抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清vWF含量及導(dǎo)管相關(guān)性血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究

黃欣欣，應(yīng)燕萍，蔣慶娟，韋佳妮，文 萃，趙慧函

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西530021

1929年，德國(guó)外科醫(yī)生Werner Forssman完成了世界上首例中心靜脈置管術(shù)，開(kāi)啟了中心靜脈導(dǎo)管(central venous catheter， CVC)的時(shí)代[1]。CVC是指經(jīng)頸內(nèi)靜脈、鎖骨下靜脈或股靜脈置入且尖端位于上、下腔靜脈或右心房附近的細(xì)長(zhǎng)、柔軟中空導(dǎo)管[2]。每年都有上千萬(wàn)的CVC在全球醫(yī)療機(jī)構(gòu)被應(yīng)用于各類急危重癥病人的支持與治療[1]。盡管CVC優(yōu)點(diǎn)眾多，但也有著不可忽視的并發(fā)癥，其中，導(dǎo)管相關(guān)性血栓(catheter related thrombosis，CRT)是其最常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。CRT被定義為CVC所在靜脈處發(fā)展形成的血栓[3]，可導(dǎo)致深靜脈血栓、肺栓塞以及血栓后綜合征的發(fā)生，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，因此，有效預(yù)防CRT的形成至關(guān)重要。CRT主要與穿刺時(shí)或留置導(dǎo)管過(guò)程中刺激損傷血管內(nèi)皮、血流動(dòng)力學(xué)改變以及病人自身狀態(tài)等因素有關(guān)[4]。血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一種由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成分泌的多聚體糖蛋白且其分泌受血流動(dòng)力學(xué)的調(diào)控，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷或受刺激時(shí)被大量釋放至血液循環(huán)參與生理止血和血栓形成過(guò)程，被認(rèn)為是有價(jià)值的內(nèi)皮損傷與血栓形成標(biāo)志物[5-6]。

美國(guó)靜脈輸液護(hù)理學(xué)會(huì)鼓勵(lì)病人進(jìn)行置管側(cè)肢體的早期規(guī)律運(yùn)動(dòng)與鍛煉以有效預(yù)防CRT形成，而非使用藥物策略[7]。適度的物理運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是一種有益的生理刺激，其通過(guò)增加局部血流量，加快血流速度，促進(jìn)血管舒張等修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，保持內(nèi)皮功能穩(wěn)態(tài)以最小化血管并發(fā)癥[8]。抗阻運(yùn)動(dòng)是指通過(guò)使肌肉收縮來(lái)對(duì)抗外部阻力，以達(dá)到肌肉質(zhì)量增長(zhǎng)，力量和骨密度增加的任何形式的運(yùn)動(dòng)，具有低能耗的特點(diǎn)[9]。臨床研究證實(shí)，抗阻運(yùn)動(dòng)如握拳活動(dòng)、握力器鍛煉、抓握握力球等均能有效預(yù)防CRT的發(fā)生[10]。但目前關(guān)于抗阻運(yùn)動(dòng)預(yù)防CRT發(fā)生的分子機(jī)制的研究仍較少，本研究旨在通過(guò)構(gòu)建CVC大鼠模型，進(jìn)行4周抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)后觀察血栓形成情況，并測(cè)定血清vWF的含量，探討抗阻運(yùn)動(dòng)預(yù)防CRT形成的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雄性SD大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量230～250 g，來(lái)源于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK桂2020-0003)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房代養(yǎng)(SYXK桂2020-0004)。環(huán)境溫度控制在20～25 ℃，空氣濕度為60%～70%，12 h光/暗循環(huán)，自由進(jìn)食與飲水。實(shí)驗(yàn)所有過(guò)程遵循3R原則，且已獲廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要儀器及試劑

硅膠導(dǎo)管與堵頭(2#PU，北京思科諾斯生物科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物爬梯(課題組自主研發(fā)，專利號(hào)：CN201921509747.4)，大鼠vWF酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml1003160-C)，10%中性甲醛(G2161，北京索萊寶科技有限公司)，伊紅-蘇木精染色(HE)染色試劑盒(G1120，北京索萊寶科技有限公司)，中性樹(shù)脂(G8590，北京索萊寶科技有限公司)，恒溫孵育箱(IGS180，美國(guó)Thermo Scientific公司)，酶標(biāo)儀(SynergyH1，美國(guó)Bio Ted儀器有限公司)，數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)(Nano Zoomer s60，日本濱松光子學(xué)株式會(huì)社)，石蠟包埋機(jī)(Histo Core Arcadia H，德國(guó)LEICA公司)，切片機(jī)(Histo Core BIOCUT，德國(guó)LEICA公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

全部大鼠均進(jìn)行7 d的無(wú)負(fù)重適應(yīng)性爬梯訓(xùn)練，完成預(yù)爬的大鼠被納入實(shí)驗(yàn)，否則予以剔除。按照隨機(jī)分組原則，將大鼠分到空白組、假手術(shù)組、置管術(shù)組、置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組，每組15只。空白組大鼠不予任何處理，正常飼養(yǎng)；假手術(shù)組行假手術(shù)后，正常飼養(yǎng)；置管術(shù)組行置管術(shù)，正常飼養(yǎng)；置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組行中心靜脈置管術(shù)后第1天進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 置管方法

基于課題組前期研究[11]并借鑒宋文煜等[12]小鼠頸靜脈置管經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行造模。3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)[13]經(jīng)腹腔注射給藥麻醉大鼠至理想狀態(tài)，取仰臥位，固定后行備皮、消毒和鋪巾，頸前正中線右外0.5 cm處做一長(zhǎng)約1 cm縱向切口，鈍性分離皮下組織與肌肉，充分暴露與游離出右頸外靜脈。在近心端和遠(yuǎn)心端血管下方分別放置4-0縫線，在靜脈上做“V”型切口并置入導(dǎo)管，回抽見(jiàn)回血后推注生理鹽水，堵頭封閉導(dǎo)管末端，縫線固定導(dǎo)管后進(jìn)行逐層縫合，消毒傷口并清除周圍血跡。取暖器保溫，促使大鼠復(fù)蘇，觀察至清醒后放回鼠籠。

1.4.2 假手術(shù)方法

假手術(shù)即置入導(dǎo)管至理想位置后拔出，不予留置導(dǎo)管于大鼠體內(nèi)，壓迫止血后逐層縫合，取暖器保溫、促使大鼠復(fù)蘇，觀察至清醒后放回鼠籠。

1.4.3 抗阻運(yùn)動(dòng)方案

參照大鼠抗阻運(yùn)動(dòng)模型[14]適當(dāng)修改干預(yù)方案，置管術(shù)后第1天利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物爬梯[15]進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)。采用大鼠尾部砝碼負(fù)重的方式，第1周負(fù)重量為體質(zhì)量的10%，第2周、第3周、第4周分別負(fù)重體質(zhì)量的30%、50%和70%，頻次為4次/組，間隔每次1 min，每天2組，每周5 d，共4周。大鼠從爬梯底部爬至頂部，必要時(shí)可通過(guò)刺激鼠尾誘導(dǎo)其進(jìn)行爬梯運(yùn)動(dòng)，具體干預(yù)方案見(jiàn)表1。

表1 抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

1.4.4 標(biāo)本采集

末次抗阻運(yùn)動(dòng)結(jié)束當(dāng)天完成所有大鼠取材工作，3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)麻醉后解剖大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血3 mL，室溫放置2 h后在4 ℃，1 000 r/min條件下離心10 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。取下導(dǎo)管所在靜脈組織段浸泡于10%甲醛固定液中。

1.5 指標(biāo)評(píng)估

1.5.1 血栓形成情況

取下的血管組織于10%甲醛固定48 h，經(jīng)程序性脫水、石蠟包埋、組織切片、HE染色和中性樹(shù)脂封片等步驟后，掃片儀40×倍鏡下掃片，觀察血栓形成情況，Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算血栓面積百分比(血栓面積百分比=血栓面積 /血管腔橫截面積 ×100)。

1.5.2 血清vWF含量測(cè)定

使用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清vWF含量，所有步驟均根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行。酶標(biāo)儀建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測(cè)450 nm處吸光度值，計(jì)算vWF含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基本情況

所有大鼠置管均為一次成功，成功率為100%；導(dǎo)管留置期間大鼠未出現(xiàn)出血、感染以及死亡等情況，存活率為100%。干預(yù)前各組大鼠體質(zhì)量均衡可比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？棺柽\(yùn)動(dòng)干預(yù)第1周至第3周，各組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第4周干預(yù)結(jié)束時(shí)，置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組大鼠體質(zhì)量較置管術(shù)組更輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況比較 單位：g

2.2 血栓形成情況

大鼠血栓形成情況見(jiàn)表3，HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 光鏡下血栓形態(tài)圖(HE染色，40×倍鏡，500 μm)(A為空白組；B為假手術(shù)組；C為置管術(shù)組；D為置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組)

2.3 大鼠血清vWF含量(見(jiàn)表4)

表4 各組大鼠血清vWF含量比較 單位：ng/mL

3 討論

根據(jù)魏爾嘯提出的血栓形成“三要素”理論[16]可知，血管內(nèi)皮損傷、血液緩滯以及血液高凝狀態(tài)是導(dǎo)致血栓發(fā)生的主要病因，也是促使CRT高發(fā)的原因。在不同研究中CRT發(fā)生率不盡相同，這可能與研究方法、研究對(duì)象和診斷方法等不同有關(guān)。有研究統(tǒng)計(jì)，癥狀性血栓發(fā)生率為6.7%[17]，而無(wú)癥狀性CRT占比高至68.0%[18]，由此可見(jiàn)CRT具有高發(fā)而隱匿的特點(diǎn)。CRT的主要預(yù)防策略包括藥物和物理干預(yù)，但現(xiàn)有指南與文獻(xiàn)不建議藥物抗凝作為CRT的一級(jí)預(yù)防策略。而運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)加快血流速度、介導(dǎo)血管舒張、調(diào)控血液中凝血活性物質(zhì)以及改變血液流變學(xué)，如提高血流對(duì)靜脈管壁的剪切應(yīng)力從而預(yù)防血栓事件的發(fā)生[19]。相比而言，物理運(yùn)動(dòng)具有不增加病人出血風(fēng)險(xiǎn)、安全、經(jīng)濟(jì)、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。

在本研究中，空白組大鼠無(wú)血栓形成，假手術(shù)組和置管術(shù)組大鼠CRT發(fā)生率分別為33.33%和80.00%，置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組大鼠經(jīng)過(guò)4周抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)后CRT發(fā)生率為13.33%，置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組與置管術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組與空白組比較，CRT發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，對(duì)各組大鼠的平均血栓面積比較也得到了同樣的趨勢(shì)，置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組大鼠的平均血栓面積為4.79%，低于置管術(shù)組。因此，本研究結(jié)果證實(shí)了抗阻運(yùn)動(dòng)有利于預(yù)防和減少CRT的發(fā)生。導(dǎo)管置入過(guò)程必然伴隨著血管內(nèi)皮的損傷，CRT是血管壁創(chuàng)傷后不可避免的事件[20]。雖然導(dǎo)管置入會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，但通過(guò)假手術(shù)組(CRT發(fā)生率33.33%)和置管術(shù)組(CRT發(fā)生率80.00%)的比較可知，假手術(shù)組大鼠血栓形成明顯少于置管術(shù)組(P<0.05)。提示，靜脈穿刺雖然會(huì)引起血管內(nèi)皮的損傷，但長(zhǎng)期留置導(dǎo)管對(duì)血管壁產(chǎn)生的刺激才是引起內(nèi)皮損傷的主要原因。同時(shí)，導(dǎo)管的存在占據(jù)了一定的血管腔體積導(dǎo)致血流減緩，有研究顯示，導(dǎo)管直徑與血管直徑比值越小即導(dǎo)管占據(jù)血管腔體積越大，血液淤滯越嚴(yán)重，越有利于CRT形成[21]。

完整的血管內(nèi)皮對(duì)于血管功能穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，是發(fā)揮抗血栓、調(diào)節(jié)血管張力以及免疫調(diào)節(jié)等功能的前提。vWF與血管內(nèi)皮損傷和血栓的形成有關(guān)，被認(rèn)為是有價(jià)值的判斷血管內(nèi)皮損傷程度和血栓風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物，由內(nèi)皮細(xì)胞與巨核細(xì)胞合成并被儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞中的韋伯小體和血小板中。vWF通過(guò)誘導(dǎo)血小板黏附、聚集至內(nèi)皮損傷處，并激活血小板啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)；作為載體與Ⅷ因子結(jié)合，延長(zhǎng)其半衰周期；促使纖維蛋白原生成這3條途徑共同促使血栓形成[22]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，vWF在深靜脈血栓形成病人和健康人中差異性表達(dá)，深靜脈血栓病人vWF血漿濃度高于健康人(P<0.05)[23]，腦梗死病人血清vWF水平也較健康人更高[24]。CVC穿刺過(guò)程中血管內(nèi)皮局部損傷，凝血和炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)被激活，而運(yùn)動(dòng)能降低內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷和減少促炎性因子的表達(dá)，從而促使血管內(nèi)皮損傷修復(fù)[25]，減少血栓的形成。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，假手術(shù)組和置管術(shù)組大鼠血清vWF含量增加(P<0.05)；經(jīng)過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，置管術(shù)+抗阻運(yùn)動(dòng)組大鼠血清vWF含量低于置管術(shù)組[(423.48±99.99)ng/mL與(205.71±83.77)ng/mL，P<0.001]，與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步證實(shí)血管內(nèi)皮損傷會(huì)導(dǎo)致vWF釋放增多，促使CRT的形成，也證實(shí)了抗阻運(yùn)動(dòng)能夠促使血管內(nèi)皮損傷修復(fù)，減少vWF分泌，從而達(dá)到預(yù)防CRT形成的目的。

4 小結(jié)

抗阻運(yùn)動(dòng)能有效預(yù)防導(dǎo)管相關(guān)性血栓的發(fā)生，可降低導(dǎo)管相關(guān)性血栓的發(fā)生率和平均血栓面積百分比，其機(jī)制可能是減輕與修復(fù)內(nèi)皮損傷、減少內(nèi)皮細(xì)胞釋放vWF，從而減少血小板的黏附與聚集，最終預(yù)防血栓的形成。