中國(guó)南方稻谷主產(chǎn)區(qū)黑曲霉菌群的流行特征及產(chǎn)毒能力研究

張 婷, 徐圓程, 王光宇, 汪海峰, 印曉玉, 邱偉芬

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023)

稻谷是我國(guó)重要的糧食作物之一，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有極其重要的地位[1]。隨著我國(guó)將糧食安全戰(zhàn)略納入“十四五”規(guī)劃，糧食產(chǎn)后的收儲(chǔ)保質(zhì)減損重要性日益凸顯。黑曲霉群(A.nigeraggregate)是儲(chǔ)藏稻谷中的優(yōu)勢(shì)菌群，不僅會(huì)導(dǎo)致糧食霉變?cè)斐山?jīng)濟(jì)損失，部分菌株還能產(chǎn)生赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)危害人類健康[2]。因此，有必要對(duì)我國(guó)稻谷主產(chǎn)區(qū)儲(chǔ)存糧堆中黑曲霉群的流行特征進(jìn)行調(diào)查并分析它們的產(chǎn)毒能力，為我國(guó)稻谷的安全儲(chǔ)藏和霉菌針對(duì)性防控提供數(shù)據(jù)參考。

黑曲霉群主要的形態(tài)特征是產(chǎn)生黑色的分生孢子頭，通常能形成典型的黑色或深棕色菌落。食品中常見的黑色曲霉主要包括黑曲霉(A.niger)、塔賓曲霉(A.tubingensis)和巴西曲霉(A.brasiliensis)等10種。這類形態(tài)種之間具有高度的生物多樣性但種間差異非常微小[3]。此外，菌落的顏色還受到培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、產(chǎn)孢量和菌核等因素影響。因此，僅依靠表型特征無法區(qū)分黑曲霉群中的物種。針對(duì)黑曲霉群的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)的研究表明，要準(zhǔn)確鑒定黑色曲霉除了需要對(duì)分離株的微觀形態(tài)進(jìn)行表征外，還需要對(duì)ITS和一些蛋白基因(如BenA和CaM)進(jìn)行測(cè)序[4,5]。Susca等[6]通過形態(tài)學(xué)結(jié)合BenA和CaM基因?qū)γ绹?guó)和意大利兩國(guó)玉米中黑曲霉群進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)黑曲霉、塔賓曲霉和百歲蘭曲霉是兩國(guó)玉米中最常見的黑色曲霉，但組成比例上有差異。而Noonim等[7]發(fā)現(xiàn)泰國(guó)兩個(gè)不同地區(qū)的咖啡豆中的黑曲霉群為A.aculeatinus、炭黑曲霉(A.carbonarius)、黑曲霉、塔賓曲霉和A.sclerotiicarbonarius共5種。由此可知，黑曲霉群的分布特征與地理環(huán)境、氣候差異等因素相關(guān)。傳統(tǒng)上認(rèn)為，谷物中的OTA通常由赭曲霉(A.ochraceus)和純綠青霉(Penicilliumverrucosum)產(chǎn)生[8]，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉群也可以在谷物及其副產(chǎn)物中生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生OTA[9]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)不同地理、氣候環(huán)境中存在的分離株，產(chǎn)OTA的能力也各不相同。OTA產(chǎn)毒基因簇由五個(gè)基因組成，分別是編碼鹵素酶(HAL)、bZIP轉(zhuǎn)錄因子(bZIP)、細(xì)胞色素單加氧酶P450、非核糖體肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)[10,11]。OTA的產(chǎn)生與否及產(chǎn)生能力的強(qiáng)弱除基因水平上的因素外[12]，還會(huì)受到溫度、水分等因素的影響[13]。因此，不同地理位置分布的黑曲霉群均可能導(dǎo)致OTA污染風(fēng)險(xiǎn)。到目前為止全球發(fā)現(xiàn)的黑色曲霉中炭黑曲霉[14]、A.lacticoffeatu[15]、黑曲霉[16]和百歲蘭曲霉[17]均有過產(chǎn)生OTA的報(bào)道。地理位置及氣候環(huán)境會(huì)影響黑曲霉群的分布，但這些黑色曲霉僅依靠外觀特征和ITS測(cè)序難以準(zhǔn)確鑒定到種。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于稻谷等儲(chǔ)藏糧堆的樣品采集范圍較小，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種的分類鑒定多數(shù)依靠外觀及ITS測(cè)序，導(dǎo)致我們對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)稻谷中黑曲霉群的分布信息并不明確，且它們的分布規(guī)律和產(chǎn)OTA能力鮮有系統(tǒng)研究。

本研究采集我國(guó)南方十省的倉(cāng)儲(chǔ)稻谷樣品，通過形態(tài)特征篩選出黑曲霉群菌株，進(jìn)一步依據(jù)ITS及CaM序列特征對(duì)其進(jìn)行鑒定，明確其進(jìn)化關(guān)系及分布規(guī)律；采用ELISA、HPLC-FLD方法并結(jié)合OTA生物合成基因鑒定方法確證黑曲霉群分離株的產(chǎn)OTA能力，該研究結(jié)果為我國(guó)稻谷的安全儲(chǔ)藏及霉菌針對(duì)性防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷樣品采集自我國(guó)南方稻谷主產(chǎn)區(qū)10個(gè)省的代表性糧庫(kù)。

高鹽察氏培養(yǎng)基(HCA)、察氏培養(yǎng)基(CA)；基因組DNA提取試劑盒；2×Rapid Taq Master Mix；TAE緩沖液；氯化鈉、氯化鉀、七水合硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、無水乙醇、三水合磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、蔗糖(分析純)；酵母提取物；甲醇(色譜純)；OTA標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-150F-I霉菌培養(yǎng)箱，VOSHIN-600R無菌均質(zhì)機(jī)，SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，VeritiPro梯度PCR儀，BIO-RAD Mini-sub Cell電泳槽，BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像儀，ELX800酶標(biāo)儀，1260高效液相色譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

于2017年3月—2019年11月在我國(guó)南方10個(gè)省江蘇、浙江、福建、四川、安徽、湖南、湖北、江西、廣東和廣西的14個(gè)代表性糧庫(kù)，采集樣品共計(jì)525份。糧庫(kù)為高大平房倉(cāng)。采用三層五點(diǎn)法分層分點(diǎn)進(jìn)行扦樣，每份樣品300 g。三層為距糧堆地面0.5 m的下層，距糧堆表面2.5 m的中層，距糧堆表面0.5 m的上層。五點(diǎn)為每個(gè)糧層距離兩邊墻壁均為1 m的4個(gè)角落和中心點(diǎn)，共5個(gè)采樣點(diǎn)。取得的樣品用無菌采樣袋封裝后于4 ℃保藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 霉菌的分離與純化

在無菌環(huán)境中稱取25 g稻谷樣品裝于無菌均質(zhì)袋中，用225 mL無菌水?dāng)噭蜃鳛樵?，稀釋度?0-1。然后吸取1 mL至9 mL無菌水中制成10-2的稀釋液，連續(xù)梯度稀釋3次后得到濃度為10-5的樣品稀釋液。取此稀釋度菌液稀釋液制成平板，于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d。根據(jù)霉菌菌落的形態(tài)學(xué)特征，選取培養(yǎng)皿上的黑色或深棕色菌落，將其劃線分離純化培養(yǎng)，最終純化得到單一的黑曲霉群菌株。一部分用于1.3.3中的菌株鑒定實(shí)驗(yàn)，另一部分以孢子懸浮液的形式儲(chǔ)存，于2 mL凍存管中加入40%滅菌的甘油，比例為1∶1，混合均勻后保藏于-80 ℃超低溫冰箱中，供1.3.5的產(chǎn)毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 菌株鑒定

將20 mg菌絲體從培養(yǎng)皿中取出，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照說明書使用試劑盒提取黑曲霉菌株基因組DNA，在超凈臺(tái)進(jìn)行操作，收集至離心管中。對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為ITS1/ITS4和cmd5/cmd6(表1)。PCR反應(yīng)體系及程序參照文獻(xiàn)[18]。對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析并在化學(xué)發(fā)光成像儀上觀察結(jié)果，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。所有擴(kuò)增產(chǎn)物均由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

表1 擴(kuò)增引物序列表

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA 11軟件對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。首先通過Clustal W程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后選擇最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Tamura-Nei模型經(jīng)過1 000次bootstrap評(píng)估其穩(wěn)定性后獲得系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 霉菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)

取出預(yù)先制備好的黑曲霉群菌株孢子懸浮液，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩YA產(chǎn)毒培養(yǎng)基參照Hübsch[21]的方法進(jìn)行配置，用無菌生理鹽水將黑曲霉群菌株孢子懸浮液濃度調(diào)整至106CFU/mL。取5 μL懸浮液滴于平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，一式3份。

1.3.6 ELISA法測(cè)定OTA產(chǎn)生能力

使用ELISA試劑盒對(duì)107株黑曲霉菌株產(chǎn)OTA能力進(jìn)行定性檢測(cè)。從產(chǎn)毒培養(yǎng)基菌落的中心、中圈、外圈各取1塊帶菌瓊脂塊，將其置于2 mL離心管中，通過加入1 mL 60%甲醇提取OTA，每10 min震蕩一次直至提取完畢，提取時(shí)間為1 h，然后離心得上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)菌株產(chǎn)毒情況。按照ELISA試劑盒制造商給出的說明書進(jìn)行操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.7 HPLC-FLD法測(cè)定OTA產(chǎn)生能力

采用高效液相色譜法對(duì)107株菌株的OTA進(jìn)行定量分析。取樣方法同1.3.6，用1 mL甲醇提取。采用反相C18色譜柱(5 μm，250 mm，4.6 mm，柱溫45 ℃)、高效液相色譜(HPLC)、FLD熒光檢測(cè)器(激發(fā)波長(zhǎng)333 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm)測(cè)定提取物中OTA含量。流動(dòng)相為KH2PO4(4 mmol/L pH 2.5)和甲醇，比例為33∶67，流速為1 mL/min。通過與OTA標(biāo)準(zhǔn)品生成的校準(zhǔn)曲線比較，對(duì)OTA進(jìn)行洗脫和定量。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)通過將已知濃度的OTA加到底物中，并按照與樣品相同的程序提取毒素來進(jìn)行。

1.3.8 OTA生物合成關(guān)鍵基因的鑒定

參考Gil-Serna等[18]報(bào)道的鑒定方法，在所有分離株中檢測(cè)OTA合成關(guān)鍵基因的存在，步驟同1.3.3，通過引物擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶評(píng)估黑曲霉、塔賓曲霉、百歲蘭曲霉和新黑曲霉菌株OTA生物合成基因的缺失。兩組引物分別針對(duì)位于OTA生物合成基因簇兩側(cè)的異丙醇脫氫酶(IDH)和氧化氮合酶(ONS)編碼基因，其中引物ISODH-PKSTUBF/R對(duì)塔賓曲霉具有特異性，而ISODH-PKSF/R則對(duì)黑曲霉和百歲蘭曲霉具有特異性(表1)。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。采用SPSS 19.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉群菌株分布與流行特征

黑曲霉群疑似菌株提取基因組擴(kuò)增出的ITS序列和CaM序列呈現(xiàn)的條帶完整明亮，大小分別為600 bp左右和580 bp左右，符合測(cè)序要求。霉菌形態(tài)學(xué)對(duì)比和目標(biāo)基因測(cè)序結(jié)果表明，在我國(guó)南方稻谷主產(chǎn)區(qū)代表性糧庫(kù)中采集到的107株黑曲霉群分離株全部屬于曲霉屬。CaM測(cè)序分析結(jié)果將其分為4個(gè)種，分別為黑曲霉、塔賓曲霉、百歲蘭曲霉、新黑曲霉，其中黑曲霉有37株，塔賓曲霉有13株，百歲蘭曲霉有55株，新黑曲霉有2株。

注：a為新黑曲霉，b為黑曲霉，c為塔賓曲霉，d為百歲蘭曲霉。

我國(guó)稻谷主產(chǎn)區(qū)大部分分布在長(zhǎng)江以南、年平均氣溫較高的省份，豐富的降雨量使得這些地區(qū)氣候濕潤(rùn)，這樣的環(huán)境條件特別適宜霉菌的生長(zhǎng)繁殖[22]。而黑曲霉群的菌株尤其適應(yīng)在溫暖的氣候條件下生存，其黑色的孢子在陽(yáng)光和紫外線下能夠受到很好的保護(hù)，為它們?cè)跍嘏瘹夂驐l件下提供了競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[23, 24]。黑曲霉群菌株普遍存在于倉(cāng)儲(chǔ)糧堆當(dāng)中，這些黑色曲霉種的污染水平及分布特征通常會(huì)受到地理環(huán)境、氣候特征等因素影響。

在本研究中，結(jié)合各采樣地點(diǎn)地理環(huán)境信息分析可以發(fā)現(xiàn)，黑曲霉群分離株的分布呈現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異。從各地區(qū)黑曲霉群菌株的種類數(shù)量來看，有4個(gè)地區(qū)檢測(cè)出了3種黑色曲霉，有2個(gè)地區(qū)只檢測(cè)出了1種黑色曲霉。從地域分布來看，百歲蘭曲霉分布最廣，尤其在兩廣地區(qū)檢出最多。其次是黑曲霉，近半數(shù)分布在廣西南寧、廣東雷州這2個(gè)地區(qū)?？梢姾谇购桶贇q蘭曲霉在廣西和廣東地區(qū)流行率都比較高。這兩個(gè)省份屬于我國(guó)第七儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)高溫高濕儲(chǔ)糧區(qū)，一年當(dāng)中15 ℃以上的時(shí)間在289～352 d，是我國(guó)“濕熱”的地區(qū)。這說明黑曲霉群中的黑曲霉和百歲蘭曲霉2個(gè)物種尤其喜愛高溫高濕的環(huán)境，這種條件下的儲(chǔ)糧尤其需要防范這兩種霉菌。

從黑曲霉群菌株的檢出數(shù)量來看，百歲蘭曲霉最多，占51.40%，其次是黑曲霉和塔賓曲霉。相關(guān)研究證實(shí)，百歲蘭曲霉、黑曲霉和塔賓曲霉是谷物中分布最普遍的黑色曲霉種[18, 25]，這與本研究結(jié)果相似。除谷物以外，百歲蘭曲霉還是葡萄[26]、洋蔥[27]等其他農(nóng)產(chǎn)品中流行率最高的黑色曲霉。值得注意的是，百歲蘭曲霉在2011年才從黑曲霉中劃分出來[28]，最近幾年才在全球范圍內(nèi)大量報(bào)道，主要原因可能是由于大多數(shù)研究在百歲蘭曲霉的分類信息出現(xiàn)或者受到關(guān)注之前就已經(jīng)發(fā)表。因此，目前仍然迫切需要對(duì)黑色曲霉的流行情況重新進(jìn)行評(píng)價(jià)[29]。Massi等[30]將之前研究中被鑒定為黑曲霉的175株分離株，利用CaM測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行重新鑒定后，發(fā)現(xiàn)其中有一半實(shí)際上是百歲蘭曲霉。

本研究所分離到的塔賓曲霉也是稻谷中的主要黑色曲霉。Amani Lahouar等[31]研究表明，塔賓曲霉在谷物中普遍存在且檢測(cè)頻率較高，這與意大利[32]等國(guó)家的研究結(jié)果一致，在這些國(guó)家儲(chǔ)糧樣品中分離到的黑色曲霉中數(shù)量最多的是塔賓曲霉。結(jié)合地理特征分析后發(fā)現(xiàn)鑒定到的塔賓曲霉大多分布在高緯度的地區(qū)，且緯度越高塔賓曲霉的流行率越高，表明黑曲霉群種類的分布確實(shí)與地理位置、氣候條件等因素相關(guān)。除近期被廣泛報(bào)道的黑曲霉群種類外，本研究中還分離到了兩株新黑曲霉，分布在湖南長(zhǎng)沙和廣東雷州2地。新黑曲霉在形態(tài)上與黑曲霉和塔賓曲霉相似[33]，但能夠形成白色菌核，在工業(yè)中常用它來發(fā)酵普洱茶。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將所有序列在NCBI中比對(duì)后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果大致將所分離到的黑曲霉群分為兩大類，塔賓曲霉和新黑曲霉屬于一個(gè)分支，而黑曲霉和百歲蘭曲霉屬于另一個(gè)分支，表明它們兩兩之間的親緣關(guān)系接近。值得注意的是，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，各分離自江西贛州的黑曲霉(37)JXGZ18 3和廣東雷州的黑曲霉(87)GDLZ17 8分離株親緣關(guān)系與其他黑曲霉菌株較遠(yuǎn)。除此之外，其他分離自不同地區(qū)的黑色曲霉分離株均按種聚類到一起。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明黑曲霉和百歲蘭曲霉屬于一大分支，且它們的種內(nèi)變異性明顯低于塔賓曲霉。這與以往報(bào)道的遺傳關(guān)系一致[34]，表明它們之間的親緣關(guān)系更加接近。結(jié)合樣品采集信息，黑曲霉和百歲蘭曲霉的分布規(guī)律也是同步的，這可能由于2種黑色曲霉基因組成接近，有關(guān)基因功能均能夠讓它們適合在高溫高濕環(huán)境中生長(zhǎng)。綜合來看，溫濕度對(duì)我國(guó)南方地區(qū)倉(cāng)儲(chǔ)稻谷中黑曲霉群流行特征的影響較大。Battilani[35]和Chiotta[36]分別研究了歐洲和阿根廷不同地理區(qū)域?qū)谇谷毫餍星闆r的影響，發(fā)現(xiàn)各地溫度和濕度的差異是引起這種地域性差異的主要原因。我國(guó)南方十省稻谷主產(chǎn)區(qū)由北向南所涉區(qū)域從溫帶地區(qū)跨到了熱帶地區(qū)的兩廣，緯度變化形成了較大溫度差異，也就造成了各地糧庫(kù)中黑曲霉群分布情況的不同。

2.3 黑曲霉群分離株產(chǎn)OTA能力評(píng)估

對(duì)107株黑曲霉群分離株進(jìn)行ELISA法測(cè)定，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。線性方程為y=-44.433x+35.591，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1，說明可用于定量檢測(cè)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)得回收率為88.67%～98.78%，RSD為2.16%～4.83%。ELISA測(cè)定產(chǎn)OTA能力結(jié)果如表3所示，來自5個(gè)不同地區(qū)的7株菌顯示陽(yáng)性，它們的產(chǎn)毒量在1.33 μg/kg到5.05 μg/kg之間。

表3 全部菌株產(chǎn)毒情況

ELISA是食品中OTA檢測(cè)的常用方法，其原理是基于抗原抗體特異性反應(yīng)以及酶的催化作用[37]。該法具有檢測(cè)速度快、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但在進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，且重復(fù)性差。原因涉及多方面因素，如與樣品結(jié)構(gòu)類似的化合物間的交叉反應(yīng)會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[38]，酶不穩(wěn)定且易失活等。因此仍需采用其他方法進(jìn)行確證。液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)作為真菌毒素分析的金標(biāo)準(zhǔn)方法[39]，靈敏度和準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，自動(dòng)化程度高，是許多實(shí)驗(yàn)室OTA檢測(cè)的首選方法[40]。

使用HPLC-FLD對(duì)107株菌株的OTA提取液進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.126 4x+0.000 1，R2= 0.999 8，在0～100 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加標(biāo)回收率為89.54%～98.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為3.56%～5.62%，說明本法滿足實(shí)驗(yàn)測(cè)定。HPLC-FLD結(jié)果如表2所示，107株菌株均未檢測(cè)到OTA，針對(duì)此結(jié)果，繼續(xù)通過提取這些菌株基因組DNA進(jìn)行OTA生物合成基因鑒定來驗(yàn)證。

表2 黑曲霉群分離株分布特征

OTA生物合成基因主要由編碼鹵素酶(HAL)、bZIP轉(zhuǎn)錄因子(bZIP)、細(xì)胞色素單加氧酶P450、非核糖體肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)這5個(gè)基因組成，所用引物擴(kuò)增的是OTA生物合成基因和其上下游片段。當(dāng)OTA生物合成基因缺失時(shí)，PCR引物擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生1 000 bp左右長(zhǎng)的條帶，說明所測(cè)菌株無法合成OTA。OTA生物合成關(guān)鍵基因鑒定結(jié)果表明，所有菌株P(guān)CR擴(kuò)增后在1 000 bp左右均有明亮條帶產(chǎn)生，表明所有菌株均缺失OTA生物合成關(guān)鍵基因，不能產(chǎn)生OTA，與HPLC-FLD結(jié)果一致。

圖2 OTA生物合成基因鑒定圖

OTA是一種具有腎毒性和潛在致癌性的真菌毒素，多存在于谷物、咖啡豆、可可豆、葡萄、干果和香料等多種食品中[41]，不同地理位置分布的黑曲霉群菌株均可能導(dǎo)致OTA污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究中HPLC-FLD和OTA合成基因鑒定結(jié)果都表明所有菌株均不產(chǎn)生OTA，說明ELISA檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性。因此，我國(guó)南方區(qū)域黑曲霉群造成的OTA污染風(fēng)險(xiǎn)較低，且宿主來源與產(chǎn)生OTA的能力也無明顯關(guān)系。此外，這一結(jié)果還證實(shí)了基于PCR的分析有助于更簡(jiǎn)易方便地預(yù)測(cè)黑曲霉群OTA的產(chǎn)生能力。

雖然越來越多的研究發(fā)現(xiàn)黑色曲霉有產(chǎn)生OTA的能力，但綜合現(xiàn)有的研究，這些產(chǎn)毒菌株只占了分離到黑色曲霉中的一小部分。許多黑曲霉群分離株缺少OTA生物合成基因，基因組中只保留了編碼PKS中很小一部分無有效功能的序列，而黑曲霉群菌株不能產(chǎn)生OTA正是與其基因組中功能基因的缺失相關(guān)[42]。根據(jù)本研究中系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也可以做出一些推測(cè)，這些不產(chǎn)OTA的黑色曲霉的祖先出現(xiàn)了OTA合成基因簇缺失的情況，在進(jìn)化過程中使得這些物種的毒素合成能力以不同程度或速率喪失。因此導(dǎo)致黑色曲霉中產(chǎn)OTA菌株可能并不普遍，只有百歲蘭曲霉和黑曲霉等少數(shù)菌株被報(bào)道擁有完整的OTA合成基因簇[43, 44]。而塔賓曲霉產(chǎn)OTA的能力也一直備受爭(zhēng)議，雖然有其產(chǎn)OTA的文獻(xiàn)報(bào)告[45]，但也有學(xué)者一直在討論它能否真正的產(chǎn)OTA[46]。在Qi等[47]的研究中，所分離的塔賓曲霉均不產(chǎn)OTA。Nielsen等[48]的研究報(bào)告中也提到塔賓曲霉不能產(chǎn)生OTA。

雖然本研究中分離到的所有黑色曲霉均不能產(chǎn)生OTA，但需要注意的是，黑曲霉是工業(yè)發(fā)酵中最重要的微生物之一[49]。傳統(tǒng)上認(rèn)為它在工業(yè)條件下是無毒安全的，目前已經(jīng)有相當(dāng)多的黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)品被美國(guó)食品和藥品管理局授予了一般認(rèn)為是安全的(generally regarded as safe, GRAS)證明。然而，在黑色曲霉中存在的產(chǎn)OTA和伏馬菌素[50]的潛力，需要調(diào)整和加強(qiáng)工業(yè)發(fā)酵菌種的多種真菌毒素的篩選程序。

3 結(jié)論

糧食安全是全球普遍關(guān)注的研究課題。稻谷是我國(guó)重要的儲(chǔ)備糧食作物，預(yù)防儲(chǔ)糧霉變和防范真菌毒素污染對(duì)于我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民健康具有重要意義。雖然農(nóng)業(yè)收獲技術(shù)的改進(jìn)以及儲(chǔ)糧霉變實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)的應(yīng)用大大降低了糧食霉變的幾率，但霉變?cè)斐傻膬?chǔ)糧品質(zhì)下降和經(jīng)濟(jì)損失仍不容忽視。本研究對(duì)中國(guó)南方稻谷主產(chǎn)區(qū)倉(cāng)儲(chǔ)稻谷中的黑曲霉群進(jìn)行分離鑒定，分析其分布規(guī)律及流行特征，并評(píng)估其產(chǎn)OTA毒素的能力。綜合結(jié)果來看，雖然未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)OTA的黑色曲霉，但霉變帶來的儲(chǔ)糧數(shù)量損失和質(zhì)量下降仍不容忽視，我們應(yīng)對(duì)黑曲霉群繼續(xù)保持監(jiān)測(cè)和科學(xué)評(píng)估，才能有效防范OTA等真菌毒素污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。