大豆分離蛋白-葡聚糖非共價(jià)聚合物結(jié)構(gòu)及功能性研究

朱秀清 杜曉倩 胡 淼 劉冠男 齊寶坤 李 楊,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院， 哈爾濱 150023)

0 引言

大豆分離蛋白(Soybean protein isolates, SPI)，是一種具有高蛋白含量的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，可直接提供人體所需氨基酸，與動(dòng)物蛋白相比，價(jià)格優(yōu)廉、原料豐富[1]，具有降低患心臟病和癌癥等慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2]。但是，天然SPI的溶解性、乳化性、抗氧化性等功能性質(zhì)與動(dòng)物蛋白相比仍存在較大差距，因此需采取適當(dāng)方法對(duì)其進(jìn)行改性以滿足生產(chǎn)和加工需要。葡聚糖(Dextran, Dex)是一種非離子型表面活性劑，具有良好的水溶性、無(wú)毒性和生物相容性[3]，可作為增稠劑、乳化劑應(yīng)用于食品領(lǐng)域。作為一種天然生物高分子化合物，葡聚糖可與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。

蛋白質(zhì)和葡聚糖之間的相互作用可以改變復(fù)合體系中蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。已有研究證明，中性條件下，SPI和Dex可以通過(guò)美拉德反應(yīng)形成SPI-Dex接枝物，顯著提高SPI的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性[4]。文獻(xiàn)[5]利用干熱糖基化對(duì)SPI進(jìn)行改性，發(fā)現(xiàn)糖化后SPI的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性均明顯提高。目前，關(guān)于Dex改性SPI的研究主要集中在美拉德共價(jià)復(fù)合體系，然而，美拉德反應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程很難控制，且容易導(dǎo)致有害物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，SPI-Dex非共價(jià)復(fù)合體系是一個(gè)好的研究方向，且混合體系中SPI和Dex之間的相互作用以及Dex添加量對(duì)SPI結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響研究鮮有報(bào)道。

本文選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Dex(1%、3%、5%、7%)與SPI形成非共價(jià)聚合物，利用熒光光譜、紫外可見(jiàn)光譜、傅里葉紅外光譜等技術(shù)表征SPI-Dex非共價(jià)聚合物的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)分析聚合物的粒徑、表面疏水性、濁度、溶解性、乳化性以及抗氧化性，以明確混合體系中SPI和Dex之間的相互作用以及Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)SPI結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，東農(nóng)-42；葡聚糖T10，上海源葉生物科技有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸鹽(1-anilino-8-naphthalenesulfonate)，美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，北京新光化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器，江蘇金城國(guó)勝儀器廠；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；Allegra64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Mastersizer 2000型粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；RF-6000型熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1SPI制備

SPI的制備根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法并稍作修改。將脫脂大豆粉以液料比10 mL/g分散在去離子水中形成懸浮液并攪拌使其充分溶解。使用2 mol/L NaOH溶液將懸浮液的pH值調(diào)節(jié)至8.0。室溫(25℃)下攪拌2 h后，將懸浮液在4℃下9 000g離心30 min，以去除不溶性物質(zhì)。收集上清液，用1 mol/L HCl溶液將其pH值調(diào)節(jié)至4.5，在室溫下靜置1 h，以誘導(dǎo)SPI在等電點(diǎn)處沉淀。然后將其在4℃下6 500g離心30 min，得到大豆蛋白沉淀物。沉淀物用去離子水水洗3次后，調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，并在4℃下5 000g離心5 min。最后收集上清液，于冰箱中儲(chǔ)存24 h后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到SPI粉末。

1.3.2SPI-Dex聚合物制備

室溫下，稱取2 g的SPI分散于100 mL去離子水中，攪拌2 h后于冰箱中靜置12 h，確保SPI完全水化。將不同質(zhì)量的葡聚糖粉末加入到SPI溶液中，磁力攪拌確保充分溶解，使得混合液中SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、3%、5%和7%。在冰箱中儲(chǔ)存24 h后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到大豆分離蛋白-葡聚糖聚合物。

1.3.3微觀結(jié)構(gòu)分析

使用SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)SPI/SPI-Dex聚合物的表面形貌進(jìn)行觀察。將冷凍干燥后得到的SPI/SPI-Dex聚合物樣品均勻平攤在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金處理，在加速電壓5 kV下觀察樣品。

1.3.4內(nèi)源熒光光譜分析

采用RF-6000型熒光分光光度計(jì)測(cè)定SPI/SPI-Dex聚合物(1 mg/mL)的內(nèi)源熒光光譜。參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，掃描波長(zhǎng)范圍300～500 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm。

1.3.5傅里葉紅外光譜分析

稱取冷凍干燥后得到的SPI/SPI-Dex聚合物1 mg與溴化鉀100 mg進(jìn)行研磨、混勻、壓片，然后通過(guò)IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜(FTIR)測(cè)定。參數(shù)設(shè)置如下:分辨率4 cm-1，掃描波長(zhǎng)范圍400～4 000 cm-1，掃描頻率64次/s。

1.3.6紫外可見(jiàn)光譜分析

采用UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行紫外吸收光譜采集。參數(shù)設(shè)置如下：測(cè)定速度為中速，分辨率0.5 nm，測(cè)定波長(zhǎng)范圍200～400 nm。

1.3.7SDS-PAGE

SPI/SPI-Dex聚合物的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析參考文獻(xiàn)[7]，并稍作修改。分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%和5%。將凍干后的SPI/SPI-Dex聚合物以4 mg/mL的質(zhì)量濃度重新溶解在去離子水中制備樣品溶液，然后將其與上樣緩沖液混合均勻后煮沸90 s，冷卻至室溫后進(jìn)行上樣處理。初始的電泳電壓設(shè)置為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V；電泳結(jié)束后，取出膠片加入考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行30 min的染色處理，然后再用脫色液進(jìn)行脫色以便于后續(xù)分析。

1.3.8粒徑測(cè)定

利用Mastersizer 2000型粒度儀測(cè)定SPI/SPI-Dex聚合物的粒徑分布。將凍干的SPI/SPI-Dex聚合物以10 mg/mL的質(zhì)量濃度復(fù)溶在去離子水中，室溫下攪拌2 h使其充分溶解，并在測(cè)量之前進(jìn)行適當(dāng)稀釋。參數(shù)設(shè)置如下：測(cè)定溫度25℃，平衡時(shí)間2 min，測(cè)定次數(shù)3次，相對(duì)折射率1.095。

1.3.9濁度測(cè)定

SPI/SPI-Dex聚合物的濁度參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行適當(dāng)修改。用UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)記錄其在600 nm處的吸光度，即為濁度。

1.3.10表面疏水性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[9]，采用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸鹽)熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行表面疏水性的測(cè)定。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)配制不同濃度的蛋白質(zhì)溶液(質(zhì)量濃度0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL)和8.0 mmol/L的ANS溶液。取20 μL ANS溶液加到4.0 mL蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻，避光反應(yīng)15 min，迅速測(cè)定混合液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別是390、470 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)樣品質(zhì)量濃度制圖，曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)H0。

1.3.11溶解性測(cè)定

溶解性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]的方法并作適當(dāng)修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線以牛血清蛋白(0.5 mg/mL)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行繪制，通過(guò)計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.286 7x+0.107 3，R2=0.996。將凍干SPI/SPI-Dex聚合物以1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度重新溶解在去離子水中，室溫下攪拌2 h使其充分溶解，12 000g離心15 min。然后取上清液，并與BCA工作液混合，37℃水浴15～30 min。用分光光度計(jì)測(cè)定其在562 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)的溶解度表示為可溶性蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度百分比。

1.3.12乳化性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，采用濁度法測(cè)定SPI/SPI-Dex聚合物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性，并作適當(dāng)修改。制備5 mg/mL的SPI/SPI-Dex溶液作為水相，玉米油為油相，油水體積比例為1∶9，用高速剪切均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min形成乳狀液，立即從距離乳狀液底部0.5 cm處取50 μL新鮮乳狀液以液料比100 mL/g分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中。在旋渦混合器中振蕩30 s后,用UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在500 nm處測(cè)定吸光度，記作A0，以相同的方法取均質(zhì)后靜置10 min的乳狀液重復(fù)上述步驟，其吸光度記作A10。乳化活性指數(shù)以及乳化穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

DF——稀釋倍數(shù)，取100

θ——乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)，%

L——比色皿厚度，cm

C——制備乳液所用蛋白溶液中的蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

1.3.13DPPH自由基清除率

參考文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定了DPPH自由基清除活性，并作略微修改。將凍干的SPI/SPI-Dex聚合物重新溶解在去離子水中，以獲得2.0 mg/mL的質(zhì)量濃度。取2 mL樣品溶液，并加入2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，離心取上清液后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，DPPH自由基清除率計(jì)算公式為

(3)

式中As——DPPH樣品(即2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液混合)的吸光度

Ac——對(duì)照樣品(即2 mL樣品溶液與2 mL乙醇溶液混合)的吸光度

Ab——空白DPPH(即2 mL乙醇溶液與2 mL DPPH溶液混合)的吸光度

1.3.14數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 23.0對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(顯著水平為P<0.05)。采用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微觀結(jié)構(gòu)分析

掃描電鏡是一種用于觀察和分析物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的有效手段,有助于了解樣品的可能結(jié)構(gòu)形成機(jī)制。圖1是SPI及SPI-Dex聚合物的微觀結(jié)構(gòu)圖。如圖1所示，單獨(dú)SPI由眾多光滑致密的無(wú)規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)組成，這與文獻(xiàn)[13]在超聲對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的影響研究中的結(jié)果相吻合。與SPI相比，SPI-Dex聚合物表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)差異，無(wú)規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)明顯變小，同時(shí)出現(xiàn)了孔洞結(jié)構(gòu)。這可能是因?yàn)榛旌象w系中SPI、Dex二者之間發(fā)生相互作用形成了可溶性聚合物，從而使得SPI的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。

圖1 SPI、SPI-Dex的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of SPI and SPI-Dex

2.2 內(nèi)源熒光光譜

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光是由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸引起的。主要由于色氨酸殘基貢獻(xiàn)的蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光對(duì)環(huán)境條件敏感，因此常被用作蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的指標(biāo)[14]。圖2顯示了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Dex對(duì)SPI-Dex混合體系色氨酸熒光強(qiáng)度的影響。如圖2所示，與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的熒光強(qiáng)度顯著降低，并且隨著Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，熒光強(qiáng)度持續(xù)下降，說(shuō)明SPI發(fā)生了熒光猝滅，產(chǎn)生了疏水相互作用。這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[11]通過(guò)美拉德反應(yīng)偶聯(lián)葡聚糖改善花生分離蛋白功能特性的報(bào)道一致，可以歸因于結(jié)合在蛋白質(zhì)上的多糖鏈的屏蔽作用。SPI-Dex聚合物中的色氨酸殘基更容易被包圍在疏水環(huán)境中，混合體系中Dex的加入使蛋白質(zhì)形成了更緊密的三級(jí)構(gòu)象[15]。此外，從圖2可以看到，與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物最大熒光發(fā)射峰的位置發(fā)生了微弱的藍(lán)移，這說(shuō)明混合體系中Dex與SPI的疏水性氨基酸發(fā)生了相互作用，使得它們所處的微環(huán)境極性降低。

圖2 SPI、SPI-Dex的內(nèi)源熒光光譜Fig.2 Intrinsic fluorescence spectra of SPI and SPI-Dex

2.3 傅里葉變換紅外光譜

作為鑒別物質(zhì)和分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效手段，傅里葉變換紅外光譜已被廣泛用于各種物質(zhì)的定性鑒定和定量分析，以及研究分子間和分子內(nèi)部的相互作用[16]。圖3顯示了SPI與SPI-Dex聚合物的傅里葉變換紅外光譜。如圖3所示，與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物在2 500～3 000 cm-1范圍的峰相對(duì)較寬，表明混合體系中SPI和Dex之間發(fā)生了相互作用，因此導(dǎo)致峰形狀的改變。同時(shí)與SPI相比，SPI-Dex聚合物在1 020 cm-1處出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收，這可能是由于混合體系中Dex的添加引起了SPI結(jié)構(gòu)改變，從而出現(xiàn)C—O伸縮振動(dòng)[17]。3 200～3 420 cm-1和2 900～3 000 cm-1處振動(dòng)峰分別由氫鍵—OH和C—H拉伸引起。與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物在3 200～3 420 cm-1區(qū)域的光譜強(qiáng)度加強(qiáng)(從3 293.01 cm-1到3 416.33 cm-1)，在2 900～3 000 cm-1區(qū)域的光譜強(qiáng)度減弱(從2 961.10 cm-1到2 924.39 cm-1)，這表明混合體系中SPI和Dex之間的相互作用可能與氫鍵的形成以及C—H的拉伸有關(guān)。

圖3 SPI、SPI-Dex的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of SPI and SPI-Dex

2.4 紫外可見(jiàn)吸收光譜

蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的變化可以通過(guò)氨基酸殘基的相對(duì)運(yùn)動(dòng)反映出來(lái)[18]。大豆分離蛋白具有色氨酸和酪氨酸殘基等側(cè)鏈基團(tuán)，其特征紫外吸收峰在260～300 nm范圍內(nèi)。圖4顯示了SPI與SPI-Dex聚合物的紫外吸收光譜。如圖4所示，與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的最大紫外吸收度明顯降低，并且隨著Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加不斷下降。這可能是因?yàn)镈ex的加入可以在一定程度上防止色氨酸和酪氨酸殘基的暴露，從而形成了一種防止SPI被破壞的保護(hù)機(jī)制。另一種可能的解釋是混合體系中SPI和Dex之間聚合物的形成導(dǎo)致SPI肽鏈的延伸和空間結(jié)構(gòu)的改變，因此導(dǎo)致了紫外吸收光譜的改變[19]。

圖4 SPI、SPI-Dex的紫外光譜Fig.4 UV spectra of SPI and SPI-Dex

2.5 SDS-PAGE

圖5(圖中Marker表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白)為SPI及SPI-Dex聚合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。如圖5所示，SPI及SPI-Dex聚合物均呈現(xiàn)比較完整的電泳條帶。與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的條帶位置沒(méi)有發(fā)生明顯變化，且在分離膠和濃縮膠相接處沒(méi)有新條帶出現(xiàn)，這說(shuō)明混合體系中Dex的加入不會(huì)生成大分子量物質(zhì)。但是與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物電泳條帶的顏色明顯變淺，并且其顏色變淺程度與混合體系中Dex的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，這表明混合體系中Dex的加入改變了SPI的分子量，使得SPI的分子量有所減小。電泳條帶顏色的變淺可能是因?yàn)榛旌象w系中SPI、Dex二者通過(guò)非共價(jià)相互作用生成了SPI-Dex非共價(jià)聚合物，消耗了SPI上能夠與考馬斯亮藍(lán)染色液相互作用的活性基團(tuán)，從而使得SPI與染色液的結(jié)合減弱，因此條帶顏色變淺[20]。

圖5 SPI、SPI-Dex的凝膠電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of SPI and SPI-Dex

2.6 平均粒徑及粒徑分布

圖6a、6b(圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著，下同)分別是具有不同Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SPI-Dex聚合物的平均粒徑及粒徑分布圖。如圖6a所示，與單獨(dú)SPI相比，Dex的加入使得SPI-Dex聚合物的粒徑顯著減小，這可能是因?yàn)榛旌象w系中SPI和Dex之間相互作用形成了可溶性聚合物，從而抑制了蛋白質(zhì)之間的聚集，使得粒徑減小。同時(shí)，Dex的加入會(huì)增加混合體系的粘度，這可能是通過(guò)降低顆粒間的碰撞頻率來(lái)防止形成大的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聚合體，從而使粒徑減小。但是，繼續(xù)增加多糖的含量，即Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，顆粒尺寸略有增大，這一現(xiàn)象可以解釋為混合體系中一些小顆粒分子相互靠近而聚集。同樣地，文獻(xiàn)[17]在研究海藻酸鈉與肌原纖維蛋白相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象。此外，從圖6b中可以看出，SPI與SPI-Dex聚合物的粒徑分布均顯示雙峰分布，但是與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的峰相對(duì)較窄，因此，推測(cè)SPI-Dex聚合物溶液的穩(wěn)定性相對(duì)較好。

圖6 SPI、SPI-Dex的粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of SPI and SPI-Dex

2.7 濁度

濁度是表征蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的重要指標(biāo)，可以反映溶液中懸浮顆粒的大小和數(shù)量。具有不同Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SPI-Dex聚合物濁度如圖7所示。與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的濁度顯著降低，并且隨Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)有規(guī)律的下降，在Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)達(dá)到最低值。這可能是因?yàn)榛旌象w系中，SPI、Dex發(fā)生相互作用形成了可溶性聚合物，減少了大的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聚集體的形成。此外，Dex是一種大分子物質(zhì)，具有空間穩(wěn)定作用，能夠阻礙蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，避免蛋白質(zhì)聚集沉淀，從而使?jié)岫冉档蚚21]。然而，繼續(xù)增加混合體系中Dex的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，濁度略有升高，但仍然比單獨(dú)SPI的低。這一現(xiàn)象可能是由于混合體系中未參與反應(yīng)的Dex相互靠近，造成分子間相互聚集，因此濁度升高，這與2.6節(jié)平均粒徑及粒徑分布的結(jié)果相吻合。

圖7 SPI、SPI-Dex的濁度Fig.7 Turbidity of SPI and SPI-Dex

2.8 表面疏水性

蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)H0是表征蛋白質(zhì)表面暴露的疏水性基團(tuán)數(shù)量的指標(biāo)，也可以表征蛋白質(zhì)分子間相互作用[19]。表面疏水性指數(shù)不僅可以反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，而且與蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性等功能性質(zhì)緊密相關(guān)。如圖8所示，與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的表面疏水性指數(shù)顯著降低，并且隨著Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，SPI-Dex聚合物的表面疏水性指數(shù)不斷下降。一方面，Dex的添加覆蓋了蛋白質(zhì)表面的疏水位點(diǎn)，從而使蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)降低[22]。同樣，文獻(xiàn)[23]研究發(fā)現(xiàn)中性條件下卡拉膠的添加可以有效降低牛血清蛋白的表面疏水性。另一方面，SPI、Dex之間的物理混合會(huì)導(dǎo)致非共價(jià)SPI-Dex聚合物的形成，具有大量親水性羥基基團(tuán)的Dex與SPI結(jié)合，不僅可以通過(guò)增加蛋白質(zhì)分子表面的親水性來(lái)降低表面疏水性[24]，而且SPI和Dex之間相互作用可能會(huì)通過(guò)消耗SPI部分反應(yīng)基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)表面疏水性的降低，這與2.5節(jié)SDS-PAGE電泳條帶顏色的變化相吻合。同時(shí)，Dex的添加會(huì)產(chǎn)生一定的空間位阻，阻止蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露，進(jìn)而降低表面疏水性[5]。

圖8 SPI、SPI-Dex的表面疏水性指數(shù)Fig.8 Surface hydrophobicity of SPI and SPI-Dex

2.9 溶解性

溶解性作為蛋白質(zhì)重要的基本性質(zhì)之一，對(duì)蛋白質(zhì)的乳化性等功能性質(zhì)有很大的影響。如圖9所示，單獨(dú)SPI的溶解度為45.26%。隨著Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，SPI的溶解性發(fā)生顯著變化，在Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)達(dá)到最大值，與單獨(dú)SPI相比，溶解度提高16.35%。這可能是因?yàn)镾PI、Dex之間發(fā)生反應(yīng)，形成了可溶性聚合物，與單獨(dú)SPI相比，Dex的加入使得混合體系中親水性基團(tuán)的數(shù)量增加，因此溶解性提高。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[25]一致。然而，繼續(xù)增加混合體系中Dex的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，SPI-Dex聚合物的溶解度反而降低。這可能是因?yàn)榛旌象w系中Dex的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，未參加反應(yīng)的Dex與SPI相互競(jìng)爭(zhēng)吸收水分子，從而使得SPI的溶解性降低，這與2.7節(jié)濁度的變化情況相吻合。

圖9 SPI、SPI-Dex的溶解度Fig.9 Solubility of SPI and SPI-Dex

2.10 乳化活性和乳化穩(wěn)定性

如圖10(圖中不同小寫(xiě)字母表示乳化活性指數(shù)差異顯著，不同大寫(xiě)字母表示乳化穩(wěn)定性指數(shù)差異顯著)所示，單獨(dú)SPI穩(wěn)定的乳液的乳化活性指數(shù)為(7.73±0.08) m2/g。隨著Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，SPI-Dex聚合物穩(wěn)定的乳液的乳化活性指數(shù)不斷增加，在Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)達(dá)到最大值，與單獨(dú)SPI穩(wěn)定的乳液相比，乳化活性指數(shù)提高18.71%，說(shuō)明該濃度下的Dex對(duì)乳液的乳化活性具有明顯的改善作用。乳化活性指數(shù)的增加可能的原因?yàn)椋阂环矫?，Dex的添加可以通過(guò)加強(qiáng)蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈基團(tuán)與水的相互作用，使蛋白質(zhì)溶解度增加(見(jiàn)2.9節(jié))，從而使乳化活性增強(qiáng)[26]；另一方面，具有較高分子量的Dex的加入提高了混合體系的溶液黏度，形成了更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此乳化活性增加[27]。隨著混合體系中Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液乳化穩(wěn)定性指數(shù)的變化趨勢(shì)與乳化活性指數(shù)的變化趨勢(shì)大致相似，均呈現(xiàn)先增加后降低的變化。其中，Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%乳液的乳化穩(wěn)定性指數(shù)最高，與單獨(dú)SPI穩(wěn)定的乳液相比，增加34.55%，效果顯著，這可能是因?yàn)镈ex的加入使得乳液連續(xù)相的粘度增加，分散相的流動(dòng)性減弱，因此穩(wěn)定性增加[28]。然而，繼續(xù)增加混合體系中Dex的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和7%時(shí)，乳液的乳化穩(wěn)定性指數(shù)反而降低，這說(shuō)明高濃度的Dex不利于乳液的穩(wěn)定。

圖10 SPI、SPI-Dex的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)Fig.10 Emulsification activity index and emulsification stability index of SPI and SPI-Dex

2.11 抗氧化性

DPPH自由基清除能力已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各種抗氧化劑對(duì)自由基的清除作用，可以用于反映抗氧化性的強(qiáng)弱[19]。一般來(lái)說(shuō)，DPPH自由基清除能力越強(qiáng)，則該物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng)。圖11為Dex及具有不同Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SPI-Dex聚合物的DPPH自由基清除率。與單獨(dú)Dex和SPI相比，SPI-Dex聚合物的DPPH自由基清除能力顯著增強(qiáng)，這說(shuō)明Dex的添加可以改善SPI的抗氧化性。此外，在Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～5%的范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力隨著Dex的增加不斷增強(qiáng)，在Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)達(dá)到最大值，與單獨(dú)SPI相比，DPPH自由基清除率提高11.30%。這可能是因?yàn)殡S著Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，混合體系中SPI和Dex更好地結(jié)合，形成了更多的SPI-Dex聚合物，因此抗氧化性不斷增強(qiáng)。然而，繼續(xù)增加混合體系中Dex的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，DPPH自由基清除能力反而降低，這說(shuō)明混合體系的抗氧化性并不會(huì)隨Dex的增加而持續(xù)增強(qiáng)，過(guò)量的Dex不利于混合體系的抗氧化性。

圖11 SPI、SPI-Dex的DPPH自由基清除率Fig.11 DPPH radical scavenging activity of SPI and SPI-Dex

3 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)向SPI溶液中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Dex，探究了混合體系中SPI和Dex之間的相互作用方式以及Dex濃度對(duì)SPI結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，混合體系中SPI和Dex可以通過(guò)疏水相互作用和氫鍵這兩種非共價(jià)力形式相互作用。Dex的加入抑制了蛋白質(zhì)的聚集，阻止了蛋白質(zhì)色氨酸和酪氨酸殘基的暴露，形成了更加致密的三級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)混合體系中Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%時(shí)，與單獨(dú)SPI相比，SPI-Dex聚合物的粒徑、表面疏水性、濁度明顯降低；溶解性、乳化性、抗氧化性顯著提高。其中Dex質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)效果最為顯著，分別使SPI的溶解度增加16.35%、乳化活性指數(shù)增加18.71%、DPPH自由基清除率增加了11.30%。該結(jié)果為SPI-Dex非共價(jià)聚合物在食品領(lǐng)域中的有效應(yīng)用提供了理論參考。