微生物發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉品質(zhì)特性及抗氧化活性的影響

陳 悅，陳 嵐，高 路

(沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，沈陽(yáng) 110034)

代餐粉是一種單一或綜合性沖調(diào)粉劑產(chǎn)品，主要以谷類(lèi)、豆類(lèi)、薯類(lèi)為原料，方便即時(shí)、易于攜帶[1]。谷物富含蛋白質(zhì)且氨基酸分布均衡，含有大量的膳食纖維、鐵、鋅、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[2]。雜糧富含的膳食纖維可增加人體飽腹感，延緩食物消化速度；雜糧中的植物固醇在一定程度上也可降低膽固醇的含量，對(duì)調(diào)節(jié)血糖血壓、降低人體慢性病的發(fā)病率起著重要作用[3]。但雜糧中的膳食纖維使產(chǎn)品適口性變差、沖調(diào)性下降，因此雜糧在投入工業(yè)生產(chǎn)時(shí)利用率降低。

微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種水解酶，可以將大分子化合物分解成人體更易吸收的小分子物質(zhì)，增加生物利用率[4]。微生物發(fā)酵可以顯著提升產(chǎn)品的感官品質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸、多肽、甘氨酸、游離脂肪酸等對(duì)產(chǎn)品的口感和香氣起著重要作用[5]。植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌間具有協(xié)同作用，植物乳桿菌降解雜糧中大分子物質(zhì)，產(chǎn)生大量乳酸，酸性環(huán)境可維持嗜酸乳桿菌正常的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而植物乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中合成的葉酸又可供給嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)[6]。徐安書(shū)等[7]選用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌開(kāi)發(fā)出具有保健功能的莖瘤芥保健飲料產(chǎn)品，提高莖瘤芥的附加值。趙麗娜等[8]用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵，旨在為開(kāi)發(fā)一種富含益生菌和β-葡聚糖的功能性產(chǎn)品提供基礎(chǔ)。

本研究以10種雜糧為原料制備雜糧代餐粉，采用復(fù)合菌種對(duì)原料進(jìn)行發(fā)酵處理，探究發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉品質(zhì)特性、抗氧化活性的影響。以期為確定雜糧代餐粉的發(fā)酵工藝參數(shù)提供有益參考，也為探究微生物發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉品質(zhì)特性和抗氧化活性的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫羅蘭紫薯、東北黃豆、紅皮花生仁、黑芝麻籽、玉米(丹玉69號(hào))、黃小米、長(zhǎng)粒香糙米、白色藜麥、純種小薏苡仁、青稞(肚里黃)。

植物乳桿菌JYLP-002、嗜酸乳桿菌JYLA-191；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過(guò)硫酸鉀均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JTM60膠體磨，Scientz-150高壓均質(zhì)機(jī)，SD-1500噴霧干燥機(jī)，CHROMA METER CR-400型色差儀，Q20-差式掃描量熱儀。

1.3 方法

1.3.1 雜糧代餐粉的工藝流程

原料→膠體磨→50目過(guò)濾→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→高壓均質(zhì)→噴霧干燥→雜糧代餐粉

1.3.2 雜糧代餐粉的操作要點(diǎn)

取新鮮紫薯清洗、去皮、護(hù)色[9]，其余原料除雜、清洗、浸泡，將10種原料(紫薯108.00 g、黃豆58.00 g、花生仁57.00 g、芝麻籽9.78 g、玉米8.00 g、小米7.70 g、糙米5.47 g、藜麥4.50 g、薏米4.00 g、青稞3.00 g)加水(料液比為1∶6)后用膠體磨打漿并過(guò)濾[10]，再用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，備用。把經(jīng)過(guò)發(fā)酵的混合漿液進(jìn)行高壓均質(zhì)(P=40 MPa，t=2～5 min)、噴霧干燥處理(噴霧壓力0.20 MPa、進(jìn)料流量400 mL/h、進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃、熱風(fēng)流量45 m3/h)，最后制得雜糧代餐粉。

1.3.3 菌種活化

將2個(gè)菌種的凍干粉溶于無(wú)菌水混勻，在MRS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h。取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中活化2次，以2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h至菌體濃度為108CFU/mL。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別固定接種比例為1∶1、發(fā)酵時(shí)間為11 h、發(fā)酵溫度為34 ℃、接種量(菌質(zhì)量分?jǐn)?shù))為3%，考察各因素對(duì)可溶性固形物的影響。將復(fù)合菌接種比例設(shè)定為0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為5、7、9、11、13 h，發(fā)酵溫度設(shè)定為28、31、34、37、40 ℃，接種量設(shè)定為1%、3%、5%、7%、9%，不進(jìn)行發(fā)酵處理的樣品作為對(duì)照組。

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，確定雜糧代餐粉的最佳發(fā)酵條件，因素與水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.6 可溶性固形物測(cè)定

取待測(cè)樣品于70 ℃烘箱烘干至恒重，準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后樣品0.1 g并加入0.9 mL蒸餾水，配制成10%溶液，于100 ℃水浴30 min，再以3 000 r/min離心30 min[11]。

式中：A為樣品中可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；A0為溶液中可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.7 沖調(diào)性測(cè)定

以分散性和潤(rùn)濕性為考察指標(biāo)測(cè)定沖調(diào)性[12]。

其中分散性的測(cè)定：稱(chēng)取1.0 g樣品，并加入25 mL去離子水進(jìn)行磁力攪拌(轉(zhuǎn)速300 r/min)，記錄樣品全部分散于水中所用時(shí)間。

潤(rùn)濕性的測(cè)定：稱(chēng)取1.0 g樣品，置于50 mL 50 ℃的去離子水中，記錄樣品在水中全部潤(rùn)濕所用時(shí)間。

1.3.8 色澤測(cè)定

以CIEL ab表色系統(tǒng)測(cè)定樣品的L*(明-亮)、a*(紅-綠)和b*(黃-藍(lán))值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)，計(jì)算色度(C*)，色相角(H*)，總顏色(E*)，色差(ΔE*)和白度(W)。

C*=(a*2+b*2)0.5

E*=(L*2+a*2+b*2)0.5

W={100-[(100-L*)2+(a*2+b*2)]0.5}×100%

1.3.9 水合特性測(cè)定

稱(chēng)取0.5 g樣品于20 mL蒸餾水并混合均勻，在25 ℃和100 ℃水浴30 min，然后高速離心30 min(轉(zhuǎn)速10 000 r/min)[13]，倒出上清液烘干至恒重。

式中：m為樣品質(zhì)量/g；m1為離心管中沉淀的質(zhì)量/g；m2為干燥至恒重的上清液質(zhì)量/g。

1.3.10 持水力測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g樣品與25 mL去離子水于50 mL離心管中，搖勻后在室溫下靜置60 min，然后離心15 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)[14]。

式中：m0為樣品質(zhì)量/g；m1為離心管質(zhì)量/g；m2為吸水后樣品和離心管質(zhì)量/g。

1.3.11 持油力測(cè)定

將0.5 g樣品與4.0 g大豆油混合均勻，在37 ℃的水浴鍋中靜置4 h，離心15 min(轉(zhuǎn)速4 000 r/min)[15]。

式中：m0為樣品質(zhì)量/g；m1為離心管中沉淀質(zhì)量/g。

1.3.12 粉體特性測(cè)定

1.3.12.1 休止角及滑角的測(cè)定[16]

休止角(θ)：將漏斗底端固定在距離桌面(H)3 cm的鐵架臺(tái)上，在漏斗下端放置一張方格紙，再將樣品勻速倒入漏斗，直至形成的錐體頂端接觸到漏斗底部，測(cè)量錐體直徑記作2R。

滑角(α)：稱(chēng)取5.0 g樣品置于長(zhǎng)(L)130 mm的玻璃板上，將平板一端緩緩抬起，記錄樣品開(kāi)始下滑時(shí)平板的垂直高度(H)。

1.3.12.2 松密度(ρB)、輕敲密度(ρT)、卡氏指數(shù)(Carr)、霍斯納比值(Hausner)的測(cè)定

ρB：取一個(gè)50 mL量筒，將樣品緩緩倒入量筒中至20 mL標(biāo)記處，準(zhǔn)確稱(chēng)量樣品倒入后量筒的質(zhì)量。

式中：m1為量筒的質(zhì)量/g；m2為樣品與量筒的總質(zhì)量/g；VB為注入樣品的體積/mL。

ρT：然后用手輕敲量筒300次，記錄敲擊后樣品體積。

式中：VT為敲擊后樣品的體積/mL。

Carr指數(shù)、Hausner比值按公式計(jì)算。

1.3.12.3 川北方程[17]

取樣品緩慢倒入量筒至100 mL處，然后將量筒從垂直桌面1 cm高度處自由落下，直至體積不變，記錄此時(shí)樣品體積和落下次數(shù)。川北方程變形為：

式中：n為輕敲次數(shù)(即落下次數(shù))；a為輕敲次數(shù)無(wú)窮大時(shí)體積減少數(shù)；b為充填速度常數(shù)；C為樣品相對(duì)體積減小數(shù)。

輕敲次數(shù)無(wú)窮大時(shí)：

式中：V0為初始體積；Vn為輕敲n次后樣品體積；V∞為輕敲無(wú)窮次后樣品體積。

1.3.13 DSC糊化特性測(cè)定

稱(chēng)取樣品5 mg于DSC鋁盒中，溫度范圍20～200 ℃，升溫速度為10 ℃/min，以密封空鋁盒作為對(duì)照進(jìn)行掃描。

1.3.14 抗氧化活性測(cè)定

提取液的制備[18]：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品，用50 mL(每次25 mL)80%乙醇溶液作提取液，再用均質(zhì)機(jī)5 000 r/min間歇破碎5 min，超聲提取20 min，5 000 r/min離心15 min后取上清液，提取2次，合并、定容，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.14.1 DPPH·清除率測(cè)定

將0.1 mL樣品提取液與2 mL 0.2 mmol/L DPPH、2.9 mL無(wú)水乙醇混合并搖勻，然后放置暗處?kù)o置30 min，在517 nm處測(cè)吸光值[19]。

式中：Ac為用無(wú)水乙醇代替樣品液時(shí)的吸光度；Aj為加樣品，用無(wú)水乙醇代替DPPH時(shí)的吸光度；Ai為加樣品與DPPH時(shí)的吸光度。

1.3.14.2 ABTS+·清除率測(cè)定

將ABTS溶液(7 mmol/L)與過(guò)硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)以1∶1混合均勻，于室溫下避光14～16 h，記作ABTS母液。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(濃度0.20 mol/L)將ABTS母液稀釋至734 nm波長(zhǎng)處的吸光值為0.72～1.20[20]。

取1 mL樣品提取液與4 mL稀釋后的ABTS溶液反應(yīng)6 min，在734 nm處測(cè)吸光值。

式中：AC2、AS2分別為空白組和不同樣品組的吸光值。

1.3.14.3 還原能力測(cè)定

將2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液 和2.5 mL 2%的鐵氰化鉀溶液加入到0.1 mL提取液中，50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，搖勻，5 000 r/min離心10 min。吸取2.5 mL上清液并依次加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵和2.5 mL蒸餾水，靜置10 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin pro 2018作圖，使用SPSS 26.0中單因素ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

可溶性固形物以可溶性糖類(lèi)為主，還包括有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22]?？扇苄怨绦挝锱c發(fā)酵進(jìn)行程度、發(fā)酵產(chǎn)生的可溶性糖和有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)呈正相關(guān)。圖1為接種比例、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量對(duì)雜糧代餐粉可溶性固形物的影響。

圖1 接種比例、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量對(duì)雜糧代餐粉的可溶性固形物影響

植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌的比例為1∶2時(shí)，可溶性固形物達(dá)到最大值。2個(gè)菌種的接種比例從0∶1到1∶0，可溶性固形物先上升后下降，因?yàn)橹参锶闂U菌添加量的增加促進(jìn)了兩菌種間的協(xié)同作用，可溶性固形物上升，而過(guò)多的植物乳桿菌又會(huì)與嗜酸乳桿菌產(chǎn)生拮抗作用，形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而抑制發(fā)酵的進(jìn)行，可溶性固形物減少。

隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，可溶性固形物先增大后減少。可能因?yàn)殡S著底物中碳源和氮源的減少，菌種正常代謝受阻，導(dǎo)致植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)緩慢，菌種活性的減弱進(jìn)而導(dǎo)致可溶性固形物溶出速度減慢，最后達(dá)到飽和，即7 h處。7 h后隨著乙醇等微生物發(fā)酵產(chǎn)物的積累，致使可溶性固形物所占比例減少。

發(fā)酵溫度在28～37 ℃之間時(shí)，可溶性固形物直線上升，37 ℃后呈下降趨勢(shì)?？赡芤?yàn)檫m宜的溫度提高兩個(gè)菌種的繁殖速率，菌種良好的代謝可以更好地降解植物細(xì)胞壁并釋放可溶性固形物[23]。當(dāng)發(fā)酵溫度低于37 ℃菌種代謝活動(dòng)緩慢，可溶性固形物較小，高于37 ℃代謝活動(dòng)又受到抑制，只有發(fā)酵溫度在37 ℃時(shí)，菌種才能達(dá)到最適生長(zhǎng)溫度，此時(shí)可溶性固形物越大含量最高。

隨接種量增加，可溶性固形物呈先上升后下降趨勢(shì)。這可能是由于微生物生長(zhǎng)受碳源和氮源影響，菌種只有在底物充足的條件下才能穩(wěn)定生長(zhǎng)[24]。在接種量為7%時(shí)可溶性固形物達(dá)到最大值，說(shuō)明此時(shí)活菌數(shù)較多，乳桿菌對(duì)底物反應(yīng)充分。接種量繼續(xù)增加，菌種間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用使生長(zhǎng)繁殖受到抑制，導(dǎo)致菌種對(duì)底物反應(yīng)不充分，可溶性固形物含量降低。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以可溶性固形物和沖調(diào)性為指標(biāo)，利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。利用加權(quán)系數(shù)法賦予各指標(biāo)權(quán)重分別為可溶性固形物占40%，沖調(diào)性占60%。按公式計(jì)算[25]：

綜合分=A1×40%+A2×30%+A3×30%

式中：A1為可溶性固形物隸屬度；A2為分散時(shí)間隸屬度；A3為潤(rùn)濕時(shí)間隸屬度。

如表2可知，各因素對(duì)雜糧代餐粉的綜合分影響主次順序?yàn)镈>B>C>A。取得綜合分最大時(shí)的組合A3B2C1D3為最優(yōu)組合。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可知，接種量對(duì)雜糧代餐粉的綜合分影響顯著(P<0.05)，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接種比例影響不顯著且對(duì)綜合分的影響程度依次遞減。

表3 方差分析

2.3 色澤測(cè)定結(jié)果

色澤是反映產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其中色度C*表示顏色的色調(diào)和飽和度，色度值升高，顏色越深。如表4所示，樣品組色度小于對(duì)照組，說(shuō)明樣品組顏色更淺。兩樣品色相角H*相差不大，樣品組的總顏色E*比對(duì)照組增加了29.28%。色差ΔE是用數(shù)值方式表示兩顏色之間色彩的差別，發(fā)酵使ΔE減小，說(shuō)明樣品組與標(biāo)準(zhǔn)白板相比色澤變化更小，顏色更亮。白度W可以量化色澤的變化，樣品組與對(duì)照組相比增加了33.18%，可能由于菌種生長(zhǎng)繁殖等原因?qū)е庐a(chǎn)品白度發(fā)生改變[26]。

表4 發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉色澤的影響

2.4 水合特性測(cè)定結(jié)果

吸水指數(shù)反映了粉體的糊化程度。由表5可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理的雜糧代餐粉吸水指數(shù)下降。與對(duì)照組相比，樣品組的水溶性顯著增加，25 ℃和100 ℃分別增加了1.38、1.42倍。這可能是因?yàn)闃悠方?jīng)發(fā)酵處理后淀粉等大分子化合物被分解成小分子物質(zhì)，比表面積增大，易于水溶性物質(zhì)溶出。另外，發(fā)酵處理可能會(huì)使部分不溶于水成分的價(jià)鍵發(fā)生斷裂，從而轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì)。膨脹勢(shì)反映了淀粉懸浮液在糊化過(guò)程中的吸水性和離心后的持水能力[27]。對(duì)照組相比，樣品組膨脹能力顯著提高。

表5 發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉水合特性的影響

2.5 持水力、持油力測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，樣品組的持水力與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，持油力減弱。這是由于發(fā)酵處理使雜糧代餐粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生部分降解而變得疏松，表面羧基、羥基等親水基團(tuán)暴露[28]，從而使持水力變大；而油脂與其接觸面積減小，導(dǎo)致持油力變小。

圖2 發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉持水力和持油力的影響

2.6 粉體特性測(cè)定結(jié)果

松密度和輕敲密度主要與顆粒大小、形狀，以及顆粒間的黏附趨勢(shì)和孔隙率有關(guān)[29]，密度越大，填充性越好。如表6可知，雜糧代餐粉經(jīng)發(fā)酵處理后松密度與輕敲密度均增加。休止角和滑角反映了粉體的流動(dòng)性，角度越小，流動(dòng)性越好，流動(dòng)性好的產(chǎn)品可以增加其穩(wěn)定性、混合后不易分層[30]。樣品組的休止角和滑角均比對(duì)照組小，說(shuō)明樣品組的流動(dòng)性更好。經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理的雜糧代餐粉Carr指數(shù)和Hausner比值分別減小了32.75%、9.77%。說(shuō)明發(fā)酵可以提高粉體的流動(dòng)性，對(duì)產(chǎn)品在生產(chǎn)和運(yùn)輸中具有重要意義。

表6 發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉粉體特性的影響

一般認(rèn)為，a值越小，粉體的流動(dòng)性越好；1/b值越小，粉體的填充速度越大，填充更易于進(jìn)行。由表7可知，樣品組a值和1/b均小于對(duì)照組。這表明樣品組的流動(dòng)性和填充性均較對(duì)照組有所提升。

表7 川北方程擬合參數(shù)結(jié)果

2.7 DSC測(cè)定結(jié)果

由表8可知，樣品組的糊化起始溫度T0低于對(duì)照組，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理的雜糧代餐粉更易于糊化。與對(duì)照組相比，樣品組熱焓值ΔH增加，可能因?yàn)榘l(fā)酵使直鏈淀粉含量增加，其溶出利于脂類(lèi)與其結(jié)合形成復(fù)雜的雙螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增加了糊化過(guò)程中所需的熱量。

表8 雜糧代餐粉的DSC變化的熱分析數(shù)據(jù)

2.8 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

由表9可知，與對(duì)照組相比，樣品組的DPPH·清除率和ABTS+·清除率均提高。此外，發(fā)酵對(duì)產(chǎn)品的還原能力也有所提升。研究表明，發(fā)酵產(chǎn)品具有較強(qiáng)的抗氧化活性，主要原因?yàn)椋阂皇蔷N產(chǎn)生的酶與不同基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而具有抗氧化性，二是發(fā)酵使氨基酸轉(zhuǎn)氨生成α-酮酸，進(jìn)一步降解產(chǎn)生醛類(lèi)、羧酸等抗氧化活性物質(zhì)[31]。

表9 雜糧代餐粉的抗氧化性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以雜糧為原料，利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)雜糧代餐粉發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探究了發(fā)酵對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)特性、抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，雜糧代餐粉最佳發(fā)酵條件為：接種比例1∶1，發(fā)酵時(shí)間7 h，發(fā)酵溫度34 ℃，接種量9%。通過(guò)對(duì)雜糧代餐粉品質(zhì)特性的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵對(duì)雜糧代餐粉色澤影響顯著；經(jīng)發(fā)酵處理的雜糧代餐粉吸水指數(shù)減小，水溶性、膨脹勢(shì)、持水力增強(qiáng)，持油力減弱；粉體流動(dòng)性和填充性均得到改善；更加易于糊化；DPPH·清除率、ABTS+·清除率、還原能力提高。