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    液液萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠菌素

    2022-02-20 04:23:42王朝霞尹芳平胡宇格
    中國糧油學(xué)報(bào) 2022年1期
    關(guān)鍵詞:植物油菌素黃素

    王朝霞, 尹芳平, 汪 輝, 周 鵬, 鄧 楠, 曾 輝, 胡宇格

    (食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1, 長沙 410111) (長沙市食品藥品檢驗(yàn)所;國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心2,長沙 410000)

    細(xì)菌毒素是由細(xì)菌合成產(chǎn)生的,按其毒素的分子性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征可分為內(nèi)毒素和外毒素。研究表明內(nèi)毒素是在革蘭氏陰性菌死亡之后才會產(chǎn)生,且能夠在植物中產(chǎn)生具有毒害性的代謝產(chǎn)物,影響植物的正常生長從而降低植物如水稻這一類農(nóng)作物的產(chǎn)量[1-3]。由于革蘭氏陰性菌死亡之后產(chǎn)生的具有毒害性的代謝產(chǎn)物極易被人體吸收和利用,若人們攝取吸收富集這類物質(zhì)達(dá)到一定程度就會有不同程度的中毒跡象,輕者會出現(xiàn)嘔吐、全身無力、頭暈等現(xiàn)象;重者會出現(xiàn)內(nèi)臟腫大、休克等多種嚴(yán)重疾病[4-6]。吳小林等[7]研究了細(xì)菌毒素對癌癥的潛在作用,明確指出革蘭氏陰性菌具有致癌性。趙乃欣等[4]研究也表明,近年來中國不少地區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)由玉米粉、米粉等變質(zhì)產(chǎn)生革蘭氏陰性菌死亡后產(chǎn)生內(nèi)毒素進(jìn)而引起的食物中毒事件,其中報(bào)道較多的是由革蘭氏陰性菌死亡產(chǎn)生的毒黃素。毒黃素溶于水,同時(shí)也溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,靜脈注射毒黃素的LD50為1.7 mg/kg,口服的為8.39 mg/kg[8]。龍海等[9]研究發(fā)現(xiàn)水稻細(xì)菌性谷枯病病菌會產(chǎn)生3種毒素:毒黃素、熱誠菌素和路霉素,其中毒黃素對水稻有極大的毒害作用。熱誠菌素、路霉素與毒黃素分子結(jié)構(gòu)相似,可能存在與之相當(dāng)?shù)纳锘钚院投拘?。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的某些細(xì)菌物質(zhì)不僅會影響農(nóng)作物的產(chǎn)量,還對人類身體健康產(chǎn)生不同程度的危害。Zhu 等[10]報(bào)道在釀酒大曲中檢出的毒黃素含量高達(dá)8.33 mg/kg。因此,植物油相關(guān)的原材料如果受到細(xì)菌污染,可能會產(chǎn)生毒素,影響植物油的安全。目前,國內(nèi)外主要以植物油[11]為食用油,關(guān)于植物油中真菌毒素的測定報(bào)道較多[12,13],而食用植物油中細(xì)菌毒素的檢測方法研究卻是處于空白階段,消費(fèi)者在食用植物油環(huán)節(jié)存在一定的安全隱患,因此該項(xiàng)研究十分必要。我國食用植物油種類豐富、工藝復(fù)雜。常見的食用植物油[14]有菜籽油、玉米油、稻米油、花生油以及大豆油等。根據(jù)我國目前因細(xì)菌毒素中毒案例[5,6]來分析,本研究選擇了市面上主要流通的幾類食用植物油進(jìn)行分析檢測,因水稻中產(chǎn)生的細(xì)菌毒素誘發(fā)的疾病數(shù)量最多[15,16],著重以稻米油為研究對象進(jìn)行展開。

    有關(guān)毒黃素的分析方法有薄層色譜法[17-19]、高效液相色譜法[8, 10, 20]、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[21,22]、分光光度法[23,24]、生物傳感法[25],而對路霉素和熱誠菌素的分析方法報(bào)道較少,且鮮有關(guān)于植物油中毒黃素、熱誠菌素和路霉素的報(bào)道。本研究考察了5種不同前處理?xiàng)l件來提取凈化目標(biāo)物,采用甲醇液液萃取,高效液相色譜分析檢測,建立了一種快速測定食用植物油中毒黃素、路霉素和熱誠菌素的分析方法。以期填補(bǔ)食用植物油中毒黃素、路霉素和熱誠菌素檢測方法研究的空缺,為今后對細(xì)菌毒素的研究提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    毒黃素(Toxoflavin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%):CAS號:84-82-2;熱誠菌素(Fervenulin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.2%):CAS號:483-57-8;路霉素(reumycin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.9%),CAS號:5016-18-2;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷和甲酸均為色譜純;正己烷、三氧化二鋁和無水硫酸鈉為分析純;Al2O3固相萃取柱(22 g/60 mL);植物油均為市售樣品。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Agilent1260高效液相色譜儀,SK-I振蕩器;CT14D-高速離心機(jī),Visiprep-DL24固相萃取真空裝置,AS3120超聲波清洗器,超純水儀,N-EVAP116型氮吹儀-34位。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱:Ultimate AQ-C18色譜柱(4.6 mm×25 mm,5 μm);流動相:0.1%甲酸-甲醇(90∶10),等度洗脫;柱溫:35 ℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;檢測波長:240 nm。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    稱取適量的毒黃素、路霉素和熱誠菌素標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中,加入甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶,再用甲醇定容至刻度,配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-18 ℃避光保存,用流動相逐級稀釋,配制成0、4、8、10、20、40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液,供高效液相色譜儀分析測定。

    1.3.3 樣品處理1.3.3.1 液液萃取法1.3.3.1.1 液液萃取-乙腈飽和正己烷[26]

    稱取混勻的稻米油樣品0.8 g置于50 mL聚丙烯離心管中,加入0.2 mL由標(biāo)準(zhǔn)母液配制的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液,加入10 mL乙腈的飽和正己烷,混勻超聲15 min,取出下層溶液,加入5 mL乙腈飽和正己烷復(fù)提,合并提取液,混勻于45 ℃氮吹濃縮至近干,用流動相定容至2.0 mL,渦旋混勻,溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾,并做空白實(shí)驗(yàn),供液相色譜測定。

    1.3.3.1.2 液液萃取-甲醇[27]

    稱取混勻后的稻米油樣品4.0 g于50 mL聚丙烯離心管中,樣品加入0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)母液,加入10 mL甲醇,室溫振蕩提取15 min,于10 000r/min離心5 min,取出溶劑,再加入6 mL甲醇重復(fù)提取,合并提取液并定容至20 mL。準(zhǔn)確移取5.0 mL樣液于45 ℃氮吹濃縮至近干,流動相定容至1.0 mL,渦旋混勻,溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾,并做空白實(shí)驗(yàn),供液相色譜測定。

    1.3.3.2 固相萃取法

    1.3.3.2.1 Al2O3固相萃取柱(30 mL正己烷活化)[28]

    稱取混勻的稻米油樣品0.4 g置于50 mL聚丙烯離心管,加入0.1 mL由標(biāo)準(zhǔn)母液配制的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液,加入5 mL正己烷,渦旋混勻,待凈化。采用中性氧化鋁固相萃取柱,用30 mL正己烷活化柱子,將待凈化樣液全部加入固相柱,再加入50 mL正己烷進(jìn)行洗脫,收集洗脫液于45 ℃氮吹濃縮至近干,用流動相定容至1.0 mL,渦旋混勻,溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾,并做空白實(shí)驗(yàn),供液相色譜測定。

    1.3.3.2.2 自填中性氧化鋁固相萃取柱(30 mL石油醚活化)[29]

    三氧化二鋁的活化:稱取120 g三氧化二鋁置于坩堝并放入馬弗爐中,用450 ℃進(jìn)行灼燒,設(shè)置程序使其灼燒12 h,降至室溫后取出坩堝,將三氧化二鋁迅速轉(zhuǎn)入黑色的試劑瓶并加入10 mL水,劇烈振蕩15 min,將其避光靜置24 h。

    樣品的處理:稱取0.4 g稻米油樣品,加入0.1 mL由標(biāo)準(zhǔn)母液配制的質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液,加入2 mL石油醚,渦旋混勻,待凈化。

    三氧化二鋁的填柱:將玻璃層析柱用超純水洗滌3次后,再用無水乙醇洗滌3次,自然晾干。加入40 mL石油醚,打開活塞,放出石油醚至管身的1/2處,旋緊活塞,加入22 g活化的三氧化二鋁和2 g無水硫酸鈉,再次打開活塞,將石油醚放至無水硫酸鈉處旋緊活塞。上樣:將待凈化液全部轉(zhuǎn)入玻璃層析柱中,分離,純化。收集:加入80 mL石油醚進(jìn)行洗脫,棄去前20 mL石油醚,收集剩余的石油醚于45 ℃氮吹濃縮至近干,用流動相定容至1.0 mL,渦旋混勻,溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾,并做空白實(shí)驗(yàn),供液相色譜測定。

    1.3.3.3 GPC體積排阻法[27, 30]

    稱取混勻后的稻米油4.0 g置于50 mL聚丙烯離心管中,加入0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)母液,加入20 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷(1+1),混勻振蕩提取15 min,取出5 mL樣液,供GPC色譜分離,收集樣液于45 ℃氮吹濃縮至近干,用流動相定容至1.0 mL,渦旋混勻,溶液經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾,并做空白實(shí)驗(yàn),供液相色譜測定。前處理過程比對如表1所示。

    表1 同一樣品的不同前處理過程

    2 結(jié)果與討論

    2.1 色譜條件的優(yōu)化

    毒黃素在258 nm處有最大吸收峰,路霉素在232 nm處有最大吸收峰,熱誠菌素在238 nm處有最大吸收峰,通過對這3種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行全波長掃描來選擇最佳吸收波長,如圖1所示,當(dāng)波長為240 nm時(shí),毒黃素、路霉素和熱誠菌素有相對較高的吸光度,因此檢測波長選為240 nm;使用甲醇甲酸為流動相時(shí),可以使路霉素和毒黃素這兩個同時(shí)出峰的物質(zhì)達(dá)到相應(yīng)分離度要求,因此本研究選用0.1%甲酸-甲醇(90∶10)為流動相。

    圖1 毒黃素、路霉素和熱誠菌素全波長掃描圖

    2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

    根據(jù)食用植物油的大分子特征和目標(biāo)化合物的性質(zhì),采用了5種不同的的前處理提取方法。液液萃取法是利用不同目標(biāo)物質(zhì)在試劑中分配系數(shù)的差異來實(shí)現(xiàn)分離目的。采用有機(jī)試劑直接提取目標(biāo)物質(zhì)[31],可以節(jié)省成本,同時(shí)降低其他雜質(zhì)干擾的風(fēng)險(xiǎn)??紤]到食用植物油不溶于甲醇和乙腈,本研究結(jié)合油脂中化合物測定的相關(guān)國家檢測方法標(biāo)準(zhǔn),考察了幾種主要前處理方式。采用了甲醇[27]和正己烷飽和的乙腈[26]進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在實(shí)驗(yàn)過程中提取溶液出現(xiàn)明顯顏色差異現(xiàn)象,經(jīng)甲醇提取的溶液顏色是深黃色,而正己烷飽和的乙腈是淡黃色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2種試劑的基質(zhì)干擾都很低,目標(biāo)物質(zhì)都能有效分離,區(qū)別在于甲醇溶液比正己烷飽和的乙腈溶液的回收率更高、更穩(wěn)定;本研究中固相萃取法是利用物質(zhì)在固定相和流動相的分配系數(shù)的不同來達(dá)到分離[31],采用極易溶解油脂的正己烷[28]和石油醚[29]溶液來進(jìn)行實(shí)驗(yàn),比較商用固相萃取和自填柱對物質(zhì)分離效果的影響,除去植物油中其他雜質(zhì)的干擾,獲得更穩(wěn)定的基線。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),兩者填料柱里有明顯的黃色物質(zhì)。結(jié)果表明,洗脫液中未檢出3種目標(biāo)化合物,這可能是目標(biāo)物不溶于正己烷和石油醚,無法從填料柱中洗脫下來;采用GPC體積排阻法[30]是根據(jù)溶液中各物質(zhì)的分子質(zhì)量不同,經(jīng)過色譜柱后的停留時(shí)間各不一致來實(shí)現(xiàn)分離,可知毒黃素、路霉素和熱誠菌素均是小分子化合物,而樣品稻米油是大分子物質(zhì),利用這一特性結(jié)合GPC的技術(shù)原理[31],將雜質(zhì)和目標(biāo)化合物在柱前進(jìn)行分離,得到較為純凈的樣液,再進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測,可以減少樣品雜質(zhì)對目標(biāo)化合物出峰時(shí)間和分離情況的干擾,同時(shí),減少樣品雜質(zhì)對色譜柱和檢測儀器的污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該法的基質(zhì)干擾較低,目標(biāo)物質(zhì)可以有效分離,但是回收率效果不理想,可能是由于目標(biāo)物不易溶于流動相造成的。結(jié)果如表2和圖2所示。最終選擇用液液萃取法中甲醇溶液直接提取,實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收和穩(wěn)定性均達(dá)到要求,相對其他前處理方法更為方便,能夠節(jié)約前處理的時(shí)間和成本。

    表2 不同前處理方法的回收率

    注:1為空白樣品,2為Al2O3固相萃取柱(30 mL正己烷活化),3為自填中性氧化鋁固相萃取柱(30 mL石油醚活化),4為GPC體積排阻法,5為液液萃取-乙腈飽和正己烷,6為液液萃取-甲醇。圖2 不同前處理方法的峰面積

    2.3 方法學(xué)評價(jià)

    2.3.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

    分別以毒黃素、路霉素和熱誠菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示3種目標(biāo)化合物在0~40.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。以信噪比(S/N)為3計(jì)算方法檢出限(LOD),以信噪比(S/N)為10計(jì)算方法定量限(LOQ),本方法中毒黃素、路霉素和熱誠菌素的LOD與LOQ分別為0.8 mg/kg與3.2 mg/kg,檢測靈敏度較高,結(jié)果見表3。

    表3 毒黃素、路霉素和熱誠菌素的線性方程和相關(guān)系數(shù)

    2.3.2 回收率實(shí)驗(yàn)和精密度

    稱5.0 g空白稻米油樣品于50 mL聚丙烯離心管中,分別添加3.2、6.4、32.0 mg/kg的毒黃素、路霉素和熱誠菌素的混合標(biāo)準(zhǔn)品,充分混勻后,按照樣品前處理方法進(jìn)行提取,進(jìn)高效液相色譜分析,將加標(biāo)后樣品中毒黃素、路霉素和熱誠菌素的含量與加標(biāo)量相比計(jì)算回收率,毒黃素為98.93%~109.44%,路霉素為102.85%~109.77%,熱誠菌素為95.26%~101.54%,數(shù)據(jù)表明樣品回收率良好,毒黃素方法精密度(RSD)小于6.81%,路霉素方法精密度(RSD)小于4.26%,熱誠菌素方法精密度小于4.30%,結(jié)果顯示該方法精密度良好,符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求,表明本研究方法能準(zhǔn)確檢測食用植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠菌素,結(jié)果見表4。

    表4 毒黃素、路霉素和熱誠菌素方法回收率和精密度(n=6)

    2.3.3 日內(nèi)精密度和日間精密度

    取40 μg/mL的毒黃素、路霉素和熱誠菌素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,考察本方法的日內(nèi)精密度;將該溶液連續(xù)3 d在相同的儀器條件下進(jìn)行測定,以考察本方法的日間精密度。毒黃素的保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)分別為0.068%與0.81%,其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)分別為0.19%與1.21%,路霉素的保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)分別為0.13%與0.46%,,其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)分別為0.18%與1.76%,熱誠菌素的保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)分別為0.19%與0.42%,其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)分別為0.33%與2.00%,表明該方法具有較好的日內(nèi)精密度與日間精密度,結(jié)果見表5和表6。

    表5 毒黃素、路霉素和熱誠菌素的日內(nèi)精密度(n=6)

    表6 毒黃素、路霉素和熱誠菌素的日間精密度(n=3)

    2.4 實(shí)際樣品的測定

    選取市場上主要流通的食用植物油有菜籽油、稻米油、玉米油、芝麻油、花生油和大豆油等11個樣本,采用高效液相色譜分析測定植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠菌素含量,結(jié)果顯示11種植物油均未檢出毒黃素(<0.8 mg/kg),路霉素(<0.8 mg/kg)和熱誠菌素(<0.8 mg/kg)。任意選取一稻米油稱取10個平行隨機(jī)添加3個試管中模擬盲樣測試,添加水平分別為4、8、32 mg/kg,結(jié)果顯示路霉素分別為4.02、7.74、31.18 mg/kg;毒黃素分別為4.13、7.84、30.22 mg/kg;熱誠菌素分別為3.92、7.77、30.55 mg/kg,其他樣品均未檢出,說明該方法可以準(zhǔn)確地定性和定量植物油中的毒黃素、路霉素和熱誠菌素。

    3 結(jié)論

    通過對前處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化,建立一種食用植物油中毒黃素、路霉素和熱誠菌素含量的高效液相色譜檢測方法。該法在0~40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好,毒黃素:y=19.184x-6.00×10-9(r2=0.999 6);路霉素:y=11.273x+3.12 (r2=0.999 4);熱誠菌素:y=29.129x-2.00×10-8(r2=0.999 5)。靈敏度高,當(dāng)取樣量為5 g時(shí),樣品中的毒黃素、路霉素和熱誠菌素經(jīng)甲醇提取,以0.1甲酸∶甲醇(90∶10)為流動相,在240 nm波長下檢測。方法的檢出限均為0.8 mg/kg,定量限均為3.2 mg/kg;在食用植物油中進(jìn)行范圍為3.2~32 mg/kg加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),毒黃素的回收率(n=6)為102.85%~109.77%,方法精密度(RSD,n=6)小于6.81%;路霉素的回收率(n=6)為98.93%~109.44%, 方法精密度(RSD,n=6)小于4.26%;熱誠菌素的回收率(n=6)為95.26%~101.54%, 方法的精密度(RSD,n=6)小于4.30%。本方法操作方便,準(zhǔn)確度高,可用于植物油中毒黃素、路霉素和熱誠菌素的含量測定,也為其他食品中可能產(chǎn)生的毒黃素、路霉素和熱誠菌素含量測定提供檢測依據(jù)。

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