高溫蒸煮-復(fù)合酶法制備綠豆皮可溶性膳食纖維及體外降血糖作用研究

張向輝，羅 磊，段雪瑩，李瀚姝，趙一帆，楊浩昆，馬 瀟

(河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心；河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

綠豆是一種藥食兩用的作物，除了口感鮮美、風(fēng)味獨(dú)特外，還具有多種生理功能。綠豆皮含有豐富的膳食纖維(DF)和多酚類(lèi)物質(zhì)，具有降血脂[1]、降血糖[2]、抗腫瘤[3]等多種功能成分。由于綠豆皮硬度高，口感差，在綠豆食品加工過(guò)程中很大程度上被用作動(dòng)物飼料、肥料或作為廢物處置。因此，如果將這些綠豆皮以再加工的方式使之轉(zhuǎn)化為增值產(chǎn)品，將會(huì)產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。杜冰等[4]采用雙螺桿擠壓技術(shù)提取綠豆皮可溶性膳食纖維(SDF)，得率為8.5%。羅磊等[5]采用超微粉碎技術(shù)輔助酶法提取綠豆皮SDF，得率為14.02%，但其得率仍有提升空間[6]。

纖維素酶和木聚糖酶可以水解DF原料中的纖維素和半纖維素成分，使纖維素多糖分子量降低，聚合度下降，SDF含量大大提升[7]。Ma等[9]指出纖維素酶/木聚糖酶處理使馬鈴薯渣SDF質(zhì)量分?jǐn)?shù)從17.45%提高到26.82%[8]。高溫高壓蒸煮會(huì)使木質(zhì)素熔化，半纖維和纖維素分子斷裂降解。劉灣等[10]采用高溫蒸煮制備蒜皮SDF，發(fā)現(xiàn)得率由5.31%提升到10.54%[9]。孫靜等[10]采用高溫蒸煮結(jié)合纖維素酶提取棗渣SDF，得率為20.03%?？梢钥闯觯邷卣糁?復(fù)合酶對(duì)于DF的處理，明顯提升了SDF的含量。

目前從綠豆皮中提取到性能良好DF的研究仍進(jìn)展較慢，SDF得率仍較低，基于此，探究合適的DF處理方法，提升SDF含量與性質(zhì)，將有助于更好的開(kāi)發(fā)綠豆皮作為優(yōu)良功能性食品的原材料。另外對(duì)于高溫蒸煮-復(fù)合酶法處理綠豆皮DF的研究鮮有報(bào)道。本研究采用高溫蒸煮復(fù)合纖維素酶和木聚糖酶法提取綠豆皮SDF，并對(duì)所得DF吸附葡萄糖、延緩葡萄糖擴(kuò)散和抑制碳水化合物消化酶活性進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)綠豆皮高附加值產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮；蛋白酶(10 U/mg)、淀粉酶(37 U/mg)、纖維素酶(40 U/mg)、木聚糖酶(13 U/mg)；乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，SHA-B數(shù)顯恒溫?fù)u床水浴鍋，TDZ5-WS臺(tái)式離心機(jī)，UV2400紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，101-2-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮SDF的制備

借鑒汪楠等[11]制備竹筍膳食纖維的方法制備綠豆皮SDF。

綠豆皮經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)60目篩，得綠豆皮粗粉，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.1.1 空白對(duì)照綠豆皮SDF樣品的制備

以料液比1∶20(g∶mL)把綠豆皮粗粉加入去離子水中后，依次加入1%淀粉酶(37 U/mg)、1%蛋白酶(10 U/mg)，于60 ℃恒溫振蕩水浴環(huán)境中分別反應(yīng)1 h，酶解完成后，100 ℃下煮沸10 min滅酶。分離方法：抽濾，得濾渣和濾液；濾渣用4倍體積100 ℃沸水洗滌，沸水洗滌后的濾渣產(chǎn)物即為綠豆皮不溶性膳食纖維(LIDF)；沸水洗滌后的濾渣濾液與抽濾后的濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約25%，加4倍體積95%乙醇，醇沉10 h，4 800 r/min離心15 min得沉淀，50 ℃干燥箱中干燥18 h，即得空白對(duì)照綠豆皮SDF樣品(LSDF)。

1.3.1.2 高溫蒸煮綠豆皮SDF樣品的制備

取沸水洗滌后的濾渣產(chǎn)物作為制備高溫蒸煮綠豆皮SDF樣品的原材料。按照一定料液比、溫度、時(shí)間，在高壓滅菌鍋中進(jìn)行高溫蒸煮綠豆皮SDF樣品的制備(GSDF)，分離方法同1.3.1.1。

1.3.1.3 高溫蒸煮-復(fù)合酶綠豆皮SDF樣品的制備

在1.3.1.2中SDF得率最高的條件下，將蒸煮后的料液調(diào)節(jié)到纖維素酶(40 U/mg)、木聚糖酶(13 U/mg)適宜條件下酶解，制備高溫蒸煮-復(fù)合酶綠豆皮SDF樣品(MSDF)，分離方法同1.3.1.1。

1.3.2 GSDF提取工藝研究

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g LIDF，壓力0.12 MPa，固定料液比1∶35、蒸煮時(shí)間30 min、蒸煮溫度115 ℃，分別探究料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)、蒸煮溫度(110、115、120、125、130 ℃)、蒸煮時(shí)間(25、35、45、55、65 min)對(duì)GSDF得率的影響。

GSDF得率=GSDF質(zhì)量/LIDF質(zhì)量×100%

1.3.2.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

以料液比、蒸煮溫度、蒸煮時(shí)間為變量，以GSDF得率為指標(biāo)，采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化GSDF提取工藝。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 高溫蒸煮條件下正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.3 MSDF提取工藝研究

1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在最佳結(jié)果條件基礎(chǔ)上進(jìn)行酶解，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品，固定木聚糖酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%、纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度50 ℃，分別探究木聚糖酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%)、纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、酶解時(shí)間(30、60、90、120、150 min)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對(duì)MSDF得率的影響。

MSDF得率=MSDF質(zhì)量/LIDF質(zhì)量×100%

1.3.3.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

以木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為變量，以MSDF得率為指標(biāo)，采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化MSDF提取工藝。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 高溫蒸煮結(jié)合復(fù)合酶條件下正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.4 SDF理化特性及體外降血糖能力測(cè)定方法

1.4.1 基本理化性質(zhì)的測(cè)定

參照何曉琴等[12]的方法測(cè)定持水力(WHC)、持油力(OHC)、膨脹力(WSC)。

1.4.2 葡萄糖擴(kuò)散抑制能力的測(cè)定

參照李菁等[13]的方法。

葡萄糖透析延遲指數(shù)=(c1-c)/c×100%

式中：c1為對(duì)照組組透析液中葡萄糖濃度/mmol/L；c為樣品組透析液中葡萄糖濃度/mmol/L。

1.4.3 葡萄糖吸附力測(cè)定

參照Z(yǔ)heng等[14]的方法并稍作修改。于100 mL不同濃度葡萄糖溶液中(50、100、150、200、250 mmol/L)，分別加入0.5 g和1 g的LSDF、GSDF、MSDF，37 ℃以150 r/min速度下水浴振蕩4 h，4 800 r/min離心15 min得上清液。用DNS法測(cè)量。

葡萄糖吸附力=(c0-c1)/m0×V0

式中：c0為吸附前溶液中葡萄糖濃度/mmol/L；c1為振蕩4 h后溶液中上清液葡萄糖濃度/mmol/L；V0為離心后上清液體積/mL)；m0為SDF樣品質(zhì)量/g。

1.4.4 α-淀粉酶的抑制作用研究

參照Wang等[15]的方法并稍作修改。以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。于1 mL 25 U/mL的α-淀粉酶溶液中，分別加入不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的LSDF、GSDF、MSDF，在37 ℃下混勻并靜置10 min，后加入1 mL 1%的可溶性淀粉溶液，混勻后于37 ℃下反應(yīng)10 min。用DNS法進(jìn)行測(cè)量。

抑制率=(A0-A1)A0×100%

式中：A0為未添加樣品的吸光值；A1為添加樣品的吸光值。

1.4.5 SDF對(duì)α-淀粉酶的抑制類(lèi)型的確定

參照楊麗珍[16]的方法并稍作修改。取不同濃度(0.2、1.0、2.0 mg/mL)的LSDF、GSDF、MSDF樣品溶液作抑制劑，分別加入到不同濃度(0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)的可溶性淀粉溶液，按照1.4.3的方法，測(cè)量抑制劑加入淀粉溶液后，α-淀粉酶和各底物的反應(yīng)速率。分別以酶促反應(yīng)速率倒數(shù)(min/mmol)和底物濃度倒數(shù)(mL/mg)為縱、橫坐標(biāo)，采用雙倒數(shù)作圖法，進(jìn)行圖譜繪制，通過(guò)擬合曲線(xiàn)，確定抑制類(lèi)型。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定均重復(fù)3次。高溫蒸煮-復(fù)合酶提取SDF最優(yōu)條件優(yōu)化與單因素實(shí)驗(yàn)采用Origin 2019b作圖，正交實(shí)驗(yàn)采用 SPSS26.0 進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫蒸煮提取工藝研究

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1知，(1∶20～1∶30 g/mL)/(1∶30～1∶40 g/mL)，料液比與SDF得率呈正相關(guān)/輕微降低?？赡苁橇弦罕冗^(guò)低時(shí)，隨著比例增加，溶質(zhì)與水接觸面積增加[17]；但比例過(guò)高，溶質(zhì)被稀釋[18]，故選料液比1∶30 g/mL。

圖1 不同因素對(duì)綠豆皮SDF得率的影響

(25～45 min)/(45～65 min)，蒸煮時(shí)間與SDF得率呈正相關(guān)/負(fù)相關(guān)。可能是高溫下，多糖鏈分子內(nèi)作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而變?nèi)鮗19]；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，SDF結(jié)構(gòu)被破壞，醇沉?xí)r難析出[11]，故選蒸煮時(shí)間45 min。

(110～120 ℃)/(120～130 ℃)，蒸煮溫度與SDF得率呈正相關(guān)/輕微增加?？赡苁歉邷叵?，DF分子內(nèi)氫鍵、糖苷鍵易斷裂，小分子物質(zhì)更易溶出，使SDF得率增加[20]。從能耗角度考慮，選擇蒸煮溫度120 ℃。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3和表4可知，B>A>C，影響順序：蒸煮溫度>料液比>蒸煮時(shí)間；最佳條件：料液比1∶30、蒸煮溫度120 ℃、蒸煮時(shí)間45 min。經(jīng)驗(yàn)證，此條件下SDF得率10.29%。

表3 高溫蒸煮條件下正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 方差分析結(jié)果

2.2 高溫蒸煮結(jié)合復(fù)合酶提取工藝研究

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2知，(0.5%～1.5%)/(1.5%～2.5%)濃度下纖維素酶添加量與SDF得率成正比/輕微下降、(0.25%～0.75%)/(0.75%～1.5%)濃度下木聚糖酶添加量與SDF得率成正比/負(fù)比?？赡苁敲噶枯^低時(shí)，隨酶量增加，纖維素被纖維素酶酶解為可溶性半纖維素甚至葡聚糖組分變多[21]或是非淀粉多糖被木聚糖酶分解成較小聚合度的糖組分變多，使SDF含量增加；但酶量過(guò)高時(shí)，SDF被過(guò)度水解，難被乙醇醇沉[11]。故選纖維素酶1.5%、木聚糖酶0.75%。

圖2 不同因素對(duì)綠豆皮SDF得率的影響

(40～50 ℃)/(50～60 ℃)內(nèi)，酶解溫度與SDF得率呈正相關(guān)/負(fù)相關(guān)。可能是溫度較低時(shí)，隨溫度增高，酶活性提升；但超過(guò)最適溫度，酶活性降低，酶解不充分，SDF得率減小。故選酶解溫度50 ℃。

(30～90 min)/(90～150 min)內(nèi)，酶解時(shí)間與綠豆皮SDF得率呈正相關(guān)/負(fù)相關(guān)?？赡苁菚r(shí)間較低時(shí)，隨時(shí)間增大，酶解更徹底；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，SDF被進(jìn)一步降解，SDF得率變小。故選酶解時(shí)間90 min。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5和表6知，C>B>A>D，影響順序：酶解溫度>酶添加量>酶解時(shí)間>料液比；反應(yīng)最佳條件：酶解時(shí)間120 min、纖維素酶1.5%、酶解溫度50 ℃、木聚糖酶0.75%。經(jīng)驗(yàn)證，此條件下SDF得率20.12%。

表5 高溫蒸煮結(jié)合復(fù)合酶解條件下正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表6 高溫蒸煮結(jié)合復(fù)合酶條件下主體間效應(yīng)檢驗(yàn)表

不同類(lèi)別的處理方法對(duì)于DF性質(zhì)改變的機(jī)制是不同的[22]。高溫蒸煮與高溫蒸煮-復(fù)合酶分別為物理處理和物理/生物處理，為了明確不同處理過(guò)程中的影響效應(yīng)，故對(duì)前文的綠豆皮SDF樣品(LSDF)、高溫蒸煮SDF(GSDF)、高溫蒸煮-復(fù)合酶SDF(MSDF)三者均進(jìn)行理化性質(zhì)研究。

2.3 基本理化性質(zhì)研究

DF的WHC、OHC、WSC受其組分、表面結(jié)構(gòu)和顆粒大小的影響[6]。由表7知，高溫蒸煮及高溫蒸煮-復(fù)合酶處理后，WHC、OHC、WSC能力均明顯提升。GSDF和MSDF相比于LSDF，在WHC上分別提升了25.22%、49.86%，在OHC上分別提升了56.52%、136.96%，在WSC上分別提升了50.39%、103.54%，可能是高溫蒸煮-復(fù)合酶的處理使得DF結(jié)構(gòu)更為松散、空隙增大，水分、油脂更易與裸露在外的親水、親脂基團(tuán)相結(jié)合，進(jìn)而有效提升了WHC、OHC、WSC數(shù)值[10]。

表7 不同SDF的WHC、OHC、WSC分析

2.4 體外降血糖作用研究

為了明確高溫蒸煮復(fù)合纖維素酶和木聚糖酶處理前后的膳食纖維體外降血糖效果，從抑制葡萄糖吸收(葡萄糖擴(kuò)散抑制能力、葡萄糖吸附力)和抑制某些水解酶(α-淀粉酶)的活性這3方面探討綠豆皮SDF樣品(LSDF)、高溫蒸煮SDF(GSDF)、高溫蒸煮-復(fù)合酶SDF(MSDF)三者的體外降血糖性能。

2.4.1 葡萄糖擴(kuò)散抑制能力分析

小腸黏膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受阻是降低餐后血糖升高的主要原因之一，葡萄糖透析延遲指數(shù)是一個(gè)有效反映葡萄糖在胃腸道被延遲吸收的體外指標(biāo)。由圖3可知，20～200 min內(nèi)，3種SDF均呈現(xiàn)出延遲指數(shù)先增加后趨于平衡的情況，且于60 min左右達(dá)到峰值。GSDF和MSDF的最大值相比于LSDF，分別提升了43.63%以及68.92%?？赡苁翘幚砗蟮腉SDF和MSDF，其有效增加了介質(zhì)的黏度，延緩了葡萄糖的擴(kuò)散[23]。

圖3 不同SDF葡萄糖透析延遲指數(shù)圖

2.4.2 葡萄糖吸附力分析

在體外實(shí)驗(yàn)中，DF對(duì)葡萄糖的吸附能力的大小可以用來(lái)衡量其在人體腸道內(nèi)對(duì)葡萄糖的抑制和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。圖4可見(jiàn)，3種SDF都具有葡萄糖吸收能力，且吸收能力與濃度(50～250 mmol/L)呈正相關(guān)，具有濃度依賴(lài)性(如50 mmol/L：LSDF1.0%>LSDF0.5%)。GSDF和MSDF相比LSDF，葡萄糖吸附(1.0%)提升了34.96%、75.20%，葡萄糖吸附(0.5%)提升了89.55%、112.68%。可能是高溫蒸煮-復(fù)合酶處理后，比表面積更大，結(jié)構(gòu)更疏松，方便更多葡萄糖分子嵌入多孔纖維網(wǎng)絡(luò)中[24]。

圖4 不同SDF葡萄糖吸附力的測(cè)定

2.4.3 α-淀粉酶抑制率分析

抑制淀粉消化過(guò)程中的α-淀粉酶可以延長(zhǎng)消化時(shí)間，降低小腸葡萄糖生成率，從而有效控制高血糖和糖尿病。由圖5知，在0.5%～2.5%范圍內(nèi)，3種SDF與阿卡波糖均有α-淀粉酶抑制作用，GSDF和MSDF最大抑制率數(shù)值分別為52.7%、63.6%,相比于LSDF，提升了27.94%、54.41%?？赡苁歉邷卣糁?復(fù)合酶處理后的SDF，其黏度更大，使凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)捕捉到更多的α-淀粉酶和淀粉，使其無(wú)法接觸，抑制作用更強(qiáng)[25]。

圖5 不同SDF和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

2.4.4 抑制類(lèi)型分析

為了確定淀粉水解中α-淀粉酶的SDF抑制模式，以1/V和1/[S]為橫、縱坐標(biāo)作圖，得到α-淀粉酶的米氏方程曲線(xiàn)，直線(xiàn)的橫縱截距分別表示1/Km的絕對(duì)值和1/Vmax。由圖6知，LSDF在質(zhì)量濃度0.2、1.0、2.0 mg/mL的Km值分別為3.42、3.52、3.60 mg/mL，Vmax分別為0.30、0.15、0.12 mmol/min，表明對(duì)LSDF來(lái)說(shuō)，Vmax值與LSDF濃度呈負(fù)相關(guān)性。不同濃度的線(xiàn)條在x軸的負(fù)值處相交，這表明LSDF是非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制模式，即LSDF既可以與α-淀粉酶結(jié)合，也可以和底物、α-淀粉酶結(jié)合。GSDF與MSDF的米氏方程曲線(xiàn)與LSDF相似，表明三者均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型，說(shuō)明高溫蒸煮或高溫蒸煮-復(fù)合酶處理并沒(méi)有使其抑制類(lèi)型改變。

圖6 不同SDF對(duì)α-淀粉酶的雙倒數(shù)曲線(xiàn)

3 結(jié)論

高溫蒸煮最佳條件為料液比1∶30 g/mL、蒸煮溫度120 ℃、蒸煮45 min，SDF得率為10.29%；結(jié)合復(fù)合酶最佳條件為木聚糖酶0.75%、纖維素酶1.5%，酶解120 min，溫度50 ℃，SDF得率為20.12%。高溫蒸煮或高溫蒸煮-復(fù)合酶處理后，其持水力、持油力、膨脹力等理化性能數(shù)值提高，葡萄糖吸附能力、葡萄糖擴(kuò)散抑制能力和α-淀粉酶抑制活性等體外降血糖能力提升，且高溫蒸煮-復(fù)合酶混合處理效果優(yōu)于高溫蒸煮單獨(dú)處理；動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，高溫蒸煮或高溫蒸煮-復(fù)合酶處理前后對(duì)α-淀粉酶的抑制均為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制。高溫蒸煮-復(fù)合酶法處理后的綠豆皮膳食纖維體外降血糖等理化特性明顯改善，具有開(kāi)發(fā)綠豆皮高附加值產(chǎn)品的潛能。