椰毒假單胞菌酵米面亞種及其毒素的最新研究進展

郭穎希， 梅燦輝， 阮 征， 李汴生

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，廣州 510640) (珠海市食品藥品(醫(yī)療器械)審評認證中心2，珠海 519000)

近年來由椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)生米酵菌酸毒素引起的濕粉類食品中毒事件在南方地區(qū)時有發(fā)生，說明該類食品具有較大被污染的風(fēng)險。據(jù)不完全報道，我國16個省都曾出現(xiàn)該菌引起的食物中毒案例，谷類制品(發(fā)酵玉米面、糯玉米湯圓、玉米淀粉等)、變質(zhì)銀耳和薯類制品(馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等)為主要受污染食品[1]。米酵菌酸(Bongkrekic Acid, 簡稱BA)是一種線粒體ANT毒素，多存在于椰子、玉米中，無臭無味，被污染的食物沒有明顯變化[2]，對人、動物、多種真菌有毒，由于對熱穩(wěn)定，普通的烹飪方式不能將其去除，酸、氧化劑和日光的去除效果較好[3]，具有不易察覺、毒性強、病死率高等特點。關(guān)于椰毒假單胞菌酵米面亞種及米酵菌酸的研究報道時有更新，本綜述將對其進行總結(jié)和思考，以尋找進一步研究的準確方向和構(gòu)思可行方案。

1 椰毒假單胞菌酵米面亞種研究進展概述

椰毒假單胞菌酵米面亞種(Pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans)是一種高致死性食源性致病菌。任中善等調(diào)查發(fā)現(xiàn)該菌可以在玉米、小米、糯米、高梁、銀耳等多種食物上生長繁殖并產(chǎn)生毒素，廣泛存在于自然界中[4]。孟昭赫等[5]通過培養(yǎng)特征、形態(tài)、生理生化、血清學(xué)及產(chǎn)毒實驗的對比分析將其命名為椰毒假單胞菌酵米面亞種，并對其鑒定、檢驗及去毒方法作出研究報道，制定了3項國家食品衛(wèi)生標準，如今均已廢止。2003年修訂并實施了GB/T 4789.29—2003[6]；隨著國內(nèi)外學(xué)者對該菌的進一步認識，2020年9月我國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了GB/T 4789.29—2020[7]，為相關(guān)檢測工作制定了更為準確、高效、規(guī)范的操作流程及結(jié)果報告格式。

1.1 椰毒假單胞菌酵米面亞種的理化性質(zhì)、生化特性及檢測方法

在GB/T 4789.29—2020中，樣品經(jīng)前處理、增菌、接種于不同分離平板上的理化性質(zhì)如表1所示，初篩試驗后進行生化鑒定，其生化特征可參照標準，本文不加贅述。焦振泉等[8,9]利用微孔板雜交法判定椰毒酵米面亞種與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌DNA-DNA同源性大于75%，隨后對椰酵假單胞菌分離株16S～23S rRNA基因間區(qū)的DNA序列進行比較分析，建議將椰酵假單胞菌產(chǎn)毒株及不產(chǎn)毒株均劃分為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)的生物型，并首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒菌株存在特異性插入的DNA序列；王崗[10]提出椰毒假單胞菌酵米面亞種在SS培養(yǎng)基中特征不統(tǒng)一且產(chǎn)毒能力不穩(wěn)定，認為該菌應(yīng)屬于B.gladioli的一個變種。李曉琍等[11]發(fā)現(xiàn)同時開展增菌和不增菌培養(yǎng)能節(jié)省時間、成本，提高檢出率，并提出添加2種抗生素的改良型馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板(mPDA)可提高選擇性和使菌落特征更顯著，黃偉峰等[12]得到同樣的結(jié)論并證明椰毒假單胞菌酵米面亞種分離瓊脂(PCFA)分離效果更好。

基于大量理論與實踐依據(jù)，國家標準的檢驗方法已較為成熟，但檢驗周期仍較長。有報道指出，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)作為一種新型核酸擴增方法，具有較高的特異性和敏感性，其檢測靈敏度是傳統(tǒng)PCR方法的1 000倍[13]，林捷等[14]建立了實時熒光PCR檢測方法，具有較強特異性、抗干擾性及更高的靈敏度，趙夢馨等[15]將傳統(tǒng)生理生化檢測法與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法和 rec A序列分析法進行比較，發(fā)現(xiàn)新型方法更快速、準確，范璐等[16]也得到類似的結(jié)果，并且指出聯(lián)用 VITEK 2COMPACT 全自動微生物生化鑒定儀可進一步提高準確率，但有國外學(xué)者[17]指出目前可用的MALDI-TOF系統(tǒng)還不能準確識別椰毒假單胞菌，且分子檢測方法無法確定菌株是否產(chǎn)毒，仍需要配合產(chǎn)毒實驗，因此更高效的檢驗方法有待進一步的對比研究。

表1 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)在不同分離平板上的菌落特征[7]

1.2 椰毒假單胞菌酵米面亞種污染途徑及影響其產(chǎn)毒的因素

椰毒假單胞菌酵米面亞種主要在我國東北地區(qū)引起發(fā)酵食物中毒，近年來南方地區(qū)卻頻頻出現(xiàn)非發(fā)酵食物導(dǎo)致中毒致死事件[18]，有報道稱鮮濕粉類制品存在被該菌污染的重大風(fēng)險[19]。原料、生產(chǎn)、運輸和儲藏控制不當都可能導(dǎo)致米粉食品被污染，研究表明唐菖蒲伯克霍爾德氏菌可能是玉米、甘薯的伴生細菌[20]，進口碎米也有被污染的風(fēng)險[21]。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)椰毒假單胞菌可以參與米表面的菌膜生成，靜態(tài)浸洗和緩慢攪拌浸洗方式都無法徹底防止受污米的污染傳遞[22]，而熟化是殺菌步驟，因此成品的污染緣由尚不明確，有可能是原料、環(huán)境、人員、成品之間的交叉污染。濕粉類食品相關(guān)標準中并未提及椰毒菌，消費者和經(jīng)營者對其保存、食用方式也缺乏正確的認識。綜上所述，原料、工藝、環(huán)境、儲運等方面都存在污染風(fēng)險。

椰毒假單胞菌常于溫度、濕度適宜生長的夏季和秋季引起食物中毒，不同實驗室條件對椰毒假單胞菌的影響力依次為：菌體>培養(yǎng)基>溫度>pH值>時間，而在相同培養(yǎng)條件下不同基質(zhì)中的產(chǎn)毒量有所差異：銀耳粉>土豆粉>玉米粉>小米、高糧米和大米[23]，葡萄糖和甘油的存在會使其產(chǎn)毒能力大幅提高[24],而飽和脂肪酸月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸能促進米酵菌酸合成，不飽和脂肪酸油酸效果最為明顯，且隨濃度遞增[25]。該致病菌會與玉米粉中的米根霉真菌協(xié)同生長并產(chǎn)生毒素[26]，也可能被酵母菌的大量繁殖所掩蓋和抑制[27]，有學(xué)者指出添加到濕米粉制品中的防腐劑DHA-S可能通過其對霉菌的作用阻礙或促進BA的合成[28]，因此被該菌污染并含有毒素的食品有可能因為加入了對其不具有抑制作用的防腐劑抑制了霉菌等腐敗菌而表現(xiàn)出良好的感官性狀。 彭子欣等[29]通過對該菌的致病型菌株Co14進行全基因測序，在染色體1上發(fā)現(xiàn)了BA的生物合成相關(guān)基因簇bonR1R2LJKFGABDEHIM，提供了其毒力因子產(chǎn)生機制的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，但截至今日，關(guān)于環(huán)境對椰毒假單胞菌酵米面亞種進行米酵菌酸生物合成的影響機制在遺傳和分化上尚不清楚[30]。

2 米酵菌酸的研究進展

2.1 米酵菌酸的理化性質(zhì)、生物活性及檢測方法

米酵菌酸(BA，C28H38O7)是分子量為486 ku的白色晶體，易溶于各種有機溶劑且難溶于水，對熱穩(wěn)定，可在適宜環(huán)境條件(22～30 ℃，pH≈7)下由椰毒假單胞菌酵米面亞種利用脂肪酸合成[31]，其人體中毒量與致死量(以含水量為 15%～20% 的酵米面推算)分別為0.1～0.5 g/kg和1～2 g/kg[32]，是引起相關(guān)食物中毒事件的主要毒性成分。除了毒力作用外，BA還具有各種生物活性，據(jù)報道，米酵菌酸能抑制黃曲霉的生長[33]和人987肝癌細胞HepG2的衰老凋亡[34]，可作為研究霉菌、癌細胞的工具；與抑制蛋白質(zhì)合成的環(huán)己酰胺(CHX)聯(lián)用能抑制誘導(dǎo)魚細胞死亡的巨型海鱸虹膜病毒(GSIV)[35]。Okazaki等[36]發(fā)現(xiàn)米酵菌酸可作為長期缺乏雌二醇的MCF-7乳腺癌細胞中的瓦爾堡效應(yīng)(Warburg)調(diào)節(jié)劑，可促進線粒體積極利用葡萄糖并誘導(dǎo)細胞死亡，但在其他乳腺癌細胞中未觀察到這些作用；Kano等[37]報道米酵菌酸以劑量依賴的方式降低腫瘤細胞AT1中的ATP，在低葡萄糖條件下可促進細胞糖酵解并誘導(dǎo)腫瘤細胞AT1死亡，但對另一種癌細胞NIH3T3沒有類似現(xiàn)象。此外，米酵菌酸被鑒定為可用于治療糖尿病的過氧化物酶體增殖物激活受體γ激活劑(PPARγ)，其類似物能使成熟脂肪細胞中脂質(zhì)滴縮小[38]。綜上所述，BA在調(diào)節(jié)細胞活性方面功能多樣，但具有較高特異性，有待進一步研究。米酵菌酸的檢測方法在近年來發(fā)展迅猛，各界學(xué)者進一步發(fā)展了GB/T 5009.189—2016中使用的高效液相色譜法，建立了液質(zhì)聯(lián)用和熒光層析等更快速、準確的檢測方法，如表2所示。

表2 米酵菌酸在食品中的檢測方法

2.2 米酵菌酸的毒性機理及去毒方法

米酵菌酸對人、動物、多種真菌有毒害作用，是線粒體AAC的特異性脂肪酸類非競爭抑制劑，具有三個陰電位，通過固定移位體來破壞其功能從而影響細胞內(nèi)的氧化磷酸化反應(yīng)，BA還可以使部分-SH酶失活，影響蛋白質(zhì)代謝和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，同時影響線粒體跨膜電位，形成細胞毒性，毒素濃度越高毒力作用越強[44]，宋興田等[45]通過觀察小鼠肝和腦神經(jīng)細胞的超微結(jié)構(gòu)也得到相似結(jié)論，BA會對細胞形態(tài)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞。此外，Simona等[46]報道米酵菌酸是功能強大而高度選擇的線粒體ADP/ATP載體(AAC)抑制劑，抑制常數(shù)為2.0 μmol/L，BA可通過抑制參與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)形成的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)座酶(ANT)來干擾ADP的轉(zhuǎn)運過程，阻礙ADP和ATP在線粒體內(nèi)膜之間的交換從而產(chǎn)生毒性作用[47]，還可以抑制ATP依賴的鉀通道開放，誘導(dǎo)線粒體解耦以干擾ATP的產(chǎn)生，直接影響生物細胞的能量供應(yīng)[48]。BA在人體內(nèi)的致死劑量研究不多，口服BA的半數(shù)致死劑量(LD50)為3.16mg/kg[49]，該數(shù)據(jù)已許久未更新。

米酵菌酸無臭無味，食品在被污染后沒有明顯變化，普通的家庭烹飪條件無法將其除去，完全去除BA的方法未有研究報道，毒代動力學(xué)和降解途徑仍不明確。一旦攝入毒素，可先用20～50 mL不等的10%活性炭來吸附和用堿性溶液清洗腸胃以增加分離度，減少腸道吸收，微囊活性炭血液灌流也具有吸附作用，一些抗氧化性藥物如還原型谷胱甘肽、維生素 E、巰基乙醇和觸酶等都具有抗毒作用[32]。

3 總結(jié)

近20年來國內(nèi)外學(xué)者對椰毒假單胞菌酵米面亞種及米酵菌酸都有了新的認識，我國食品國家標準的修訂與時俱進，相關(guān)法律法規(guī)也在逐步建立、完善，然而該菌在自然界中分布廣泛，且環(huán)境變化不定，事實證明從消費者途徑進行事后鑒定、排查不是最優(yōu)選擇，不符合公共衛(wèi)生需求。因此，進一步的研究需從源頭出發(fā)，如研究椰毒假單胞菌對不同食品的污染規(guī)律，對癥下藥；可通過微觀視角深入探究該菌的毒力表達誘導(dǎo)因素，如進行全基因測序和誘變規(guī)律研究，或以宏觀的角度探尋食物在生產(chǎn)各個流程中被該菌污染的影響因素，如針對椰毒假單胞菌進行HACCP分析。此外，由于米酵菌酸毒性劇烈，要從其毒性機理入手，深入了解BA的生物合成和降解途徑，尋找將其徹底去除的方法。