-17信號通路、輔助性T細(xì)胞17細(xì)胞分化、cGMP-PKG信號通路、PI3K-Akt信號通路等，以上通路主要與細(xì)胞炎癥、增殖、生長周期有關(guān)。NOS3參與5條通路，HSP90AA1參與4條通路，KDR和MAPK14分別參與3條通路，其余靶點參與1條或1條以上通路（圖2B）。

2.5 分子對接網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析GJLZ治療RA的相關(guān)基因，NOS3、HSP90AA1和KDR連接通路最多，是最重要的蛋白靶點，對“藥物成分、疾病、交集靶點”繪制的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，姜烯酮A、姜烯酮B、甘草酚排名較高，且姜烯酮A與HSP90AA1、姜烯酮B與NOS3、甘草酚與KDR相關(guān)，故分別以這3種成分為配體，蛋白靶點為受體進(jìn)行剛性對接，姜烯酮B和NOS3的對接能量為-7.8 kJ/mol，甘草酚和KDR的對接能量為-7.5 kJ/mol，姜烯酮A和HSP90AA1的對接能量為-3.6 kJ/mol，結(jié)合能均為負(fù)值，表明結(jié)合活性好（附表2、附圖2，www.immune99.com）。

圖2 核心靶點的GO分析和KEGG分析圖Fig.2 GO analysis and KEGG analysis diagram of core target

2.6 體外細(xì)胞實驗結(jié)果與正常組相比，GJLZ（12.5、25、50、100 μg/ml）組細(xì)胞活力增強(qiáng)，且隨藥物濃度增加對細(xì)胞無毒害作用。故選擇GJLZ（25、50、100 μg/ml）低、中、高3個劑量組進(jìn)行實驗（圖3）。ELISA測定細(xì)胞炎癥因子證實網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測，即GJLZ通過抑制炎癥因子釋放治療RA。與空白組相比，LPS刺激下，模型組細(xì)胞中IL-17、VEGF表達(dá)水平明顯升高；與模型組相比，藥物組以濃度依賴的方式抑制IL-17、VEGF產(chǎn)生，表明藥物治療后，促炎因子水平下調(diào)，阻止RA進(jìn)展（圖4）。

圖3 不同濃度GJLZ對細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GJLZ on cell viability

圖4 GJLZ對VEGF、IL-17表達(dá)的影響Fig.4 Effect of GJLZ on expressions of VEGF and IL-17

3 討論

RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與炎癥、非炎癥性免疫細(xì)胞、細(xì)胞炎癥因子及受體信號通路有關(guān)［17-18］。文獻(xiàn)報道，GJLZ可用于RA治療，但機(jī)制尚不清楚，故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測并初步探討GJLZ治療RA的機(jī)制。

本研究質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GJLZ含有15種化學(xué)成分，包含甘草酚、姜烯酮-A、姜烯酮-B等。甘草酚是一種新型免疫抑制劑，CIA模型研究顯示，甘草酚通過調(diào)節(jié)固有免疫和降低IL-17表達(dá)抑制RA發(fā)展［19］。SUK等［20］用肥胖小鼠進(jìn)行體內(nèi)體外實驗，結(jié)果表明姜烯酮-A可預(yù)防肥胖，還可通過降低促炎因子活性抑制巨噬細(xì)胞炎癥。綜上，復(fù)方中的關(guān)鍵成分可通過作用于不同炎癥因子和信號通路抑制炎癥發(fā)生，故預(yù)測GJLZ在RA治療方面療效顯著。

通過venny軟件獲得韋恩圖，顯示藥物和疾病交集靶點為19個，將藥物成分、疾病和交集靶點繪制網(wǎng)絡(luò)圖后得到GJLZ治療RA的關(guān)鍵成分。根據(jù)質(zhì)譜分析得到的15個化學(xué)成分，最終確認(rèn)GJLZ和RA共有蛋白靶點34個，通過String軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，分析高度連接節(jié)點，其中AKT1、HSP90AA1、NOS3、KDR、MAPK14的置信度得分>0.9分，與其他靶點蛋白相互作用顯著，表明這些靶點在RA生物學(xué)過程中非常重要。GO和KEGG通路分析顯示，GJLZ治療RA的靶點主要涉及VEGF、IL-17、Th17細(xì)胞分化、cGMP-PKG、PI3K-Akt等信號通路。VEGF、IL-17是重要的炎癥因子，可通過體內(nèi)誘導(dǎo)血管增生和增加內(nèi)皮促炎因子產(chǎn)生導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。PI3K-Akt是經(jīng)典的信號通路，IL-17通過PI3K-Akt途徑并以此作為媒介引發(fā)RA［21-22］。CIA大鼠研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)隨關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高而增加［23］。

分子對接結(jié)果表明，細(xì)胞炎癥相關(guān)核心基因分子結(jié)合能均小于-3 kJ/mol，表明成分和蛋白靶點對接構(gòu)象較好，結(jié)合活性較好，核心成分可直接與AKT1、HSP90AA1、KDR、NOS3相互作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥和增殖，以進(jìn)一步篩選GJLZ治療RA的相關(guān)機(jī)制［24］。研究表明，AKT1在CIA小鼠體內(nèi)外實驗中均為抑制炎癥的直接靶標(biāo)，可通過促進(jìn)AKT1表達(dá) 減 輕CIA小 鼠 關(guān)節(jié) 炎癥 和 損 傷［25］。ZAICHKO等［26］采用ELISA檢測36例女性RA患者血清NOS3濃度，結(jié)果顯示患者血清中NOS3含量顯著降低，NOS3與炎癥因子分泌呈負(fù)相關(guān)。KDR在血管生成和炎癥中起重要作用，PCR和ELISA結(jié)果顯示RA患者KDR水平顯著高于健康志愿者［27-28］。HSP90AA1核心蛋白與NOS3相關(guān)，均參與破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝過程，與RA病理生理過程密切相關(guān)［29-30］。WANG等［31］發(fā)現(xiàn)，HSP90AA1是參與炎癥的核心基因，可通過IL-17和TNF通路治療疾病，且是通過VEGF通路抑制相關(guān)疾病的重要蛋白［32］。ZHU等［33］通過大鼠實驗結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證明，NOS3、TNF等治療靶點通過IL-17、RA相關(guān)通路治療疾病。核心蛋白間相互作用表現(xiàn)出高度連通性，直接或間接改變基因表達(dá)，最終抑制炎癥發(fā)生。

經(jīng)過質(zhì)譜鑒定、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測及分子模擬對接初步驗證后，通過CCK-8和ELISA進(jìn)一步證明GJLZ可顯著下調(diào)LPS模型細(xì)胞IL-17及VEGF表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，阻止RA發(fā)展。SUN等［34］通過ELISA檢測IL-17含量，結(jié)果表明與對照組相比，RA高活動組和低活動組IL-17等炎癥因子表達(dá)顯著上調(diào)［35-36］。臨床Meta分析發(fā)現(xiàn)，VEGF是血管生成和炎癥的有效介質(zhì)，與RA發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［37］。

綜上，本研究通過UPLC-Q-TOF/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對GJLZ治療RA的機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，通過分子對接進(jìn)行初步驗證，再用細(xì)胞實驗進(jìn)一步驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GJLZ治療RA的機(jī)制與抑制IL-17和VEGF表達(dá)有關(guān)，為臨床治療RA提供了理論依據(jù)，為更好地研究GJLZ治療RA提供了科學(xué)基礎(chǔ)，具有重要研究價值。