飼料中添加芽孢桿菌對(duì)黃鱔腸道菌群和免疫功能的影響

張新明，張玉紅，劉 明

（湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌 443000）

黃鱔是我國(guó)淡水養(yǎng)殖中的重要水產(chǎn)動(dòng)物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著黃鱔需求量不斷加大，導(dǎo)致黃鱔養(yǎng)殖密度增加，抗生素廣泛使用，造成黃鱔養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生變化，使黃鱔幼苗頻頻發(fā)病，頻繁病害給黃鱔養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（譚鳳霞等，2020）。黃鱔發(fā)病期間頻繁消毒和用藥給水體環(huán)境帶來(lái)巨大的危害，黃鱔機(jī)體會(huì)對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留。因此，找到一種穩(wěn)定、抗病力強(qiáng)、環(huán)保、高效的飼料添加劑替代抗生素十分必要。而益生菌是一類保持動(dòng)物體內(nèi)微生物種類平衡，顯著提高動(dòng)物生長(zhǎng)速率，增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能的微生態(tài)制劑。益生菌對(duì)動(dòng)物沒(méi)有毒副作用，具有提高動(dòng)物生長(zhǎng)速率，改善動(dòng)物腸道菌群，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收，提高機(jī)體免疫功效等特點(diǎn)，已成為替代抗生素的微生態(tài)制劑（楊明容等，2017；粟雄高等，2012）。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類益生菌，能抵御高溫環(huán)境，抗酸堿腐蝕和穩(wěn)定生物活性?？莶菅挎邨U菌在動(dòng)物腸道內(nèi)消耗內(nèi)部氧氣，并產(chǎn)生酸性物質(zhì)，營(yíng)造一種厭氧酸性環(huán)境，具有改善益生菌生存環(huán)境，降低有害菌濃度，保持腸道菌群穩(wěn)定，增加腸絨毛面積，促進(jìn)腸道多種消化酶的分泌，維持各類消化酶活性，提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用效率，有利于動(dòng)物增重，增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能（沈斌乾等，2013）。枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑已被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料，許玉潔等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，將枯草芽孢桿菌添加到對(duì)蝦飼料中，會(huì)提高對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育速率，維持腸道菌群穩(wěn)定，有利于對(duì)蝦對(duì)飼料的消化、吸收，提高對(duì)蝦免疫功效。目前，黃鱔的研究主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育、疾病防治等方面，而枯草芽孢桿菌作為黃鱔飼料添加劑的應(yīng)用比較少。本文中探究不同添加水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔的腸道菌群和免疫功能的影響，分析和確定黃鱔飼料中枯草芽孢桿菌的最佳添加量，為黃鱔飼料配方中枯草芽孢菌的添加量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 黃鱔、枯草芽孢桿菌、飼料原料（高豆、魚粉、豆粕和玉米蛋白粉等物質(zhì)）購(gòu)買于通威飼料有限公司。

1.2 枯草芽孢桿菌的提取 本試驗(yàn)利用硫酸銨沉淀法來(lái)獲取枯草芽孢桿菌菌體蛋白，放入無(wú)菌燒杯內(nèi)，加入PBS溶解菌體蛋白，過(guò)濾后即可加入飼料中。

1.3 飼料配方 試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，試驗(yàn)飼料成分如表2所示，黃鱔飼料配方中枯草芽孢桿菌的添加水平為0.25%，0.5%，0.75%，1%和1.25%，對(duì)照組黃鱔飼料以玉米蛋白粉為蛋白源，沒(méi)有添加枯草芽孢桿菌。稱取所有飼料原料后測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)含量，粉碎，并加入水混合，制成2 mm的顆粒料，放入烘干箱干燥處理，放入4℃冰箱備用。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 飼料中枯草芽孢桿菌的配方原料

1.4 飼養(yǎng)管理要點(diǎn) 試驗(yàn)黃鱔育苗來(lái)自教學(xué)養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖試驗(yàn)在試驗(yàn)基地網(wǎng)箱中進(jìn)行，黃鱔按照規(guī)格（10.23±0.24）g進(jìn)行分組，將飼養(yǎng)的黃鱔幼苗隨機(jī)分為6組，試驗(yàn)組添加基礎(chǔ)飼料，對(duì)照組添加枯草芽孢桿菌，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)36尾魚。正式飼養(yǎng)開(kāi)始前對(duì)養(yǎng)殖基地的水塘進(jìn)行消毒處理，黃鱔苗放入水箱內(nèi)暫養(yǎng)2周。飼養(yǎng)期間，黃鱔每天投喂適量的餌料，每天2次，根據(jù)天氣和水溫狀況及時(shí)調(diào)整餌料，觀察魚類攝食情況，及時(shí)記錄養(yǎng)殖情況，定時(shí)檢測(cè)養(yǎng)殖水質(zhì)，包括溶氧、氨氮、pH和水溫情況。飼養(yǎng)試驗(yàn)期間每隔5 d換一次水，換水量為1/3，溶氧程度達(dá)到8～10 mg/L，養(yǎng)殖試驗(yàn)為期8周。

1.5 樣品采集 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)黃鱔初體重和末體重進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)相應(yīng)公式計(jì)算黃鱔生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)指標(biāo)，具體公式如下：

餌料系數(shù)（FCR）=動(dòng)物飼料中總投喂量/動(dòng)物飼養(yǎng)期間增加的體重；

增重率（WGR，%）=（動(dòng)物生長(zhǎng)后總體重均值－動(dòng)物生長(zhǎng)前的體重均值）/動(dòng)物生長(zhǎng)前的體重均值×100；

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=100×（ln動(dòng)物生長(zhǎng)后總體重－ln動(dòng)物生長(zhǎng)前的體重）/飼養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)間。

1.5.1 免疫指標(biāo)測(cè)定 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，將黃鱔禁食24 h，靜脈采血10 mL，放入相關(guān)試管內(nèi)，常溫離心后及時(shí)放入4℃冰箱保存。

采用相關(guān)試劑盒測(cè)定黃鱔血清的免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白（IgG）濃度，并檢測(cè)黃鱔促炎性因子IL-17，IL-6，TNF-a的含量，檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.5.2 腸道菌群指標(biāo)測(cè)定 黃鱔飼養(yǎng)周期結(jié)束后，將試驗(yàn)1～5組枯草芽孢桿菌組分別取出3條健康的黃鱔，取黃鱔腸道沉積物，放置于無(wú)菌EP管中，依據(jù)管越強(qiáng)等（2021）的方法測(cè)定黃鱔腸道菌群含量。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel表格記錄，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)的影響 由表3可知，隨著枯草芽孢桿菌添加水平的不斷提升，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組黃鱔增重率先上升后下降；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)5組黃鱔增重率分別為405.3%和439.3%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在試驗(yàn)3組中，黃鱔增重率達(dá)到最高（498.2%），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)2組和試驗(yàn)4組黃鱔增重率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著枯草芽孢桿菌添加水平不斷提升，黃鱔特定生長(zhǎng)率先升后降，試驗(yàn)3組黃鱔的特定生長(zhǎng)率顯著升高，達(dá)到最高值（3.23%），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)2組和4組黃鱔的特定生長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而試驗(yàn)1組和試驗(yàn)5組黃鱔的特定生長(zhǎng)率無(wú)明顯差異（P＞0.05）。隨著飼料枯草芽孢桿菌添加水平的升高，黃鱔飼料系數(shù)一直下降，試驗(yàn)4組和試驗(yàn)5組黃鱔的餌料系數(shù)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1～3組黃鱔的餌料系數(shù)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），高水平枯草芽孢桿菌飼料組可能會(huì)降低黃鱔餌料系數(shù)。

表3 不同水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.2 不同添加水平枯草芽孢桿菌飼料對(duì)黃鱔免疫相關(guān)指標(biāo)的影響 由表4可知，隨著枯草芽孢桿菌添加水平的升高，試驗(yàn)1～5組黃鱔血清IgM的濃度先升高后降低，試驗(yàn)1組（0.25%）和試驗(yàn)5組（1.25%）黃鱔血清中的IgM濃度明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)3組黃鱔血清IgM濃度顯著上升，并達(dá)到最高水平，為1.67ng/L，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組黃鱔血清IgM濃度明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)1～5組黃鱔血清IgA濃度隨飼料枯草芽孢桿菌的添加水平的升高先升高后降低。在試驗(yàn)3組中，黃鱔血清中IgA濃度達(dá)到最高水平，為1.23ng/L，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)5組中黃鱔血清IgA濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在試驗(yàn)3組中黃鱔血清IgG的濃度最高，為3.54ng/L，明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)4組次之，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組和5組黃鱔血清的IgG濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 不同水平枯草芽孢桿菌飼料對(duì)黃鱔血清免疫球蛋白濃度的影響

不同添加水平枯草芽孢桿菌飼料與黃鱔炎性因子相關(guān)指標(biāo)有密切聯(lián)系，由圖1～3可知，試驗(yàn)3～5組中，黃鱔血清中IL-17濃度明顯下降，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1～2組中，黃鱔血清中IL-17濃度與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；試驗(yàn)2～5組黃鱔血清TNF-α濃度明顯下降，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組黃鱔血清TNF-α濃度與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；試驗(yàn)2～5組中，黃鱔血清IL-6濃度不斷下降，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組黃鱔IL-6含量與對(duì)照組無(wú)較大差異（P＞0.05）。

圖1 不同試驗(yàn)組中黃鱔的IL-17含量

圖2 不同試驗(yàn)組中黃鱔的TNF-a含量

圖3 不同試驗(yàn)組中黃鱔的IL-6濃度

2.3 不同水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔腸道菌群相關(guān)指標(biāo)的影響 由表5可知，不同添加水平的枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔鏈球菌屬無(wú)顯著影響（P＞0.05），隨著枯草芽孢桿菌添加水平不斷升高，黃鱔腸道中氣單胞菌屬和致病桿菌的含量先上升后下降，試驗(yàn)3組氣單胞菌屬和致病桿菌屬的含量達(dá)到最高水平，其值分別是8.05 CFU/g和9.73CFU/g，顯著高于其他對(duì)照組（P＜0.05），其余各組黃鱔腸道中氣單胞菌屬和致病桿菌屬含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；隨著枯草芽孢桿菌添加水平的升高，黃鱔腸道中假單胞菌屬含量不斷上升，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在試驗(yàn)3組中，黃鱔腸道中芽孢桿菌屬的含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），達(dá)到最高水平（10.04 CFU/g），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他試驗(yàn)組中黃鱔腸道內(nèi)芽孢桿菌屬含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表5 不同添加水平的枯草芽孢桿菌飼料對(duì)黃鱔腸道菌群的影響 lg CFU/g

3 討論

隨著黃鱔集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，提高黃鱔養(yǎng)殖密度可能會(huì)增加黃鱔苗種患病概率，而抗生素對(duì)動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生耐藥性，且藥物殘留量大，因此，枯草芽孢桿菌作為綠色益生菌可有效代替抗生素，成為一種環(huán)保、安全的綠色飼料添加劑。

3.1 不同水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔生長(zhǎng)發(fā)育的影響 枯草芽孢桿菌是一種益生菌，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料中?？莶菅挎邨U菌具有耐酸、耐高溫、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，能滿足動(dòng)物體的營(yíng)養(yǎng)需求，促進(jìn)腸道分泌多種消化酶，擴(kuò)大腸道絨毛結(jié)構(gòu)，提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收效率，改善腸道菌群的健康模式，有助于動(dòng)物生長(zhǎng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌添加水平為0.75%時(shí)將會(huì)顯著提高黃鱔增重率。本研究與孫盛明（2016）等在團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）上的研究結(jié)果類似。許玉潔等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌是對(duì)蝦的飼料添加劑，當(dāng)添加水平為0.5%時(shí)，對(duì)蝦特定生長(zhǎng)率和增重率明顯上升，說(shuō)明適量的枯草芽孢桿菌有助于對(duì)蝦的生長(zhǎng)，但高水平的枯草芽孢桿菌將會(huì)降低對(duì)蝦增重率，使對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育受到限制。管越強(qiáng)等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加劑枯草芽孢桿菌的添加量為1.0和0.5 g/kg可有效提高中華鱉的生長(zhǎng)速率，當(dāng)枯草芽孢桿菌添加量為4.1 g/kg時(shí)，中華鱉的特定增長(zhǎng)率明顯低于對(duì)照組，增重率下降，結(jié)果表明，添加高水平枯草芽孢桿菌會(huì)抑制中華鱉的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，高添加水平（1.25%）枯草芽孢桿菌組黃鱔生長(zhǎng)發(fā)育速率顯著低于低添加水平（0.5%）組，產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因是黃鱔腸道一旦含有大量枯草芽孢桿菌，過(guò)多的枯草芽孢桿菌會(huì)打破腸道原有的菌群平衡，抑制腸道消化酶活性，降低腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，從而使魚體缺乏足夠的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受到限制。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼料枯草芽孢桿菌的添加水平為0.75%，對(duì)黃鱔生長(zhǎng)發(fā)育有明顯影響；隨著黃鱔飼料枯草芽孢桿菌添加水平的不斷上升，黃鱔餌料系數(shù)不斷降低，表明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌可顯著提高黃鱔腸道對(duì)飼料的消化吸收，其可能的原因是適量枯草芽孢桿菌被黃鱔腸道消化吸收后將會(huì)增加有益菌數(shù)量，維持腸道有益菌群平衡，同時(shí)刺激腸道分泌各類消化酶，維持消化酶活性，加速飼料分解過(guò)程，增強(qiáng)腸道絨毛面積，促進(jìn)機(jī)體對(duì)飼料原料的吸收，使魚體的體重增加。

3.2 不同水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔免疫功能的影響 血清中免疫球蛋白含量可反映機(jī)體免疫功能的高低。IgA免疫球蛋白可有效抑制腸道黏膜處的細(xì)菌。IgG能激活機(jī)體內(nèi)的補(bǔ)體，抵御外來(lái)毒素作用。IgM在機(jī)體中可發(fā)揮重要作用，清除體內(nèi)病原體，防止外來(lái)病原的侵襲（許玉潔等，2015；沈斌乾等，2013；粟雄高等，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌添加水平0.75%時(shí)，黃鱔血清中IgG和IgM的濃度高于對(duì)照組，表明黃鱔飼料中適宜水平枯草芽孢桿菌可改善黃鱔免疫功效，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能。IL-6、IL-17和TNF-a是促炎性因子，其濃度反應(yīng)動(dòng)物免疫功效。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料枯草芽孢桿菌添加水平不斷增加，黃鱔血清中IL-6，IL-17和TNF-a的濃度不斷下降，表明添加適量水平枯草芽孢桿菌會(huì)改善黃鱔的免疫功能。李浩等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適宜水平益生菌可能會(huì)提高豬的免疫力。這些研究結(jié)果表明，動(dòng)物飼料中添加益生菌有助于提高動(dòng)物機(jī)體免疫功效，其主要因素是枯草芽孢桿菌可能提高益生菌的生產(chǎn)能力，有助于有益菌的生長(zhǎng)，保持腸道內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，維持腸道內(nèi)部健康，促進(jìn)相關(guān)免疫菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提高腸道免疫相關(guān)功效，從而提高動(dòng)物機(jī)體免疫功效。

3.3 不同水平枯草芽孢桿菌對(duì)黃鱔腸道菌群的影響 試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜添加水平的枯草芽孢桿菌組黃鱔腸道內(nèi)芽孢桿菌屬的含量和假單胞菌屬的含量明顯升高，均高于對(duì)照組，結(jié)果表明，適宜添加水平枯草芽孢桿菌將會(huì)有效改善黃鱔腸道健康，維持黃鱔腸道結(jié)構(gòu)和菌群平衡。張獻(xiàn)月等（2013）研究表明，肉雞飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌將會(huì)顯著影響肉雞腸道形態(tài)，提高肉雞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。雷玉杰等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定量的酵母物可有效改善斑馬魚的腸道健康，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)。因此，飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌有助于提高黃鱔健康發(fā)育，改善黃鱔免疫性能。

4 結(jié)論

在飼料中添加枯草芽孢桿菌會(huì)對(duì)黃鱔增重率和特定生長(zhǎng)率產(chǎn)生促進(jìn)作用，促進(jìn)黃鱔幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，有利于改善腸道健康狀況，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而有助于恢復(fù)黃鱔健康。在本試驗(yàn)中，飼料添加0.75%的枯草芽孢桿菌效果最好，有利于黃鱔生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)黃鱔免疫功效。