高溫-復(fù)合酶法改性小米糠膳食纖維工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)與功能分析

丁彩云，糟 帆，馬玉婷，劉 軍，劉敦華，傅 婧

(寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，銀川 750021)

小米糠是小米加工脫殼后的副產(chǎn)物，營養(yǎng)成分豐富[1]，尤其膳食纖維(DF)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在18%以上[2]。目前大部分小米糠只是直接或經(jīng)過粗加工后用作畜禽飼料，產(chǎn)品附加值很低。

研究表明膳食纖維具有降糖降脂、調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力等生理功能[3]。根據(jù)在水中的溶解程度，DF分為可溶性膳食纖維(SDF)與不可溶性膳食纖維(IDF)，相比IDF，SDF具有更多的功能特性[4]。因此，通過膳食纖維改性來制備SDF具有現(xiàn)實意義。DF的改性方法主要有物理、生物和化學(xué)改性。化學(xué)改性可以在一定程度上改善膳食纖維的結(jié)構(gòu)，但化學(xué)試劑的引入可能會給人體帶來安全隱患。物理-生物改性工藝簡單、反應(yīng)條件溫和、專一性強、對設(shè)備要求低且環(huán)境友好，從而具有良好研究前景。Song等[5]通過擠壓后在纖維素酶20 U/g，pH 4.5，溫度為50 ℃下持續(xù)處理240 min，提高了竹筍膳食纖維中SDF含量(22.7 g/100 g)，發(fā)現(xiàn)纖維素酶能夠增加功能基團(tuán)的暴露，從而提高陽離子交換能力、葡萄糖和膽固醇吸附能力。Liu等[6]將5%的纖維素酶與經(jīng)過預(yù)水洗結(jié)合α-淀粉酶、堿性酶處理后的米糠膳食纖維混合，以料液比1∶15加入乙酸和乙酸鈉混合液，在沸水中水浴30min得到纖維素酶改性米糠膳食纖維，發(fā)現(xiàn)經(jīng)改性后DF的保水性、保油性、膨脹性、膽固醇和葡萄糖吸附能力有所提高，并降低了其乳化能力和葡萄糖透析延遲指數(shù)。郭天時等[7]通過木聚糖酶結(jié)合微粉作用對脫脂米糠膳食纖維改性大幅提高了SDF得率，同時提高了持水力、持油力。汪楠等[8]發(fā)現(xiàn)相較于纖維素酶、高溫蒸煮單一改性，通過高溫蒸煮協(xié)同纖維素酶改性竹筍膳食纖維，其粒徑最小，持水力、持油力、膨脹力最大，熱穩(wěn)定性最強。

DF是谷物中最典型的功能性物質(zhì)，目前研究主要集中在小麥、稻谷、燕麥和玉米等谷物的加工副產(chǎn)物上，對小米糠DF改性及改性后的理化、功能性質(zhì)的研究較少。高溫處理能夠顯著提高SDF得率，有效改善膳食纖維的理化和功能性質(zhì)，關(guān)于高溫改性小米糠膳食纖維鮮有研究。前期預(yù)實驗分析對比了纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶改性后SDF的得率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素酶和木聚糖酶復(fù)合改性后SDF得率最高。本研究通過高溫-復(fù)合酶法改性，提高SDF得率并分析其結(jié)構(gòu)和功能特性，以期為小米的綜合利用及小米糠可溶性膳食纖維的制備和功能性食品的開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

小米糠；木聚糖酶(5 000 U/g)、纖維素酶(10 000 U/g)、耐高溫α-淀粉酶(40 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)和中性蛋白酶(200 000 U/g)；氫氧化鈉、鹽酸、膽固醇、鄰苯二甲醛、正己烷、濃硫酸、冰乙酸等，均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SE750高速粉碎機，V-5100可見分光光度計，F(xiàn)D-1A-50真空冷凍干燥機RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，TDL-5-A型低速臺式大容量離心機，SZF-06A型脂肪測定儀。

1.2 方法

1.2.1 小米糠總DF制備

參考Zheng等[9]和Dhital等[10]的方法。小米糠粉碎過60目篩，正己烷回流脫脂。稱取干燥脫脂米糠以料液比1∶10加蒸餾水，調(diào)pH至4.5，60 ℃水浴攪拌2 h去除植酸，3 500 r/min離心20 min，去上清液；沉淀按料液比1∶12加蒸餾水糊化(95 ℃，30 min)，加入高溫α-淀粉酶酶解(pH 6.5，95 ℃，30 min)，直至碘液不變藍(lán)為止；糖化酶酶解(pH 4.0～4.5，60 ℃，30 min)；中性蛋白酶酶解(pH 7.0～7.8，60 ℃，90 min)，沸水浴10 min滅酶，3 500 r/min離心 20 min，沉淀于60 ℃真空干燥，得到小米糠總膳食纖維(DF)。

1.2.2 小米糠DF的高溫預(yù)處理

將小米糠總膳食纖維(DF)和蒸餾水按一定比例放入錐形瓶后，置于立式蒸汽壓力滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行高溫改性(120 ℃，20 min)。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將濃縮液冷凍干燥粉碎，制得高溫改性小米糠膳食纖維(TDF)。

1.2.3 高溫-復(fù)合酶法改性小米糠膳食纖維[11,12]

在1.2.2高溫預(yù)處理的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)合酶法改性。以料液比1∶15加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值4.5及適宜溫度后加入酶，持續(xù)攪拌1.5 h后滅酶，4倍無水乙醇沉淀12 h，3 500 r/min離心得沉淀，真空冷凍干燥并研磨制得高溫-復(fù)合酶改性膳食纖維(T-EDF)。以小米糠SDF得率為指標(biāo)，分別考察高溫-復(fù)合酶法的改性條件。

SDF得率=SD質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%。

1.2.4 高溫-復(fù)合酶法改性小米糠膳食纖維的響應(yīng)面優(yōu)化實驗

采用Box-Behnken實驗原理，取復(fù)合酶比例、復(fù)合酶添加量、酶解時間和酶解溫度4個因素為自變量，以SDF得率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken實驗，見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平

1.2.5 改性前后小米糠膳食纖維的結(jié)構(gòu)檢測與分析

1.2.5.1 色度分析

參照參考文獻(xiàn)[13]。記錄L*值、a*值及 b*值，L*值代表亮度及暗度，a*值表示紅度(+)及綠度(-)，而 b*值代表藍(lán)度(-)及黃度(+)。

1.2.5.2 膳食纖維微觀結(jié)構(gòu)表征

取適量小米糠、DF、TDF及T-EDF樣品置于玻璃片，在放大倍數(shù)200、1 000及2 000倍的條件下，通過掃描電鏡觀察樣品的表觀結(jié)構(gòu)。

1.2.5.3 纖維樣品分子結(jié)構(gòu)測定

參照李雁等[14]的方法。分別取適量小米糠、DF、TDF及T-EDF與KBr按1∶100的比例混合并研磨均勻，然后在7 MPa的條件下壓制成薄片。

1.2.5.4 纖維樣品結(jié)晶度測定

取適量小米糠及幾種膳食纖維粉末置于樣品架，用PW-1710型 X射線衍射儀進(jìn)行掃描分析，觀察樣品出峰位置和形狀，用Origin 7.5軟件計算其結(jié)晶度。

1.2.6 改性前后小米糠膳食纖維的功能特性研究

1.2.6.1 葡萄糖吸附能力測定

參照劉歡等[15]的方法并做修改。

1.2.6.2 膽固醇吸附性的測定

分別稱取0.5 g小米糠、DF、TDF、T-EDF于50 mL燒杯中，加入25 mL攪打均勻的蛋黃乳液，調(diào)pH至2和7，于37 ℃水域搖床振蕩2 h。4 000 r/min離心10 min。取上清液1 mL，顯色反應(yīng)后在波長570 nm處測定其吸光度。

1.2.6.3 陽離子交換能力

分別稱取0.5 g小米糠、DF、TDF、T-EDF于燒杯中，加入50 mL 0.1 mol/L HCl于4 ℃放置過夜，3 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌數(shù)次除去Cl-，將殘渣冷凍干燥。稱取0.25 g經(jīng)處理的樣品加入100 mL 15% NaCl溶液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定(酚酞作指示劑)，振搖5 min仍不褪色為滴定終點，不加樣品的做空白。

1.2.6.4 α-淀粉酶抑制能力測定

參照呂靜[16]的方法并做修改。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Origin 2018、SPSS12.00軟件進(jìn)行單因素差異分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，響應(yīng)面實驗用DesignExpert.V8.0.6.1軟件作圖及分析數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米糠及總DF基本營養(yǎng)成分分析

由表2可知，小米糠含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，以DF為主。DF經(jīng)酶制備后，膳食纖維純度增加了36.55%，相比黃冬云等[12]經(jīng)脫脂處理的膳食纖維純度增加了9.82%。小米糠和DF中各營養(yǎng)成分含量均存在顯著性差異(P<0.01)，其中，蛋白質(zhì)、淀粉去除率達(dá)到86.35%、94.83%，說明DF制備過程中雜質(zhì)去除較為徹底。

表2 小米糠和 DF 中主要營養(yǎng)成分含量(g/100 g)

2.2 高溫-復(fù)合酶法改性小米糠膳食纖維的單因素實驗

圖1是高溫-復(fù)合酶法改性小米糠膳食纖維的單因素實驗結(jié)果。當(dāng)木聚糖酶是纖維素酶的1.5倍時，SDF得率達(dá)到最大，是因為木聚糖酶將不溶性的半纖維素降解為可溶性的，因此SDF得率升高；但當(dāng)木聚糖酶大于纖維素酶的1.5倍時，SDF得率下降，可能是半纖維素降解的速度超過了其生成速度[17]。因此纖維素酶與木聚糖酶的比例為1∶1.5時為最佳。

圖1 T-EDF的單因素實驗結(jié)果

復(fù)合酶用量在1%～2%的過程中，SDF得率顯著增大，且在2%處達(dá)到最大。這可能是由于復(fù)合酶促進(jìn)纖維素水解生成了單糖、可溶性多糖等物質(zhì)[18]。當(dāng)復(fù)合酶用量高于2%，SDF繼續(xù)降解為小分子物質(zhì)，得率隨之下降。選擇復(fù)合酶用量為2%。

隨反應(yīng)時間增加，SDF得率先增后降，當(dāng)反應(yīng)時間在1.5 h時SDF得率達(dá)到最大值，可能是因為適當(dāng)?shù)拿附鈺r間可促進(jìn)纖維素將不溶性大分子水解為可溶性小分子物質(zhì)；而隨酶解時間的延長，SDF繼續(xù)降解但醇沉卻不能析出，因此SDF得率下降[19]。酶解時間選擇1.5 h為最佳。

此外，隨酶解溫度的升高，SDF得率亦呈先增后降的趨勢。從40～50 ℃的過程中，SDF得率升高和溫度與酶活性相關(guān)，溫度太低導(dǎo)致酶活性受抑制；在50 ℃時，酶活性最強，反應(yīng)速度最快，SDF得率最高；但超過50 ℃后，酶變性甚至失活，SDF得率下降。選擇酶解溫度50 ℃為最適。

2.3 高溫-復(fù)合酶改性小米糠膳食纖維的響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

高溫-復(fù)合酶法改性小米糠膳食纖維的響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果如表3所示，并利用Design-Expert 8.0.6軟件分析二次回歸參數(shù)模型，結(jié)果如表4所示。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計方案及結(jié)果

由表3可見，整體模型P<0.000 1，二次方程模型極顯著，且失擬項P為0.288 7不顯著，說明回歸模型擬合度較好，實驗誤差小。R2為0.948 2，大于90%，相關(guān)性較好，說明此模型能夠反映響應(yīng)值的變化，可用該模型對小米糠膳食纖維高溫-復(fù)合酶法改性的結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測[20]。由表4可得各因素與響應(yīng)值關(guān)系的四元二次回歸方程為：

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗

Y=75.19+0.92X1+0.1X2+9.43X3+0.40X4+0.16X1X2+0.036X1X3+0.24X1X4+0.053X2X3+0.15X2X4+0.23X3X4-27.14X12-17.40X22-34.03X32-19.26X42。說明影響SDF得率大小的順序為酶解時間>復(fù)合酶比例>酶解溫度>復(fù)合酶用量。

2.3.2 各因素兩兩交互作用對 SDF得率的影響

任意因素固定不變(0水平)的條件下，比較各因素兩兩交互對SDF得率的影響，結(jié)果如圖2所示。各因素交互作用的等高線呈橢圓形，說明交互作用顯著。通過軟件對模型分析確定最佳工藝條件為：復(fù)合酶比例1.82∶1，復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.99%，酶解溫度 49.93 ℃，酶解時間1.60 h，預(yù)測SDF得率為17.39%。為了驗證響應(yīng)面模型的可靠性，同時考慮實際操作，選擇最佳工藝參數(shù)為復(fù)合酶比例2∶1，復(fù)合酶用量2%，酶解溫度 50 ℃，酶解時間1.50 h，并在此工藝參數(shù)下重復(fù)3次驗證實驗，得到SDF的實際得率為(17.27±1.57)%，與理論值接近且重復(fù)性較好，說明此回歸模型具有可靠性和有效性。

圖2 各因素交互作用對SDF得率影響的響應(yīng)面圖

2.4 改性前后膳食纖維色度測定

如表5所示，脫脂小米糠改性后，L*值均有下降。然而，纖維樣品的a*值及b*值則因改性方式不同而有不同程度的增加，色度測定表明膳食纖維經(jīng)過兩種改性后均可輕微提高樣品顏色。膳食纖維顏色發(fā)生改變的原因可能是粒徑、表面粗糙程度、內(nèi)容物的變化等，但是改性前后膳食纖維粉末均為微黃色。

表5 脫脂小米糠、DF、TDF及T-EDF的色度

2.5 改性前后小米糠的微觀結(jié)構(gòu)分析

掃描電鏡可觀測電子束照射到樣品表面的凹凸情況，從而分析改性后膳食纖維的結(jié)構(gòu)特性，確定其表面形態(tài)。圖3為脫脂小米糠和膳食纖維的微觀結(jié)構(gòu)圖，可以看出4種樣品顆粒表面形態(tài)發(fā)生顯著變化。脫脂小米糠呈現(xiàn)出不規(guī)則、表面光滑無孔洞的片狀結(jié)構(gòu)，表面附著大量球狀和塊狀物質(zhì)，可能是分離純化后殘留的蛋白質(zhì)聚合物及小淀粉顆粒[21]。DF呈現(xiàn)出規(guī)律、緊湊的片狀結(jié)構(gòu)，表面光滑規(guī)整，內(nèi)部則是中空的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布。經(jīng)過高溫α-淀粉酶和蛋白酶處理，樣品表面只殘存很少的圓球狀顆粒，說明雜質(zhì)去除較為徹底。TDF的纖維表面明顯光滑，內(nèi)部呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而T-EDF表面粗糙，帚化微纖維增加[22]，復(fù)合酶的作用使纖維表面水解，促進(jìn)了扁平帶狀結(jié)構(gòu)的破裂和脫離。使得膳食纖維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更疏松的狀態(tài)，形成更強的毛細(xì)管吸附作用，從而改善膳食纖維的功能特性[23]。

圖3 脫脂小米糠及其膳食纖維的掃描電子顯微鏡圖(×2 000)

2.6 改性前后小米糠的紅外光譜分析

如圖4所示，改性前后膳食纖維紅外光譜圖相似，但是部分吸收峰有所變化。膳食纖維的紅外光譜圖(4 000～500 cm-1)中均包含了烴基、吡喃糖環(huán)所含乙醇基的C—O伸縮振動，吡喃糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特征鍵C—O—C的不對稱收縮振動，脂肪族類C—H對稱和非對稱伸縮振動，C—H不對稱和對稱彎曲，C—C伸縮振動等一系列典型多聚糖的吸收峰[14]。在3 400～3 300 cm-1處的強吸收峰是O—H基團(tuán)，其主要源自果膠和纖維素，此外，T-EDF在3 423 cm-1處的峰遷移至3 404.3 cm-1處，吸收峰遷移和強度增強的原因可能是高溫-復(fù)合酶處理后纖維素分子結(jié)構(gòu)被破壞，去除了多數(shù)的木質(zhì)素[24]，部分糖苷鍵斷裂形成氫鍵。改性前后的4種樣品在2 924 cm-1和1 742 cm-1處有弱吸收峰，均有C—H的反對稱拉伸和彎曲振動引起，主要來源于部分多糖的亞甲基和羰基。綜上，經(jīng)過改性后的膳食纖維的吸收峰無明顯變化，說明無基本化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞。吸收峰強度的差異是由于含量或結(jié)合程度不同，同時說明高溫-復(fù)合酶法能有效去除原纖維中無定形組分。

圖4 脫脂小米糠及其膳食纖維的紅外光譜圖

2.7 改性膳食纖維的X-RD分析

圖5為脫脂小米糠及其改性膳食纖維的XRD圖。脫脂小米糠在掃描角度2θ為22.86°處有明顯的結(jié)晶衍射峰，同時在15.16°處有較弱的衍射峰，這些峰均表明脫脂小米糠具有典型的纖維素Ⅰ型的X射線衍射曲線特征[25]，為結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)兩相共存的狀態(tài)。DF、TDF以及T-EDF的XRD圖譜形狀相似，表明其結(jié)晶特征變化不大，其主衍射峰分別在2θ為21.88°、21.62°和22°處，且在34.5°附近具有微弱的衍射峰，說明三者的晶體類型均為纖維素I型，為結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)兩相共存的狀態(tài)[26]；另外，根據(jù)軟件曲線法擬合計算出脫脂小米糠、DF、TDF和T-EDF的結(jié)晶度分別為33.76%、35.01%、37.78%和55.56%，即改性后樣品的結(jié)晶度均高于小米糠，可能與小米糠中蛋白質(zhì)殘基的去除有關(guān)，同時表明無定形區(qū)的纖維素更易遭到破壞。T-EDF結(jié)晶度較高，推測是復(fù)合酶作用于DF中的半纖維素以及纖維素中的無定形區(qū)所致[27]。

圖5 脫脂小米糠及膳食纖維XRD圖譜

2.8 改性膳食纖維的功能性質(zhì)

由圖6a可知，經(jīng)過酶法提取后的DF較脫脂小米糠葡萄糖吸附能力顯著提高(P<0.05)，而經(jīng)高溫-復(fù)合酶改性處理后吸附能力略有提高。改性處理使膳食纖維表面孔隙增大，結(jié)構(gòu)更疏松，功能基團(tuán)暴露，葡萄糖吸附能力隨之增大[28]。所有經(jīng)過預(yù)處理的膳食纖維都能吸附少量的葡萄糖，這就表明小米糠膳食纖維能夠在一定程度上降低小腸中的葡萄糖濃度。

由圖6b可知，膽固醇的吸附能力在中性條件(模擬小腸環(huán)境)明顯強于酸性環(huán)境(模擬胃的pH環(huán)境)，這與多數(shù)研究結(jié)果一致，可能是大量的H+與膽固醇攜帶的部分正電荷產(chǎn)生相互排斥的作用，導(dǎo)致吸附能力有所下降[29,30]。改性后膳食纖維的膽固醇吸附能力均大于改性前的吸附能力，在pH=2時，T-EDF的膽固醇吸附性較強，分別是脫脂小米糠、DF、的1.29、1.15倍，但沒有TDF的吸附性高，可能是由于酸性條件下高溫使得膳食纖維內(nèi)部基團(tuán)暴露更易于膽固醇結(jié)合；在pH=7時，T-EDF的膽固醇吸附性最強，分別是脫脂小米糠、DF、TDF的1.55、1.36、1.22倍。

膳食纖維分子結(jié)構(gòu)中存在大量羧基和羥基的側(cè)鏈基團(tuán)，能夠與陽離子可逆交換。由圖6c可觀察到，陽離子交換能力大小依次為：T-EDF>TDF>DF>脫脂小米糠，說明改性處理可以提高陽離子交換能力，這可能是由于改性處理使膳食纖維粒徑減小，表面更光滑，從而表面糖醛酸結(jié)合位點暴露，更易于陽離子交換。這與傅里葉紅外光譜測定結(jié)果一致[31]。

由圖6d可知，對照組葡萄糖生成含量相比(1.1 mg/g)，4種樣品的添加均使葡萄糖含量降低，表明4種樣品對α-淀粉酶均有一定的抑制作用。脫脂小米糠對α-淀粉酶的抑制率較其他3種樣品最低，是因為膳食纖維可以包埋淀粉和淀粉酶從而限制淀粉與淀粉酶之間的相互作用，甚至膳食纖維表面可能附著抑制劑，從而可以直接抑制酶的活性[32]。

圖6 脫脂小米糠及膳食纖維功能特性

3 結(jié)論

通過Box-Behnken實驗設(shè)計，結(jié)合響應(yīng)面分析及實際操作，最終確定高溫-復(fù)合酶法改性脫脂小米糠膳食纖維的最優(yōu)工藝條件為復(fù)合酶比例2∶1、復(fù)合酶2%、時間1.50 h及溫度50 ℃。在此條件下，SDF得率達(dá)到(17.27±1.57)%，比高溫改性小米糠SDF提高了6.48%。

通過紅外光譜和X射線衍射分析結(jié)果顯示，改性前后膳食纖維的結(jié)構(gòu)具有明顯的糖類特征吸收峰，且改性前后的特征吸收峰的峰形、位置無明顯變化；改性后XRD圖譜相似，晶體類型不變，均為纖維素Ⅰ型，但是結(jié)晶度上升，表明改性后膳食纖維表面結(jié)構(gòu)被破壞，使纖維素結(jié)晶區(qū)暴露。此外，脫脂小米糠改性后其葡萄糖、膽固醇吸附能力及陽離子交換能力顯著增強。