苯甲酸和精油組合對肉雞生長性能、屠宰性能和腸道微生物的影響

燕 磊，楚麗翠，安 沙，呂尊周，王正國，周桂蓮，咼于明

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.新希望六和股份有限公司，北京 100102；3.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東青島 266061；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，四川新希望六和科技創(chuàng)新有限公司，畜禽飼料與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全控制四川省重點實驗室，四川成都 610101；5.帝斯曼維生素（上海）有限公司，上海 201419）

飼料中使用抗生素添加劑對畜禽具有良好的促生長作用，但長期過量使用抗生素會導(dǎo)致耐藥性菌株出現(xiàn)，同時造成體內(nèi)正常菌群失調(diào)，嚴(yán)重威脅動物機(jī)體的健康。歐洲從2006年開始在飼料中禁止使用抗生素。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告，自2020年7月1日起停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。因此，綠色環(huán)保型養(yǎng)殖新體系成為研究的熱點。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)植物提取物、有機(jī)酸等飼料添加劑在改善動物生長和腸道微生物區(qū)系以及提高動物機(jī)體免疫方面發(fā)揮一定作用。苯甲酸作為一種有機(jī)酸，適量添加到飼料中具有提高肉雞增重和飼料轉(zhuǎn)化率的作用。而在飼糧中添加植物精油也有增加動物腸道消化酶的分泌、提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率和動物的抗氧化能力、促進(jìn)動物生長的作用。目前，關(guān)于有機(jī)酸、精油等單一添加劑對肉雞生長性能方面的應(yīng)用研究較多，部分研究報道了二者混合使用的應(yīng)用效果，但對腸道健康的研究較少。因此，本試驗旨在研究有機(jī)酸和精油組合對肉雞生長性能、屠宰性能以及腸道微生物的影響，為綠色環(huán)保型肉雞日糧的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設(shè)計 選取540只1日齡羅斯308商品肉公雞，隨機(jī)分成3組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)30只雞?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組在空白對照組的基礎(chǔ)上添加10 mg/kg維吉尼亞霉素；苯甲酸+精油組在空白對照組的基礎(chǔ)上添加300 mg/kg苯甲酸和植物精油混合物[帝斯曼維生素（上海）有限公司]。該混合物為80%苯甲酸和20%精油混合物（有效成分為百里香酚、丁香酚和胡椒堿）。

1.2 試驗飼糧 試驗飼糧及營養(yǎng)水平參照育種公司推薦標(biāo)準(zhǔn)及NRC標(biāo)準(zhǔn)（1994）配制。試驗分1～14、15～24、25～37日齡3個階段，1～14日齡飼喂破碎料，其他階段均為顆粒料。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗雞采用多層籠養(yǎng)。自由采食和飲水，每日觀察雞群健康情況與精神狀況。采用整舍育雛，暖風(fēng)爐水暖控溫，最初進(jìn)雛時舍溫為32℃，以后每周降低2℃，直到26℃為止。按正常免疫程序進(jìn)行免疫。雞舍內(nèi)溫度、濕度、光照和衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)符合《商品肉雞生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（GB 19664—2005）。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能 在肉雞14、24、37日齡時分別對每個重復(fù)試驗雞進(jìn)行空腹稱重并統(tǒng)計采食量，以計算日增重（ADG）、日采食量（ADFI）、耗料增重比（F/G）。

1.4.2 屠宰性能及消化器官發(fā)育 38日齡，每組隨機(jī)選擇10只雞，稱重后屠宰（下同）。剝離腹脂（包括腹部和肌胃周圍的所有脂肪）、雙側(cè)胸肌和腿肌、肌胃、腺胃并稱重，計算胸肌率、腿肌率以及肌胃、腺胃相對重量（相對于活重的比值）。

1.4.3 免疫器官指數(shù) 屠宰后摘取法式囊、脾臟稱重，計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官重量/體重

1.4.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 處死后迅速拋開腹腔，取出胃腸道，置于冰上，然后用無菌棉線結(jié)扎消化道各段，分離十二指腸、空腸、回腸。立即在冰上無菌條件下取回腸中段食糜，液氮速凍后，用作腸道微生物區(qū)系定性、定量分析。

參照基因組DNA提取試劑盒說明書提取回腸食糜中微生物的DNA。用 NanoDrop 2000測定DNA樣本的濃度，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣本的純度。提取好的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫。將混合好的文庫稀釋定量后用 Illumina-MiSeq測序儀測定，對序列信息進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）、多樣性及差異性分析。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件中GLM模型以ANOVA方法進(jìn)行分析。若各個處理間差異顯著，則用Duncan′s多重比較進(jìn)行檢驗。結(jié)果用最小二乘法的平均值表示，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 苯甲酸和精油組合對肉仔雞生長性能的影響 由表2可見，苯甲酸和精油組合對各階段肉雞生長性能無顯著影響。苯甲酸+精油組的24日齡體重高于空白對照組（>0.05）；25～37日齡，抗生素組肉雞耗料增重比最低（1.65）；1～37日齡，抗生素組肉雞出欄體重最高，耗料增重比最低。

表2 苯甲酸和精油組合對肉雞生長性能的影響

2.2 苯甲酸和精油組合對肉雞屠宰性能及免疫器官發(fā)育的影響 如表3所示，苯甲酸+精油對肉雞胸肌率、腿肌率及肌胃、腺胃相對重、免疫器官指數(shù)的影響均不顯著。

表3 苯甲酸和精油組合對肉雞屠宰性能和免疫器官指數(shù)的影響

2.3 苯甲酸和精油組合對腸道微生物的影響

2.3.1 苯甲酸和精油組合對肉雞回腸微生物區(qū)系的影響如圖1所示，3組所共有的OTUs為328個。其中，對照組和抗生素組共有208個OTUs，對照組和苯甲酸+精油組共有139個OTUs，抗生素組和苯甲酸+精油組共有51個OTUs。如圖2所示，Specaccum物種累積曲線已到達(dá)平臺期，說明實際測序量足以覆蓋群落物種組成，能夠真實反映群落各物種間的相對比例關(guān)系，并間接反映樣品中物種的豐富度。

圖2 Specaccum物種累積曲線

2.3.2 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道微生物-多樣性的影響 如表4和圖3所示，苯甲酸+精油組多樣性的Chao1和Observed_species指數(shù)均低于對照組（<0.05），且有降低Shanon指數(shù)的趨勢（>0.05）。

圖3 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道微生物α-多樣性的影響

表4 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道微生物α-多樣性的影響

2.3.3 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道微生物-多樣性的影響 非量度多維尺度分析（Non-metric Multidimensional Scale，NMDS）結(jié)果的應(yīng)力值（Stress）越小越好，一般認(rèn)為當(dāng)該值小于0.2時，NMDS分析的結(jié)果較可靠。如圖4、圖5所示，不同處理的肉雞菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定差異，NMDS的應(yīng)力值為0.18，表明NMDS分析結(jié)果可信。

圖4 微生物NMDS分析圖

圖5 微生物主坐標(biāo)分析（PCA）圖

2.3.4 苯甲酸和精油組合對肉雞回腸不同分類水平菌群的影響 由表5和圖6可見，門水平上，肉雞腸道微生物中相對豐度最高的4個門類分別為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門以及擬桿菌門。其中3個組間門水平上的菌群豐度無顯著差異。苯甲酸+精油組厚壁菌門豐度高于抗生素組（>0.05）?？股亟M變形菌門豐度最高（8.71%），苯甲酸+精油組最低（0.81%）。

表5 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道菌群門水平相對豐度的影響 %

圖6 微生物門水平相對豐度

由表6和圖7可見，屬水平上，對照組肉雞腸道中不動桿菌的相對豐度高于抗生素組和苯甲酸+精油組（=0.05）。與抗生素組相比，苯甲酸+精油組能降低腸桿菌屬豐度（<0.05），乳桿菌屬豐度提高33.5%（>0.05）。

圖7 腸道微生物屬水平相對豐度

表6 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道微生物屬水平相對豐度的影響 %

3 討 論

3.1 苯甲酸和精油組合對肉仔雞生長性能的影響 苯甲酸有提高肉雞增重的趨勢，但過量添加會抑制肉雞生長。茍清碧等研究表明，日糧中添加包埋苯甲酸可提高青麻腳雞體重，且可降低耗料增重比。Hernández 等研究表明，百里香酚精油混合物對14～21日齡肉仔雞的日增重有改善作用。朱曉磊等研究表明，添加不同水平的百里香酚可以提高麻花肉雞的體重。由此可見，單獨添加適量的苯甲酸或植物精油對肉雞生長有改善作用。而植物精油和有機(jī)酸混合對肉雞生長的作用也有相關(guān)報道。張杏莉研究發(fā)現(xiàn)，不同水平（150、200、250 mg/kg）的“精油+有機(jī)酸”包被制劑均可提高肉雞平均日增重，降低耗料增重比，改善肉雞生長性能。Aristimunha等研究表明，使用苯甲酸和精油混合物能改善1～42日齡肉雞生長和飼料轉(zhuǎn)化率。Gao等報道，精油和苯甲酸混合物能改善0～21 日齡日增重和耗料增重比。Yang等和Pham等均報道，使用酸化劑和精油混合物能改善肉雞耗料增重比。這些有益效果可能是有機(jī)酸通過降低飼糧pH，促進(jìn)腸道消化，而精油能增加膽鹽分泌，提高腸黏膜和胰腺的酶活性，進(jìn)而影響肉雞生長。但也有研究發(fā)現(xiàn)，肉雞日糧中添加有機(jī)酸和植物提取物對生長性能的影響不顯著。同樣，本試驗所用精油由百里香酚、丁香酚、胡椒堿等組成，與苯甲酸同時使用，對提高增重有一定效果，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著水平。各研究結(jié)果不盡一致，可能與所用產(chǎn)品工藝及添加水平、飼養(yǎng)管理及所用試驗動物有關(guān)。本試驗中，試驗動物的飼養(yǎng)密度較小，整個過程中雞群較為健康，成活率較高，使用抗生素以及苯甲酸和精油組合均未有顯著的促生長效果。

3.2 苯甲酸和精油組合對肉雞屠宰性能及免疫器官發(fā)育的影響 本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和精油組合對胸肌率、腿肌率以及肌胃、腺胃發(fā)育無顯著影響。Isabel等研究表明，日糧中添加酸化劑和精油以及二者混合對肉雞胴體出成率的影響不顯著，但使用精油對胸肌率有一定影響。Leeson等報道，聯(lián)合使用維吉尼亞霉素和丁酸對肉雞胴體出成率無顯著影響。García等研究也發(fā)現(xiàn)，甲酸和植物精油對肉雞胴體出成率、胸肌和腿肌率均無顯著影響。以上結(jié)果均表明，酸化劑和植物精油對雞屠宰性能無顯著影響。

本試驗未發(fā)現(xiàn)苯甲酸和精油對肉雞免疫器官發(fā)育有顯著影響。胡驍飛等發(fā)現(xiàn)，在 1～42日齡愛維茵肉仔雞基礎(chǔ)日糧中添加牛至油可刺激免疫器官發(fā)育，增加免疫器官重量，機(jī)體免疫能增強(qiáng)。熊娟等研究發(fā)現(xiàn)，使用精油能顯著刺激法氏囊發(fā)育，對脾臟的影響不大。朱曉磊等研究報道，添加百里香精油能顯著提高麻花雞胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)。本試驗與以上研究結(jié)果不盡一致，可能是所用酸化劑和精油組合產(chǎn)品種類及劑量并不足以刺激免疫器官改變。

3.3 苯甲酸和精油組合對肉雞腸道微生物的影響 腸道菌群組成對宿主機(jī)體的健康、新陳代謝、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和免疫有重要影響。-多樣性反映了單個樣品物種豐度及物種多樣性，可通過Chao1指數(shù)、Observed_species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用來反映菌群的-多樣性，前3個指數(shù)越大，說明菌群的多樣性和豐富度越高；Simpson指數(shù)越大表明優(yōu)勢菌群占總體生物菌群比重越大。楊建平等研究表明，蛋雞飼糧中添加復(fù)合植物精油對盲腸菌群的 Chao1指數(shù)無顯著影響，但能顯著降低Shannon指數(shù)，說明飼糧中添加八角茴香和百里香復(fù)合精油減少盲腸菌群的多樣性。Gunal等研究表明，有機(jī)酸不影響肉雞生產(chǎn)性能，但會降低腸道微生物數(shù)量。本試驗結(jié)果表明，使用苯甲酸和精油組合會降低菌群的豐度，可能與組合方案中所用的精油及苯甲酸抑制有害菌的增殖有關(guān)。

本試驗結(jié)果顯示，肉雞回腸菌群在門水平上的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。厚壁菌門能促進(jìn)日糧中能量的利用，厚壁菌的增加與營養(yǎng)吸收的增加有關(guān)，有助于提高生產(chǎn)性能。本試驗發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和精油組合組肉雞厚壁菌門高于對照組和抗生素組，這與Pham等的研究一致。變形菌門是動物腸道微生物中另一大門類，變形菌門含有許多病原體細(xì)菌，如立克次氏體屬（）、布魯氏菌屬（）和奈瑟菌屬（），有可能對畜禽健康產(chǎn)生不利影響。本試驗結(jié)果表明，苯甲酸和精油組合降低了回腸變形菌門的豐度，有利于腸道健康。放線菌門在腸道中的數(shù)量較少，但此門下的雙歧桿菌屬卻是雞腸道內(nèi)的有益菌，它能夠酸化腸道內(nèi)環(huán)境，抑制病原菌的生長，對動物腸道健康起著重要作用。整體上，苯甲酸和精油組合增加了厚壁菌門的相對豐度，降低了擬桿菌門的相對豐度，有利于維護(hù)腸道健康。較高的厚壁菌門數(shù)量可能會增強(qiáng)飼喂酸化劑和精油組肉雞的能量吸收，從而有利于肉雞體重的增加。

屬水平的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬、分節(jié)絲狀菌、不動桿菌屬、腸桿菌屬以及葡萄球菌屬，其中分解絲狀菌、不動桿菌、腸桿菌及葡萄球菌屬的水平均處于較低水平。不動桿菌是條件致病菌，包含一些醋酸鈣不動桿菌、魯菲不動桿菌、鮑曼不動桿菌等，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時，容易引起動物機(jī)體的感染。Yousaf 等研究表明，添加0.20%包被苯甲酸可以調(diào)節(jié)肉雞盲腸微生物菌群，增強(qiáng)乳酸桿菌的繁殖。宋凡春也發(fā)現(xiàn)，添加0.25%和0.50%包被苯甲酸顯著提高了肉雞盲腸乳酸桿菌的豐度。Jamroz等研究發(fā)現(xiàn)，在雞飼糧中添加適宜水平的百里香酚和肉桂醛等提高了腸道乳酸桿菌的數(shù)量，降低了大腸桿菌數(shù)量。劉仲昊等研究表明，聯(lián)合使用20 g/t百里香酚-香芹酚混合物能改善斷奶仔豬結(jié)腸微生物群落結(jié)構(gòu)，提高有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度，促進(jìn)微生物的代謝功能。Giannenas等研究證實，苯甲酸和精油同時使用促進(jìn)了火雞盲腸乳酸桿菌的繁殖，減少了大腸桿菌的數(shù)量。Gao等研究也表明，苯甲酸和精油混合物減少了肉雞盲腸大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量，提高了乳酸桿菌的數(shù)量。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，酸化劑和精油混合物提高了回腸食糜中乳酸桿菌豐度。本試驗中屬水平的物種相對豐度結(jié)果顯示，抗生素組和苯甲酸+精油組均顯著降低了不動桿菌的豐度，苯甲酸和精油組合還在一定程度上提高了乳酸桿菌的豐度。由此可見，苯甲酸和精油組合的優(yōu)勢菌群為有益菌，腸道處于較為健康的狀態(tài)。這種優(yōu)勢菌群的維持，可能因為益生菌的適宜pH低于有害菌，而苯甲酸能維持較低的胃腸道pH，進(jìn)而改善微生態(tài)平衡；苯甲酸與百里香酚-香芹酚等精油成分的選擇性抗菌特性協(xié)同，可以通過促進(jìn)潛在有益腸道微生物的生長和抑制有害細(xì)菌的增殖來改善腸道健康，并通過促進(jìn)微生物的代謝來提高肉雞增重，具體作用機(jī)理還需做進(jìn)一步的微生物代謝功能分析。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，聯(lián)合使用苯甲酸和精油對肉雞生長無不利影響，但能降低腸道不動桿菌屬和腸桿菌屬菌群豐度，提高厚壁菌門和乳桿菌屬豐度，維持腸道健康。