Perilipin在牛脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式

雷召雄，戶春麗，潘翠麗，魏大為，楊夢麗，高曉茜，王興平，馬 云*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021）

脂肪沉積是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種激素、酶、轉(zhuǎn) 錄因子和多種信號通路的調(diào)控，脂肪生成主要經(jīng)歷增生和肥大2個(gè)過程。脂滴是脂肪細(xì)胞最主要的組成部分，由甘油三酯和少量的膽固醇構(gòu)成中心脂滴的核心，外面覆蓋著單層磷脂。脂滴的聚集是脂肪生成的基礎(chǔ)，眾所周知，脂肪生成分為脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大。研究表明，除了能量儲存，脂滴在控制細(xì)胞應(yīng)激、蛋白質(zhì)處理及其他生理過程中也發(fā)揮了重要的作用。Perilipin蛋白家族是脂滴表面含量最多的一種可磷酸化蛋白，能與脂滴特異性結(jié)合，其家族成員在脂滴的生成和降解過程中發(fā)揮了雙向調(diào)控作用。因此，探究Perilipin蛋白家族成員的理化性質(zhì)以及各蛋白之間的互作關(guān)系和其在牛脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式可為解析牛脂肪生成的分子機(jī)理提供理論依據(jù)，并能為未來牛遺傳育種提供參考信息。

研究報(bào)道，啟動子區(qū)域存在RXR的結(jié)合位點(diǎn)，過表達(dá)促進(jìn)雞前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)的積累。在豬脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)量逐漸增加，因此被確定為脂肪細(xì)胞分化過程中的新的候選基因。是白色脂肪細(xì)胞成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，影響脂肪細(xì)胞的脂肪沉積過程。在肥胖小鼠脂肪組織中，的缺失造成了脂肪組織的褐變，并表明了脂肪褐變的機(jī)制可能有助于對肥胖的抵抗。有研究報(bào)道，在牛脂肪細(xì)胞分化的第2天，的mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，同時(shí)證明了和在牛脂肪生成過程中有相互作用。敲除小鼠腹股溝白色脂肪細(xì)胞中的米色脂肪細(xì)胞和產(chǎn)熱基因的量增加，并誘導(dǎo)的激活，表明作為內(nèi)在的保護(hù)因子，可通過阻礙脂質(zhì)代謝和熱基因表達(dá)來抑制米色脂肪細(xì)胞的形成。研究顯示，在脂肪肉瘤中的表達(dá)顯著高于非脂肪肉瘤，在含有多態(tài)性的肥胖個(gè)體中，肥胖治療的結(jié)果會減弱。在肌內(nèi)脂肪中，磷酸化會釋放從而激活A(yù)TGL的表達(dá)，同時(shí)有研究觀察到，在肥胖小鼠脂肪組織中的失活會下調(diào)的表達(dá)并且減少小鼠體內(nèi)脂肪的蓄積。綜上，Perilipin蛋白在脂肪生成和降解過程中起了非常重要的作用。

因此，本研究擬采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析的方式對Perilipin蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并探究其在牛脂肪細(xì)胞分化前后的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步解釋在牛脂肪生成過程中的分子機(jī)制提供前期的參考數(shù)據(jù)并為未來牛遺傳育種提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞樣采集 本實(shí)驗(yàn)中用于分離培養(yǎng)牛前體脂肪細(xì)胞的當(dāng)日早產(chǎn)犢牛由澤瑞生態(tài)養(yǎng)殖牧場贈予。犢牛帶回實(shí)驗(yàn)室全身消毒后頸部放血，快速打開腹腔采集牛腎周脂肪組織，先用含5%雙抗的PBS沖洗1次再用含2%雙抗的PBS清洗2次，轉(zhuǎn)移到含有1%雙抗的PBS中并快速地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBRPremix Ex Taq（2×）由TaKaRa公司（日本）提供；I型膠原酶、油紅O由北京索萊寶科技有限公司提供；無水乙醇、氯仿、異丙醇、甲醛等均為國產(chǎn)分析純。DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰酶、PBS購自?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；羅格列酮、地塞米松和IBMX均購自Singma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Perilipin進(jìn)化樹構(gòu)建 為了探究Perilipin蛋白在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫下載Perilipin家族各蛋白的氨基酸序列，并利用MEGA5.0結(jié)合Fig tree分析了Perilipin氨基酸序列在牛（）、水牛（）、山羊（）、豬（）、雞（）以及人（）和小鼠（）之間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.2 牛Perilipin的染色體定位及與水牛Perilipin的染色體共線性分析 為了探究?；蛟谌旧w上的定位和水牛之間的共線性關(guān)系，從基因組序列和注釋文件中提取預(yù)測的牛和水?；虻奈恢眯畔ⅲ肨Btools對牛Perilipin在染色體上的位置進(jìn)行定位和可視化分析，用2個(gè)物種已鑒定的Perilipin在染色體上進(jìn)行作圖，并采用MCScanx包結(jié)合TBtools對牛和水牛的基因進(jìn)行共線性分析。

1.2.3 牛Perilipin蛋白的結(jié)構(gòu)域、親疏水性分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 為了確定牛Perilipin家族蛋白的結(jié)構(gòu)域、親疏水性質(zhì)以及互作蛋白預(yù)測，首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了牛Perilipin的不同轉(zhuǎn)錄本，利用上述轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)在在線軟件NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和TBtools中分析了Perilipin蛋白的結(jié)構(gòu)域，利用TBtools進(jìn)行可視化；并利用在線軟件ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析了Perilipin蛋白的親疏水性；最后利用在線軟件String（https://www.string-db.org/cgi/input?sessionId=bg1PKUZkNR9S&inp ut_page_show_search=on）對Perilipin家族5個(gè)蛋白進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測。

1.2.4 牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 本實(shí)驗(yàn)采用I型膠原酶消化法分離培養(yǎng)牛前體脂肪細(xì)胞，方法見文獻(xiàn)。簡單來說，選取2塊大約1 cm的腎周脂肪組織，用剪刀剪成大約1 mm的小塊，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入3 mL I型膠原酶（2 mg/mL）在37℃水浴鍋中消化90 min，期間，每10 min轉(zhuǎn)動離心管1次。待消化法得到的細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含10 μg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX和1 μmol/L羅格列酮的完全培養(yǎng)基），誘導(dǎo)2 d后，棄去誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，加維持分化培養(yǎng)基（含10 μg/mL胰島素和1 μmol/L羅格列酮的完全培養(yǎng)基），每2 d換液1次并收集一批細(xì)胞。誘導(dǎo)10 d后，收獲最后一批細(xì)胞，用于qPCR分析。

1.2.5 油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的測定 利用油紅O對分化前和分化完成后的牛前體脂肪細(xì)胞染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，用PBS將油紅O儲存液（油紅O+PBS）按照2:3稀釋成工作液，用10%的福爾馬林固定細(xì)胞后染色，最后用異丙醇收集油紅O，用全波長多功能酶標(biāo)儀測定480 nm處的OD值。

1.2.6 細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的獲得 采用酚氯仿法提取細(xì)胞總RNA，操作流程參照Trizol試劑盒說明書，利用多功能全波長酶標(biāo)儀檢測總RNA的濃度（ng/μL）及OD值（OD/OD的比值在1.8～2.0符合要求），利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性（能清晰地看到28S和18S的條帶即認(rèn)為總RNA質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)）。并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中提供的隨機(jī)引物將獲得的總RNA1 000 ng反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存于-20℃冰箱，備用。

1.2.7 Perilipin時(shí)序表達(dá)譜檢測 采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物（表1）；利用qPCR技術(shù)檢測牛前體脂肪細(xì)胞分化0、2、4、6、10 d過程中Perilipin的相對表達(dá)水平，以細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（n=3），qPCR反應(yīng)體系：SYBR Green 7.5 μL，cDNA 4 μL（cDNA原液稀釋5倍），上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，RNase-free ddHO 2.9 μL。qPCR反應(yīng)程序：預(yù)變性3 min（95℃），變性10 s（95℃），退火20 s（59～61℃），延伸30 s（72℃），設(shè)置40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參基因選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。

表1 引物信息

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 2法分析熒光定量的結(jié)果，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，其中<0.01為差異極顯著，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Perilipin蛋白在不同物種之間的進(jìn)化樹構(gòu)建 系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，牛的Perilipin蛋白中，PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN5氨基酸序列與水牛相似度最高，其次為山羊；水牛和山羊的PLIN4氨基酸序列同源性最高，其次與牛聚為一支，如圖1，提示牛的Perilipin蛋白與水牛和山羊的相似度最高。

圖1 Perilipin蛋白在牛和其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系

2.2 Perilipin的染色體定位和共線性分析 共線性分析結(jié)果顯示，基因分布在牛的BT7（、、）、BT8（）和BT21（）染色體上，分布在水牛的BB3（）、BB9（、、）和BB20（）染色體上（圖2A），其中、、是位于牛和水牛同一條染色體上的3個(gè)串聯(lián)基因。共線性分析結(jié)果表明，牛（2n=60）和水牛（2n=50）的染色體數(shù)目不同，但2個(gè)物種的染色體之間存在廣泛的同源關(guān)系。在基因中，位于牛7號染色體的和、8號染色體的、21號染色體的分別與位于水牛9號染色體的和、3號染色體的和20號染色體的存在共線性關(guān)系，但未找到在牛和水牛上的共線性信息（圖2B）。

圖2 Perilipin的染色體定位和共線性分析

2.3 Perilipin蛋白結(jié)構(gòu)域分析 Perilipin蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，該家族成員均含有Prelipin結(jié)構(gòu)域，其中，PLIN1、PLIN2，PLIN3、PLIN5只 含 有1個(gè)Perilipin結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)域約位于0～300位氨基酸之間；PLIN4含有15個(gè)Perilipin結(jié)構(gòu)域，如圖3。

圖3 Perilipin蛋白結(jié)構(gòu)域分析

2.4 Perilipin親疏水性分析 親疏水性分析結(jié)果表明，PLIN1在146位aa處有最大值2.133，294～296 aa之間有最小值為-3.122（圖4A）；PLIN2在65位aa處有最大值1.944，在426位aa處有最小值-2.844（圖4B）；PLIN3在267位aa處有最小值為-2.822，422位aa處有最大值1.789（圖4C）；PLIN4在12位aa處有最小值-2.656，在1 653位aa處有最大值為1.700（圖4D）；PLIN5在276位aa處有最小值-3.156，367位aa處有最大值2.089（圖4E）?？傮w上Perilipin蛋白均呈疏水性。

圖4 Perilipin蛋白親疏水性分析

2.5 牛Perilipin蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 預(yù)測Perilipin蛋白家族成員之間的互作關(guān)系，結(jié)果表明，PLIN4與PLIN5和PLIN1之間直接發(fā)生互作，并通過其他中間基因最終直接或間接作用于脂肪標(biāo)志基因LPL和FABP4；此外，PLIN2和PLIN3也可以通過LIPE、PNPLA2和ABHD5間接作用于脂肪生成相關(guān)基因，如圖5所示。

圖5 牛Perilipin蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

2.5 牛脂肪細(xì)胞油紅O染色及OD值檢測 對分化前后的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果顯示，分化完成后的脂肪細(xì)胞中脂滴聚集明顯多于分化前的細(xì)胞（圖6A），油紅O提取后檢測480 nm處的吸光度值，結(jié)果顯示，分化后的細(xì)胞中脂滴含量明顯高于分化前的細(xì)胞，兩組間差異顯著（圖6B），對細(xì)胞總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果能清晰看到28S、18S和5S 3條帶（圖6C）。

圖6 牛脂肪細(xì)胞油紅O染色（100×）、OD值檢測和細(xì)胞總RNA電泳

2.6 牛Perilipin時(shí)序表達(dá)譜構(gòu)建 qPCR檢測在牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式，如圖7所示。結(jié)果顯示，隨著脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程逐漸上升，在脂肪細(xì)胞分化的終末階段表達(dá)量達(dá)到峰值（圖7A）；在脂肪細(xì)胞分化的第2天達(dá)到最大，此后逐漸下降（圖7B）；隨著脂肪細(xì)胞的分化逐漸降低，在分化的第6天達(dá)到最小值，并且差異顯著（圖7C）；隨著脂肪細(xì)胞分化其表達(dá)量逐漸升高，在分化的第10天達(dá)到峰值（圖7D）總體趨勢與一致；呈上升的表達(dá)趨勢，并且在分化完成時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大（圖7E）。

圖7 牛Perilipin時(shí)序表達(dá)譜構(gòu)建

3 討 論

脂肪組織不僅在能量平衡的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，還是重要的內(nèi)分泌器官，脂肪組織主要分為白色脂肪組織（White Adipose Tissue,WAT）和棕色脂肪組織2種類型。WAT占體內(nèi)脂肪組織的絕大部分，主要以甘油三酯的形式儲存能量，并以游離脂肪酸的形式釋放能量。Perilipin定位在脂滴表面，對脂肪的生成和分解起重要作用。因此，本研究對Perilipin進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以犢牛腎周脂肪為實(shí)驗(yàn)材料，誘導(dǎo)分化后檢測Perilipin在牛脂肪細(xì)胞生成過程中的表達(dá)模式，以期為后續(xù)進(jìn)一步探究Perilipin在牛脂肪生成過程中的分子機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)對Perilipin進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，牛Perilipin蛋白與水牛和山羊之間的相似度最高，基因中，、、和定位在牛與水牛不同的染色體上，但是未發(fā)現(xiàn)在黃牛和水?；蚪M上的共線性關(guān)系，后續(xù)將繼續(xù)探究其原因，牛的Perilipin蛋白均含有Perilipin結(jié)構(gòu)域，研究顯示，Perilipin蛋白家族都參與了脂滴的形成，并且在不同條件下在脂滴功能中發(fā)揮了作用。對牛Perilipin蛋白的親疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Perilipin蛋白均呈現(xiàn)疏水性，有研究報(bào)道，Perilipin蛋白是脂滴相關(guān)蛋白，在哺乳動物中主要表達(dá)在脂肪及脂肪相關(guān)組織中。多數(shù)細(xì)胞有微小脂滴，表面有和，具有較大脂滴的專門貯脂細(xì)胞也表達(dá)了、和（或），、和通過控制脂肪酶和脂肪酶輔助因子進(jìn)入脂滴中的底物脂類途徑來調(diào)節(jié)脂解。此外，研究表明、和在脂滴形成過程中具有協(xié)同作用。對分化前后的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色發(fā)現(xiàn)，分化完成后的細(xì)胞中脂滴含量顯著高于分化前的細(xì)胞；qPCR結(jié)果顯示，、和隨著脂肪細(xì)胞的分化其表達(dá)量逐漸上升，并且在分化的終末階段達(dá)到峰值，本實(shí)驗(yàn)室先前的相關(guān)研究顯示，在牛脂肪細(xì)胞分化過程中依賴于的表達(dá)而表達(dá)，在基因啟動子區(qū)存在功能性的的特異性應(yīng)答元件。Li等研究表示的表達(dá)量在脂肪細(xì)胞分化的第6天達(dá)到最高，其核心啟動子區(qū)位于基因的-209/-17 bp區(qū)域，此外，還鑒定了和的結(jié)合位點(diǎn)是核心啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活子或抑制因子。缺乏時(shí)脂肪質(zhì)量降低并且促進(jìn)脂肪組織的炎癥反應(yīng)和脂解。在牛的研究中，過表達(dá)上調(diào)了及其靶基因和D的表達(dá)，抑制和的表達(dá)，從而增強(qiáng)脂肪酸和TAG的合成，抑制脂解。此外，PLIN4是否變異也跟體內(nèi)脂肪水平密切相關(guān)。PLIN4在細(xì)胞或體外生成的油滴表面形成了一層穩(wěn)定的蛋白質(zhì)層，并減小了脂滴大小，其通過極性/靜電相互作用形成了相鄰兩親性螺旋的穩(wěn)定排列。研究空腹PLIN5的水平和細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，大量的PLIN5提高了細(xì)胞儲存脂滴的能力。結(jié)合以上研究結(jié)果，PLIN1、PLIN4和PLIN5在脂肪細(xì)胞分化聚酯過程中起到了顯著的正調(diào)控作用；在脂肪細(xì)胞分化的第2天其表達(dá)量達(dá)到最大，隨后逐漸降低，與此結(jié)論一致的是，Li等研究報(bào)道，在秦川牛脂肪細(xì)胞分化的第2天表達(dá)量達(dá)到最大，并且與相互作用調(diào)控牛脂肪細(xì)胞的分化。隨著牛脂肪細(xì)胞的分化其表達(dá)量逐漸降低，在第6天時(shí)達(dá)到最小，有研究報(bào)道了主要靶向新生成的脂滴，并且在不與脂滴結(jié)合時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中保持穩(wěn)定，由此推測，主要在脂滴開始形成時(shí)起作用，之后其作用逐漸減弱。此外，對Perilipin各蛋白進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的結(jié)果也表明，直接作用于和并最終作用于脂肪生成的標(biāo)志基因，而PLIN3和PLIN2主要作用于PNPLA2和ABHD5等蛋白，研究顯示，PNPLA2和ABHD5能發(fā)生強(qiáng)烈的互作效應(yīng)，在棕色脂肪組織中，過表達(dá)能抑制PNPLA2/ATGL依賴性脂解并促進(jìn)甘油三酯的積累。根據(jù)以上分析及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測Perilipin蛋白家族成員在脂肪細(xì)胞分化的不同階段起作用，并且各蛋白成員之間的互作共同維持了脂肪細(xì)胞中脂滴的正常生成和降解。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，闡明了Perilipin蛋白家族成員在牛脂肪細(xì)胞表面的理化性質(zhì)和各蛋白之間的互作關(guān)系，并揭示了其在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式，據(jù)此說明在牛脂滴聚集的不同階段均發(fā)揮了作用，并且在牛脂肪生成的過程中具有雙向調(diào)控作用，目前為止，尚未有研究報(bào)道PLIN4和PLIN1、PLIN5之間作用的分子機(jī)制。基于此，探究Perilipin之間如何協(xié)調(diào)調(diào)控牛脂肪細(xì)胞中的聚脂過程將成為后續(xù)研究重點(diǎn)，也將成為進(jìn)一步挖掘Perilipin的分子機(jī)制并提高牛遺傳育種的關(guān)鍵一步。