烘干玉米和1年陳玉米對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞生產(chǎn)性能和腸道微生物的影響

程 雪，劉禹辰，王 忠，寧中華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

關(guān)鍵字：蛋種雞；陳玉米；烘干玉米；生產(chǎn)性能；腸道菌群

玉米作為飼料之王，是家禽能量代謝的主要來源。通過自然風(fēng)干或機(jī)械烘干的方式可以將新鮮玉米中的水分去除后進(jìn)行儲(chǔ)存或飼喂。已有研究表明，飼喂用不同處理方式和儲(chǔ)存時(shí)間的玉米對(duì)家禽生產(chǎn)性能有不同影響。王超等研究表明，與正常玉米組相比，用4年陳化玉米飼喂蛋雞顯著降低了其產(chǎn)蛋率和血清抗氧化能力。穆雅東發(fā)現(xiàn)，用4年陳化玉米完全替代正常玉米會(huì)顯著降低蛋雞平均日采食量和平均蛋重。

健康的腸道菌群能有效抵抗外來病原體的入侵，保障機(jī)體健康。日糧的形態(tài)和成分在很大程度上影響著動(dòng)物腸道菌群的多樣性。李錦英等發(fā)現(xiàn)，4年陳化玉米飼喂仔豬對(duì)其后腸腸道菌群無顯著影響。Qamar用4年陳化玉米飼喂肉鴨會(huì)改變盲腸菌群多樣性，損傷腸道健康。但關(guān)于陳玉米對(duì)家禽腸道菌群的影響未見報(bào)道。目前市場(chǎng)中流通并作為飼糧主要成分的烘干玉米和陳化玉米對(duì)蛋種雞生產(chǎn)性能是否有影響，是否能通過改變蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)蛋種雞生產(chǎn)性能還未知。因此，本試驗(yàn)旨在探索烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞的生產(chǎn)性能和腸道微生物的影響，為產(chǎn)蛋后期蛋種雞的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 采用1年陳玉米和烘干玉米品種均為先玉335。1年陳玉米于2018年收割，于倉庫中干燥通風(fēng)條件下存儲(chǔ)1年；烘干玉米于2019年收割，烘干風(fēng)溫小于60℃，烘干后進(jìn)行飼喂。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)飼糧 選用河北省邯鄲市曲周縣華耀種雞場(chǎng)224只健康狀況良好、體重接近、生產(chǎn)性能相似的55周齡海蘭褐蛋種雞，隨機(jī)分為2組（陳玉米組和烘干玉米組），每組7個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16只雞，4只雞1個(gè)籠子，均勻分布在4層H型雞籠的第2層。預(yù)試期1周，正試期8周。在整個(gè)飼喂周期內(nèi)飼料飲水均不添加任何外源抗生素，參照NRC（2004）和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T33-2004），并結(jié)合《海蘭褐蛋雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》進(jìn)行飼養(yǎng)管理。飼料由河北六合飼料廠根據(jù)配方制作完成?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 生產(chǎn)性能測(cè)定 試驗(yàn)期間每天按照重復(fù)收集雞蛋，以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋量和蛋重，每日統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)雞的死亡情況。每28天結(jié)料記錄飼料消耗量并計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化率（料蛋比）。計(jì)算55～59、60～63周齡以及55～63周齡期間平均產(chǎn)蛋率、平均蛋重、破蛋率、畸形蛋率。

1.4 腸道微生物 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組7個(gè)重復(fù)隨機(jī)各取1只健康狀況良好的種雞。頸部放血處死后無菌操作取回腸近端食糜裝入2 mL Axygen離心管中，迅速放入液氮中速凍，盡快轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中存放，全程冷鏈。根據(jù)QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit（5）（Cat No.51531）試劑盒說明書提取回腸食糜DNA。所提取DNA被稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度1 ng/μL并存儲(chǔ)在-20℃冰箱。利用PCR編碼引物343 F（5′-TA CGGRAGGCAGCAG-3′）和798 R（5′-AGGGTATCTAA TCCT-3′）擴(kuò)增16S rRNA基因的細(xì)菌通用V3-V4區(qū)。隨后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)一步純化，使用Quanti Fluor-ST（Promega，USA）試劑盒進(jìn)行定量。純化后的擴(kuò)增子等摩爾量上機(jī)并遵循標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程于Illumina MiSeq平臺(tái)（上海歐易生物醫(yī)學(xué)公司）進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析 由Illumina Miseq測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式，通過QIIME（version 1.8.0）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及后續(xù)的生物信息學(xué)分析。首先，使用Trimmomatic軟件對(duì)配對(duì)序列進(jìn)行預(yù)處理，檢測(cè)并去除模糊堿基（N），采用10 bp滑動(dòng)窗口裁剪法去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20的低質(zhì)量序列。其次，使用FLASH軟件對(duì)雙端序列進(jìn)行裝配（最大Overlap=200 bp、最小Overlap=10 bp、最大錯(cuò)配率=20%）。進(jìn)一步對(duì)模糊序列、同源序列以及長(zhǎng)度不足200 bp的序列進(jìn)行去除。保留Q20值大于75%的序列，去除序列中的嵌合體。使用Vsearch軟件對(duì)clean reads進(jìn)行聚類。利用97%的序列相似性進(jìn)行分類，生成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）。所有代表性的序列與silva 123數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)并得到注釋信息。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 基于OTU的分析進(jìn)行微生物多樣性分析，由QIIME進(jìn)行。在微生物多樣性分析中，計(jì)算Chao1、Observe Species、Shannon和Simpson，估算群落豐富度和均勻度，利用Good’s coverage metric進(jìn)行稀疏度計(jì)算，用R vegan package進(jìn)行物種積累曲線。采用R Vennerable軟件包實(shí)現(xiàn)Venn圖，可視化兩組間的OTUs貢獻(xiàn)。采用rindval package進(jìn)行indicator分析，并在各水平上統(tǒng)計(jì)各處理組微生物組成。

2 結(jié)果

2.1 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞生產(chǎn)性能的影響由表2可見，烘干玉米組產(chǎn)蛋率在55～59、60～63周齡以及55～63周齡分別比陳玉米組高6.2%、5.5%以及5.8%（>0.05），且兩組其他各項(xiàng)生產(chǎn)性能指標(biāo)均無顯著差異。

表2 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞腸道微生物菌群豐富度和多樣性的影響 在提取食靡DNA時(shí)，有1個(gè)樣品質(zhì)量不合格，故每組只有6個(gè)樣用于后續(xù)測(cè)序；在進(jìn)行非度量多維尺度分析（NMDS）分析時(shí)，陳玉米組中有1只種雞顯示離群嚴(yán)重，存在異常，故將其剔除。經(jīng)過質(zhì)控和嵌合體去除后，分別獲得305 015條clean tags和281 993條valid tags，平均每個(gè)回腸樣本測(cè)得25 635條valid tags用于后續(xù)分析。

物種累積曲線和稀釋曲線能反映抽樣樣本量和測(cè)序深度是否合理。從圖1中可以看出，物種累積曲線隨著樣本量的增加趨于平緩，說明抽樣量合理，能涵蓋大多數(shù)物種；稀釋曲線里每個(gè)樣本先顯著上升后趨于平緩，說明測(cè)序深度合理，可以用于后續(xù)分析。

圖1 物種累積曲線和稀釋曲線

在97%的序列相似度下，總共獲得878個(gè)OTU，其中陳玉米組有671個(gè)OTU，烘干玉米組有527個(gè)OTU，2組共同OTU有320個(gè)（圖2）。

圖2 OTU韋恩圖

Chao 1和Simpson指數(shù)可以反映樣本微生物的豐富度和均勻度。從圖3可以看出，烘干玉米組Chao1和Simpson指數(shù)均低于陳玉米組（<0.05）。

圖3 Alpha多樣性指數(shù)小提琴圖

為了比較不同處理組各樣本微生物群落之間的差異，通過非度量多維尺度分析（NMDS）對(duì)其距離進(jìn)行計(jì)算和判斷。從圖4中可以看出，陳玉米組和烘干玉米組具有明顯差異且Anosim<0.05。

圖4 NMDS非度量多維尺度分析圖

2.3 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響 從圖5和表3中可以看出，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門是2個(gè)組的優(yōu)勢(shì)菌門（總豐度占比>95%），但在不同處理組中所占比例不同。與陳玉米組相比，烘干玉米組厚壁菌門由66.56%增加到80.41%（=0.201），變形菌門由14.89%減少到10.95%（=0.201），擬桿菌門和螺旋菌門也有不同程度減少。

表3 門水平微生物豐度統(tǒng)計(jì)（豐度>1%）

圖5 門水平下豐度top15微生物組成

從圖6和表4中可以看出，乳酸桿菌屬和是2個(gè)組的優(yōu)勢(shì)菌屬。在陳玉米組中，兩菌屬分別占總豐度的32.56%和17.75%；在烘干玉米組中，兩菌屬分別占總豐度的13.11%和49.62%。與陳玉米組相比，烘干玉米組中豐度>1%的菌屬遠(yuǎn)少于陳玉米組。此外，兩組中還存在大量其他菌屬（分別占總豐度的16.07%和18.20%）。

圖6 屬水平下豐度top15微生物組成

表4 屬水平微生物豐度統(tǒng)計(jì)（豐度>1%）

通對(duì)各組OTU信息計(jì)算Indicator值得出每組的指標(biāo)性物種。由圖7可見，陳玉米組中存在指示性細(xì)菌分別為擬桿菌屬（OTU_127、OTU_97、OTU_63）、不動(dòng)桿菌屬（OTU_47）、柯林斯氏菌屬（OTU_263）、疣微菌屬（OTU_123）、菌屬（OTU_220）。

圖7 Indicator分析圖

3 討 論

3.1 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞生產(chǎn)性能的影響本試驗(yàn)中，用1年陳玉米和烘干玉米分別飼喂蛋種雞，對(duì)蛋種雞的生產(chǎn)性能無顯著影響。Mu等發(fā)現(xiàn)，4年陳化玉米顯著降低了蛋雞的平均日采食量和蛋重；但常青發(fā)現(xiàn)陳玉米對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋量、蛋重和料蛋比等指標(biāo)均無顯著影響。研究表明，陳玉米在儲(chǔ)存過程中，脂質(zhì)易發(fā)生氧化酸敗產(chǎn)生大量游離脂肪酸，同時(shí)玉米抗氧化酶活性降低，機(jī)體產(chǎn)生更多的自由基，霉菌毒素含量（如黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素等）可能增加，用其飼喂動(dòng)物易對(duì)機(jī)體抗氧化能力和生產(chǎn)性能造成負(fù)面影響；烘干玉米在機(jī)械處理過程中也易使蛋白質(zhì)變性、脂肪酸升高等，產(chǎn)生粉碎料，影響飼料營(yíng)養(yǎng)和口感等。兩者都可能對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育有不利影響。但在本試驗(yàn)中，由于陳玉米的儲(chǔ)存時(shí)間不長(zhǎng)，倉庫中干燥通風(fēng)儲(chǔ)存，蛋雞對(duì)此可能有一定的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力，因此對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能影響不顯著。

3.2 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞腸道微生物菌群豐富度和多樣性的影響 家禽腸道菌群在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)利用、腸道上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)以及腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。Chao 1和Simpson指數(shù)可以用來衡量菌群的多樣性及均勻度。Chao 1和Simpson指數(shù)越大，說明腸道菌群多樣性及均勻度越高。本試驗(yàn)中，烘干玉米組Chao1和Simpson指數(shù)均顯著低于陳玉米組，說明烘干玉米組的腸道微生物不如陳玉米組豐富，可能是陳玉米對(duì)母雞自身免疫力、抗氧化狀態(tài)和腸道形態(tài)都有一定負(fù)面影響，使得機(jī)體腸道中有益菌沒直接抑制病原菌或腸道內(nèi)各菌群間競(jìng)爭(zhēng)性抑制減少使菌群種類多樣。

3.3 烘干玉米和1年陳玉米對(duì)蛋種雞腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響 在門水平上，與陳玉米組相比，烘干玉米組中變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度降低，厚壁菌門相對(duì)豐度增加，并在回腸中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位（80.41%）。厚壁菌門在宿主體內(nèi)主要參與物質(zhì)和能量的代謝過程。擬桿菌能促進(jìn)宿主消化道內(nèi)碳水化合物和多糖的消化，維持腸道微生態(tài)平衡。推測(cè)烘干玉米組厚壁菌門的相對(duì)豐度增加可能與烘干玉米的能量較陳玉米高有關(guān)，從而使其參與了更多的物質(zhì)和能量代謝。本研究前期同樣發(fā)現(xiàn)烘干玉米組對(duì)飼糧的能量利用率較1年陳玉米組高，其原因也可能是烘干玉米組厚壁菌門提高了對(duì)能量的利用和代謝。變形菌門包括許多病原菌（如大腸桿菌、沙門氏菌和幽門螺桿菌等）在腸道中的相對(duì)豐度與腸道健康呈負(fù)相關(guān)。陳玉米在儲(chǔ)存過程中，易感染黃曲霉毒素。雷曉婭發(fā)現(xiàn)，使用含黃曲霉毒素的玉米飼喂仔豬后，仔豬直腸中大腸桿菌數(shù)增多，降低了仔豬生產(chǎn)性能。推測(cè)本試驗(yàn)1年陳玉米可能存在霉變導(dǎo)致母雞回腸里變形菌門含量增加。

在屬水平上，與陳玉米組相比，烘干玉米組中乳酸桿菌屬所占比例下降，而屬含量升高。而李錦英等發(fā)現(xiàn)，4年陳化玉米對(duì)仔豬盲腸和結(jié)腸的乳酸菌和總菌數(shù)量影響不顯著。這可能與新陳玉米的粗蛋白質(zhì)含量和機(jī)體腸道內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸含量有關(guān)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)發(fā)生氧化，產(chǎn)生大量游離脂肪酸和揮發(fā)性物質(zhì)（如乙酸和丙酸等）。前期研究發(fā)現(xiàn)，陳玉米組對(duì)蛋白質(zhì)的消化利用率低于烘干玉米組，因此由未消化的蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸也較烘干玉米組多。同時(shí)，揮發(fā)性脂肪酸對(duì)腸道健康有較大的益處。在飼糧中添加0.5 mg/kg丁酸也有利于恢復(fù)腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的活性。這可能是陳玉米組中乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬較烘干玉米組含量高的原因。關(guān)于菌屬目前研究較少。據(jù)報(bào)道，在母雞日糧中添加黃芪多糖后，蛋雞糞便中存在較多的乳酸菌和大量減少的，推測(cè)這兩種菌屬之間存在競(jìng)爭(zhēng)排斥關(guān)系。本試驗(yàn)中，與乳酸桿菌屬也是存在明顯相反的變化趨勢(shì)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，1年陳玉米和烘干玉米對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能無顯著影響；與烘干玉米組相比，1年陳玉米組能顯著提高蛋雞腸道菌群多樣性和均勻度，降低菌屬豐度，提高乳酸桿菌屬豐度。